ISOLASI DAN KARAKTERISASI BAKTERI AEROB PENDEGRADASI SELULOSA

DARI SERASAH DAUN RUMPUT GAJAH (Pennisetum purpureum Schaum)

Kurniawan Sarju Ambriyanto

Pembimbing :
Dr. rer. nat. Ir. Maya Shovitri, M.Si., Nengah Dwianita Kuswytasari S.Si., M.Si.
Jurusan Biologi
Fakultas Matematika Dan Ilmu Pengetahuan Alam
Institut Teknologi Sepuluh Nopember
Surabaya 2010

Abstrak

Selulosa adalah polimer yang tersusun dari rantai monomer glukosa melalui ikatan
β(1→4). Rumput gajah (Pennisetum purpureum Schaum) mengandung 22% selulosa. Penelitian ini
bertujuan untuk mengisolasi, purifikasi dan karakterisasi bakteri aerob pendegradasi serasah
selulosa dari daun rumput gajah dengan mengikuti kunci Determinasi Bergeys Manual. Pada
penelitian ini diperoleh 5 isolat yang cenderung masuk ke 3 Genus yaitu Flavobacterium (PP 127-
A dan PP 141-A), Lampropedia (PP 146-A), dan Halomonas (PP 79-D dan PP 91-A). Dari uji
Hidrolysis Capacity (HC) dan degradsi in vivo (penurunan berat kering) maka diketahui bahwa
isolat PP127-A adalah isolat yang memiliki ratio HC tertinggi dan penurunsn berat kering
terbanyak, kemudian diikuti oleh isolat bakteri yang lain.

Kata kunci : bakteri pendegradasi selulosa, rumput gajah

PENDAHULUAN per hektar berat kering pada daerah

1.1 Latar Belakang
Sellulosa adalah polimer karbohidrat
yang terbanyak yang terdapat di alam (Han
and Chen, 2007). Diperkirakan 50% dari
biomassa adalah selulosa. Dipekirakan
jumlahnya sekitar 50 milyar ton (Claassen, et
al. 1999). Polimer alami seperti selulosa
belum dimanfaatkan secara optimal,
sedangkan jumlahnya di alam melimpah.
Rumput gajah (Pennisetum
purpureum Schaum) adalah tanaman
yang dapat tumbuh di daerah dengan
minimal nutrisi. Rumput gajah
membutuhkan minimal atau tanpa
tambahan nutrient. Sehingga tanaman ini
dapat memperbaiki kondisi tanah yang
rusak akibat erosi. Tanaman ini juga
dapat hidup pada tanah kritis dimana
tanaman lain relatif tidak dapat tumbuh
dengan baik (Sanderson and Paul, 2008).
Produktifitas rumput gajah adalah 40 ton
beriklim subtropis dan 80 ton per hektar
pada daerah beriklim tropis (Woodard
and Prine, 1993). Total karbohidrat dan
serat kasar termasuk selulosa jumlahnya
masing-masing adalah 30,91% dan
9,09% ( Okaraonye and Ikewuchi, 2009).
Mikroorganisme memiliki peran
yang cukup besar dalam siklus berbagai
unsur seperti siklus karbon, nitrogen,
fosfor, belerang dan unsur yang lain.
Siklus selulosa merupakan bagian dari
siklus karbon (Schlegel, 1994), karena
selulosa adalah polimer terbanyak di
tanaman, maka hidrolisis selulosa adalah
hal yang sangat penting dalam siklus
karbon (Zhang and Lynd, 2004). Selulosa
yang dihasilkan oleh tanaman ada yang
mengalami degradasi oleh
mikroorganisme menjadi humus dan ada
yang didegradasi oleh hewan. Akhirnya
selulosa diubah menjadi CO2 dan masuk
ke jalur fiksasi CO2 (Brock, 1994).
Peran mikroorganisme menjadi
penting karena dapat menjaga
keseimbangan unsur-unsur yang ada di
alam (Schlegel, 1994). Bakteri selulotik
ditemukan di berbagai ekosistem.
Contoh bakteri selulotik adalah
Cellumonas sp, celvibrio sp.,
Microbispora bispora,
Thermomonospora sp., Acentivibrio
cellulolyticus, Bacteriodes cellulosolvent,
Bacteriodes succinogenes, Ruminococcus
albus, Ruminococcus flavefaciens dan
Clostridium termocellum . Enzim
selulosa dapat dihasilkan oleh berbagai
bakteri dan fungi, aerob dan anerob,
mesofil dan termofil. (Bhat and Bhat,
1997).
1.2 Rumusan Masalah
Rumput gajah sebagain besar
dimanfaatkan sebagian bahan makanan
ternak. Rumput gajah mempunyai potensi
untuk digunakan sebagai bahan baku
bioenergi. Untuk dapat digunakan sebagai
bahan baku bioenergi, polisakarida yang
terdapat pada rumput gajah harus dihidrolisis.
Untuk menghidrolisis polisakarida
diperlukan bantuan mikroorganisme.
Masalah yang ingin dikaji dalam penelitian
ini adalah apakah bakteri selulosa dapat
diisolasi dan dipurifikasi dari seresah rumput
gajah (Pennisetum purpureum Schaum)?
1.3 Batasan Masalah
Isolasi dan purifikasi dilakukan
secara aerobik sehingga bakteri
pendegradasi selulosa yang diharapkan
adalah bakteri aerob. Karakterisasi yang
dilakukan sampai tingkat genus dengan
menggunakan Bergeys Manual Of
Determinative Bacteriology 9th (Holt et
al., 1994).
1.4 Tujuan Penelitian
Tujuannya adalah untuk
mengisolasi, purifikasi dan mengkarakterisasi
bakteri aerob pendegradasi sellulosa dari
rumput gajah.
1.5 Manfaat
Manfaat dari penelitian ini adalah
untuk mendapatkan isolat murni dan
mengetahui seberapa besar bakteri tersebut
dapat mendegradasi selulosa.
TINJAUAN PUSTAKA
Tanaman menghasilkan biomassa
melalui proses fotosintesis (Hatami et al.,
2008). Bimassa tersusun secara unik yang
membedakan antara satu spesies dengan
spesies yang lain. Secara umum ada tiga
kelompok besar penyusun biomassa pada
tanaman yaitu selulosa, hemiselulosa dan
lignin. Ketiga kelompok senyawa ini
biasanya ditemukan secara bersama-sama
dengan perbandingan tertentu yang unik yang
didasarkan atas spesies, umur tanaman atau
bagian tanaman dan keadaan lingkungan
tempat tanaman itu hidup (Glazer and
Nikaido, 2007). Karena selulosa tidak
ditemukan dalam keadaan murni maka
komplek yang antara selulosa dengan
hemiselulosa dan lignin disebut dengan
cellulosan. Cellulosan relatif lebih larut
dibandingkan dengan selulosa (Hatami, et al.,
2008). Karena dalam keadaan alami tidaka
ada dari tiga senyawa itu yang berada dalam
keaadan murni, hal ini yang menyebabkan
proses degradasi biomassa menjadi lambat
(Varnaite et al., 2008)
Dinding sel merupakan sel jaringan
vaskuler pada tanaman tingkat tinggi (Glazer
and Nikaido, 2007).Dinding sel tanaman
adalah suatu struktur yang tersusun atas
selulosa, hemiselulosa dan subtrat pektin,
lignin dan protein struktural (Hatfield, 1993).
Struktur ini berkaitan antara polimer yang
satu dengan polimer yang lain dengan ikatan
kovalen cross-link,, sehingga memberikan
kekuatan fisik (Chesson and Forsberg, 1988
dalam Matsui et al, 1988; Glazer and
Nikaido, 2007). Selulosa, hemiselulosa dan
lignin yang kemudian membentuk apa yang
disebut dengan lignoselulosa. Berat
keringnya mencapai 90% dari sel tanaman.
Hemiselulosa dan lignin saling terikat
melalui ikatan ester pada residu arabinosa
dari hemiselulosa dengan p-coumaric acid
atau ferulic acid pada lignin. Ada banyak
perbedaan komposisi secara struktural
polisakarida terutama komposisi
hemiselulosa antara monokotil dan dikotil
(Chesson and Forsberg, 1988 dalam H.
Matsui et al, 1988). Arabinosa adalah
hemiselulosa yang terbanyak yang terdapat
pada dinding sel monokotil, sedangkan xylan
adalah hemiselulosa yang terbanyak pada
dikotil (Miron and Ben-Ghedalia, 1993
dalam H. Matsui et al, 1998).
Degredasi dari senyawa organik
komplek alami (hemiselulisa dan selulosa)
adalah masalah yang sangat penting.
Jumlahnya yang berlimpah di alam
mengakibatkan polimer ini menyimpan
sebagian besar energi hasil fotosintesis yang
disimpan dalam bentuk ikatan kimia. Ada
sekitar 60% energi yang diperoleh dari
fotosintesis berada dalam bentuk senyawa
hemiselulosa dan selulosa (Varnaite et al.,
2008)
Gambar 2.1 Struktur dinding sel tanaman
(http://www.astbury.leeds.ac.uk/history/astbu
ry18.htm)
2.1.1 Sellulosa
Selulosa adalah komponen
struktural yang banyak ditemukan pada
dinding sel tanaman terrestrial dan laut, juga
diproduksi oleh beberapa tanaman laut dan
bakteri. (Linder dan Teeri, 1997). Sellulosa
adalah polisakarida yang mempunyai fungsi
sebagai unsur struktural pada dinding sel
tumbuhan tingkat tinggi. Sellulosa berbentuk
serabut, liat, tidak larut di dalam air, dan
ditemukan terutama pada bagian berkayu
pada tumbuhan. Sellulosa adalah polisakarida
terbanyak yang ditemukan pada tanaman.
tanaman dan umur tanaman)
(Atalla, 1993 dalam Linder dan Teeri, 1997).
Diperkirakan bahwa jumlah karbon
terbanyak terdapat dalam bentuk selulosa dan
mayoritas terdapat di lingkungan teresrial
(Levin et al., 2009). Karena itu material
Sellulosa tersusun atas D-glukosa
yang terikat melalui ikatan β(1→4) (gambar
2.1a). Sellulosa adalah polimer yang tidak
bercabang yang terdiri dari 100-14.000
monosakarida atau lebih (Beguin and Aubert,
1994 : Lehninger, 1982). Ikatan β(1→4)
tidak dapat diputuskan oleh enzim α-amilase
(Lehninger, 1982). Molekul-molekul
sellulosa seluruhnya berbentuk linier, dimana
setiap molekul glukosa sebagai penyusun
polimer dapat berotasi hingga 180° (Brown,
1996) dan mempunyai kecenderungan kuat
membentuk ikatan-ikatan hydrogen intra dan
intermolekul. Ikatan antar fibril ini yuang
kemudian membentuk selulosa crystalline
(Brown et al., 1996). Jadi berkas-berkas
molekul sellulosa membentuk agregat
bersama-sama dalam bentuk mikrofibril.
Mikrofibril mimiliki dimensi antara 3-4 nm
pada tanaman tingkat tinggi hingga 20 nm
pada Valonia macrophysa, dimana setiap
mikrofibril terdiri dari beberapa rantai
selulosa. Mikrofibril ini memiliki oritentasi
yang sangat besar untuk tersusun secara
pararel (Beguin and Aubert, 1994).
Mikrofibril ini pada tempat-tempat tertentu
memiliki struktur yang teratur (crystalline)
(gambar 2.1b) dan pada tempat-tempat
tertentu memiliki struktur yang kurang
teratur (amorphous) (gambar 2.1b). Struktur
amorphous terjadi karena prose kristalisasi
yang tidak berlangsung sempurna pada
semua mikrofibril yang terbentuk (Hon, 1994
dalam Linder dan Teeri, 1997).
Mikrofibril membentuk fibril-fibril
dan akhirnya serat-serat sellulosa. Struktur
sellulosa yang berserat dan terdapat ikatan-
ikatan hidrogen yang kuat mengakibatkan
dapat tahan terhadap tarikan tinggi (Sjostrom,
1995 ; Beguin and Aubert, 1994). Jumlah
selulosa amorphous dan crystalline di alam
sama banyak. Selulosa terakumulasi di alam
karena relatif resisten di dalam proses
degradasi (proses degrdasi di alam berjalan
lambat). Dimensi serat selulosa dan proporsi
dari bagian kristalin dan amorphous sangat
tergantung kepada keadaannya alami (jenis
selulotik berbeda menunjukkan property
yang berbeda tergantung kepada sumber
yang digunakan dan metode ekstrasi yang
dilakukan, dan jumlah subtrat berbeda yang
digunakan dan jenis enzim selulotik yang
digunakan (Linder dan Teeri, 1997).
 Bentuk selulosa kristalin yang
sering ditemukan di alam adalah selulosa tipe
I, dimana termasuk metastabil (i.e. it is not
the most thermodynamically favorable form),
dimana secara alami tidak dapat diubah
menjadi selulosa kristalin tipe yang lain.
Selulosa tipe I dapat diubah menjadi selulosa
tipe II dengan treatment dengan
menggunakan alkali (Beguin and Aubert,
1994). Selulosa kristalin tipe II adalah
selulosa yang paling stabil yang diketahui.
Selulosa tipe I mempunyai ikatan glukosida
paralel dan mempunyai ikatan hidrogen
intramolekul yang kuat. Di alam ada dua tipe
selulosa tipe I sebagai selulosa kristalin
Gambar (2.2a) struktur serat selulosa, (2.2b)
struktur selulosa teratur (kristalin) dan
kurang teratur (amorphous) (Beguin and
Aubert, 1994).
Berdasarkan pada sumber alami
selulosa dan pretreatment yang dilakukan
maka ratio kristalisasi dari selulosa berkisar
antara 0% pada selulosa amorphous hingga
mendekati 100% pada selulosa yang diisolasi
dari Valonia macrophysa (Beguin and
Aubert, 1994). Sellulosa adalah polimer
karbohidrat yang terbanyak yang terdapat di
alam (Han and Chen, 2007). Diperkirakan
50% dari biomassa adalah selulosa.
Diperkirakan jumlahnya sekitar 50 milyar ton
(Claassen, et al. 1999). Dari limbah padat
yang dihasilkan dunia 40 % (w/w) adalah
salah satu sumber sellulosa. Penelitian
difokuskan bagaimana memanfaatkan limbah
organik (terutama sellulosa) menjadi energi.
Penelitian-penelitian yang dilakukan di
seluruh dunia tentang konversi selulosa
suballomorphs yaitu tipe Iα dan Iβ.
Perbedaan atara tipe Iα dan Iβ terletak pada
perbedaan ikatan hidrogen antar rantai
selulosa, proporsi ikatan hidrogen dan
tergantung kepada sumbernya di alam
(Beguin and Aubert, 1994).Selulosa tipe II
jarang ditemukan di alam, secara umum
dapat dikatakan bahwa sebagai hasil
represifitasi setelah proses swelling dan
pelarutan kembali selulosa tipe I. selain
selulosa tipe I dan II juga terdapat selulosa
tipe III dan IV yang sangat jarang ditemukan
di alam (Brown et al, 1996). Selain tanaman
bakteri juga menghasilkan selulosa.
menjadi energi dapat dikembangkan menjadi
sektor komersial (Walker and Wilson, 1991).
Secara umum biomassa berbasiskan
selulosa yang digunakan dalam produksi
etanol dapat dibagi menjadi enam kelompok
yaitu :
1. Residu atau limbah pertanian. Contoh:
cane bagase, corn stover, wheat straw,
rice straw, rice hulls, barley straw,
sweet sorgum bagase, olive stone and
pulp.
2. Kayu keras. Contohnya: aspen dan
poplar.
3. Kayu lunak. Contohnya: pine dan
spruce.
4. Limbah selulosa. Contohnya: kertas
bekas, koran.
5. Biomassa herba. Contohnya: alfalfa hay,
switchgrass, reed canary grass, coastal
Bermuda grass, thimoty grass.
6. Municipal solid waste (MSM) (Sun and
Cheng, 2002).
Konversi selulosa menjadi glukosa
relatif membutuhkan biaya yang lebih besar
dibandingkan dengan konversi pati. Hal ini
disebatkan karena struktur sekulosa lebih
komplek dibadingkan dengan struktur pati,
sehingga dibutuhkan beberapa enzim untuk
dapat mendegradasi selulosa. Selain itu
enzim pendegradasi selulosa membutuhkan
membutuhkan medium yang mengandung
selulosa murni untuk mengoktimalkan
produksi enzim. Selain itu diketahui bahwa
selulosa memiliki struktur yang beragam baik
dilihat dari tingkat struktural atau
supramelekulnya. Untuk meminimalkan
biaya produksi diperlukan pengembangan
metode konversi sellulosa menjadi glukosa.
Salah satu bidang yang sering dijadikan studi
dalam konversi sellulosa adalah mencari
mikroorganisme yang dapat menghasilkan
enzim yang lebih aktif dan efisien dalam
mengkonversi selulosa (Walker and Wilson,
1991). Hal ini disebabkan karena adanya
keanekaragaman yang besar pada selulosa
yang terdapat di alam, sehingga ditemukan
banyak enzim selulase yang ditemukan. Hal
ini berkaitan dengan kecocokan antara
struktur substrat dengan struktur enzim
(Beguin and Aubert, 1994).
Setiap molekul selulosa
mengandung tiga tipe unit glukosa yaitu
glukosa dengan ujung yang tereduksi
(reducing end), glukosa yang ujungnya tidak
tereduksi (nonreducing end) dan
anhydroglucopyranose.. Unit monomer
anhydroglucopyranose adalah molekul
selulosa yang mengandung 3 gugus hidroksil
primer dan dua gugus hidroksil sekunder.
Monomer nonreducing end mengandung
empat gugus hidroksil dan monomer
reducing end mengandung gugus hemiacetal
pada penambahan tiga gugus hidriksil
(Palonen, 2004).
2.1.2 Lignin
Lignin adalah material organik
penyusun matrik dinding sel tanaman tingkat
tinggi (Spermatophyta), predominan pada
jaringan pengangkut (Glazer and Nikaido,
2007). Lignin adalah termasuk penyusun
sebagian besar biomassa atau yang lebih
dikenal dengan lignoselulosa. Lignin adalah
polimer aromatik terbanyak di bumi dan
merupakan penyebab utama degradasi
lignoselulosa menjadi lambat (Ahmed et al.,
2001). Struktur lignin tidak seragam, lignin
juga terdapat bagian yang crystalline dan
amorphous. Lignin pada tanaman tingkat
tinggi tidak berbentuk crystalline (Palonen,
2004). Struktur kimia pada lignin yang
terdapat di alam dapat berubah pada kondisi
suhu tinggi dan asam, seperti saat dilakukan
perlakuan dengan menggunakan uap air.
Pada saat dilakukan perlakuan dengan
menggunakan suhu di atas 200°C, maka
lignin akan mengalami degradasi menjadi
senyawa partikel dengan ukuran yang kecil
dan lepasnya ikatan dengan selulosa
(Tanahashi et al., 1983 dalam Palonen,
2004).
Untuk mempermudah dalam
mendegradasi lignoselulosa maka diperlukan
delignifikasi. Delegnifikasi adalah suatu
proses dalam menghilangkan lignin yang
dilakukan dengan menggunakan bahan kimia
(Ahmed et al., 2001). Namun kerena sudah
ditemukan mikroorganisme yang dapat
mendegradasi lignin dengan cepat dan telah
disadari bahwa menggunakan bahan kimia
dalam proses penghilangan lignin akan
mengakibatkan limbah yang sangat
berbahaya bagi lingkungan (Glazer and
Nikaido, 2007). Lignin tersusun oleh unit
yang disebut dengan lignol, yang terdiri dari
aryl propanol yang tersusun pada senyawa
aromatik dan tiga karbon rantai karbon.
Lignol secara struktural sangat berhubungan
dengan asam amino phenylalanine dan
tyrosin. Lignol adalah derivat dari asam
amino phenylalanine dan tyrosin. Lignin
lebih bersifat hidrofobik dibandingkan
dengan selulosa dan hemiselulosa (Ahmed et
al., 2001).
2.1.3 Hemiselulosa
Hemiselulosa secara umum
diklasifikasikan berdasarkan residu gula pada
backbone. Hemiselulosa dapat
dikelompokkan menjadi xylan, mannans,
galactans dan glucans. Hemiselulosa
seringkali dilaporkan memiliki hubungan
secara kimia atau cross-linked dengan
polisakarida , protein atau lignin. Xylan
memiliki merupakan senyawa yang
mempunyai hubungan terbanyak dengan
polisakarida yang lain. Hemiselulosa lebih
larut dibandingkan dengan selulosa, dapat
diisolasi dengan melakukan ekstraksi dengan
menggunakan alkali (Palonen, 2004),
Softwood hemisellulosa mengandung
glucomannan, galactoglucomannan,
glucuronoxylan, dan arabinoglucunoxylan
sedangkan pada hardwood hemiselulosa
sebagian besar merupakan glucuronoxylan.
Gambar di bawah ini adalah menjelaskan
struktur dari hemiselulosa (Glazer and
Nikaido, 2007).
Hemiselulosa adalah material yang
berbeda dengan selulosa. Hemiselulosa
adalah molekul bercabang yang hanya
memiliki 150-200 monomer (Mulcahy,
1996). Hemiselulosa adalah polimer yang
mirip dengan selulosa. Backbone (rangka
utama) dari hemiselulosa adalah terbentuk
dari ikatan β 1,4-D-pyranosyl dari unit
penyususnnya. Jadi hemiselulosa secara
struktural homologenus dengan selulosa.
Dimana selulosa adalah polimer homolinear
dengan sedikit modifikasi antara molekul
yang satu dengan yang lain. Hemiselulosa
mempunyai banyak cabang, secara umum
dapat dikatakan bahwa hemiseluloasa
merupakan polimer noncrystalline
heteropolysaccharides. Komponen yang
menyusun hemiselulosa adalah gula pentosa (
D-xylose, L-arabinose ), gula hekosa ( D-
galactose, L-galactose, D-mannose, L-
rhamnose, L-fucose ) dan asam uronik (L-
glucomonic acid ) (Glazer and Nikaido,
2007).
Hemiselulosa adalah polimer
polisakarida yang komplek, komposisi dan
frekuensinya tergantung kepada jenis
jaringan tanaman, jenis spesies dan tahapan
pertumbuhan pada tanaman. Hemiselulosa
juga merupakan penyusun utama dinding sel
tanaman. Hemiselulosa ditemukan dengan
proporsi yang berbeda-beda pada lemela
tengah, dan dinding sel sekunder tanaman.
Hemiselulosa tidak hanya ditemukan berupa
xylan, namun juga ditemukan dalam jumlah
yang banyak berupa glucomannans,
galactomannans, arabinogalactans dan
senyawa yang lain (Mulcahy, 1996).
Kerena secara struktural
hemiselulosa dan selulosa homologenus
ditambah dengan adanya kemiripan nama,
maka seringkali hemiselulosa diangggap
sebagai produk intermediet dalam biosintesis
dari selulosa. Namun sekarang jalur
biosintesis dari hemiselulosa telah diketahui.
Dan diketahui bahwa jalur biosintesis
hemiselulosa berbeda dengan selulosa. Dan
juga telah diketahui bahwa penyusun
hemiselulosa berbeda dengan selulosa
(Mulcahy, 1996).
2.2 Metode Menghitung Kadar Selulosa
Berikut ini adalah metode untuk
mengukur kandungan selulosa dan lignin
berdasarkan metode Chesson yang
dikemukakan oleh Datta (1981):
1. Satu g sampel kering (berat a)
ditambahkan 150 mL H2O atau alkohol-
benzene dan direfluk pada suhu 100°C
dengan water bath selama 1 jam.
2. Hasilnya disaring, residu dicuci dengan
air panas 300 mL.
3. Residu kemudian dikeringkan dengan
oven sampai beratnya konstan dan
kemudian ditimbang (berat b).
4. Residu ditambah 150 mL H2SO4 1 N,
kemudian direfluk dengan water bath
selama 1 jam pada suhu 100°C.
5. Hasilnya disaring dan dicuci sampai
netral (300 mL) dan residunya
dikeringkan hingga beratnya konstan.
Berat ditimbang (berat c).
6. Residu kering ditambahkan 100 mL
H2SO4 72% dan direndam pada suhu
kamar selama 4 jam.
7. Ditambahkan 150 mL H2SO4 1 N dan
direfluk pada suhu 100oC dengan water
bath selama 1 jam pada pendingin balik.
8. Residu disaring dan dicuci dengan H2O
sampai netral (400 mL).
9. Residu kemudian dipanaskan dengan
oven dengan suhu 105oC sampai
beratnya konstant dan ditimbang (berat
d).
10. Selanjutnya residu diabukan dan
ditimbang (berat e)
Perhitungan kadar selulosa dan kadar lignin
menggunakan rumus berikut ini:
Kadar selulosa = (c-d)/a x 100%
Kadar lignin = (d-e)/a x 100%
http://www.biomassmagazine.com/images/up
load/20080403103622.jpg
2.3 Degradasi Biomassa
Dalam mendegradasi biomassa
melalui mekanisme biologis, dalam hal ini
konteknya adalah mendegradasi biomassa
dengan bantuan mikroorganisme. Degradasi
melalui enzimatis menjadi sesuatu yang
sangat penting. Enzim menjadi alat yang
sangat penting dalam proses degradasi, hal
ini terjadi karena enzim dapat mengkatalisis
reaksi pada kondisi yang normal (Ahmed et
al., 2001).
Laju degradasi juga dipengaruhi
oleh keadaan lingkungan pada saat proses
degradasi. Faktor-faktor yang mempengaruhi
antara lain adalah kandungan zat yang
dibutuhkan oleh mikroorganisme terutama
yang esensial yang digunakan baik pada saat
pertumbuhan mikroorganisme atau
pembentukan enzim. Faktor lain yang
mempengaruhi adalah pH dan suhu optimum
yang mempengaruhi pertumbuhan
mikroorganisme dan aktifitas enzim selulase.
Adanya produk metabolit baik primer atau
sekunder yang dapat mempengaruhi kerja
enzim dalam mendegradasi selulosa. Adanya
selobiosa dalam jumlah banyak juga
mempengruhi kerja enzim. Hal ini karena
selobiosa adalah inhibitor terkuat dalam
proses degradasi (Ahmed et al., 2001).
2.3.1 Degradasi Selulosa
Pada degradasi material
lignoselulosa dengan kadar selulosa yang
tinggi sehingga bisa dikatakan selulosa murni
(dihasilkan oleh tanaman kapuk), dengan
kadar lignin yang sangat sedikit saja proses
degradasi tidak dapat dilakukan dengan
memasukkan selulosa ke dalam sel
mikroorganisme. Hal ini terjadi kerena
ukuran selulosa yang cukup besar. Sehingga
strategi yang dilakukan oleh mikroorganisme
adalah dengan mengsekresikan enzim
selulase. Hal ini dapat dilihat ketika
melakukan isolasi protein yang terdapat pada
tanah dan proses pengomposan, enzim
selulase adalah komponen utama dari protein
yang ditemukan (Ahmed et al., 2001).
Untuk mengopimalkan
metabolisme bakteri pendegradasi selulosa
pada keadaan minimal nutrient, setiap bakteri
mempunyai strategi yang berbeda-beda
tergantung pada karakteristik bakteri tersebut
(Jescu, 1995). Besar hasil akhir yang
diperoleh pada proses degradasi tergantung
kepada beberapa faktor yaitu pH, akses
terhadap karbon (kecocokan konformasi
enzim dengan subtrat), reaksi redok yang
terjadi, konsentrasi produk. Dan untuk
mengoktimalkan hasil yang diperoleh maka
diperlukan pengetahun tentang genetika
mikroorganisme yang digunakan, enzimatik,
dan termodinamika dalam mekanisme aliran
karbon (carbon flow). Detail pengetahuan
mengenai hubungan antara genome content,
gen dan produk ekpresi gen, pathway
utilization, dan hasil akhir yang diperoleh
akan sangat penting untuk diketahui dalam
degradasi selulosa (Levin et al, 2009).
Karena selulosa di alam yang bersifat
berukuran besar dan tidak larut maka enzim
selulase memerlukan perlakuan yang khusus
dalam mendegradsi selulosa. Karena substrat
yang tidak dapat terdifusi ke dalam enzim,
maka enzim selulase harus menjadi lebih
aktif dan mendefusi ke dalam substrat
(Mattinen, 1998).
Bakteri selulotik dapat bekerja pada
variasi keadaan lingkungan yang berbeda-
beda dalam mendegradasi seresah daun pada
tanah (Beguin and Aubert, 1994; Denman et
al., 1996 dalam Linder dan Teeri, 1997).
Mikroba ini dapat mendegradasi melekul
komplek, keadaan dimana subtrat tidak larut
dalam air dengan menggunakan berbagai
enzim melalui berbagai cara didalam
memutuskan bagian yang berbeda di dalam
substrat. Efisiensi degradasi kayu dengan
menggunakan mikorganisme sepeti fungi
filamentus, merupakan tipe yang
mengsekresikan dan mengsinergikan aksi
enzim selulase dimana bakteri menggunakan
komplek enzim (cellulosome) yang bekerja
pada permukaan substrat (Tomme et al.,
1995; Bayer et al., 1996 dalam Linder dan
Teeri, 1997). Hal ini juga terjadi pada fungi
anaerob dimana memiliki komplek seperti
cellulosome dengan ukuran yang lebih besar
(Fanutti et al., 1995; Denman et al., 1996;
Dijkerman et al., 1996 dalam Linder dan
Teeri, 1997). Kedua tipe enzim dapat
melepaskan ikatan β-1,4-glukosida dengan
menggunakan enzim endo atau exoglukonase
yang spesifik yang didasarkan atas topologi
dari sisi aktif. Keberadaan nitrogen sangat
mempengaruhi laju degradasi yang terjadi.
Umumnya degradasi selulosa terjadi pada pH
normal (Hatami et al., 2008).
Pada degradasi selulosa yang
dilakukan oleh fungi, fungi melepaskan
sistem enzim selulase yang terdiri dari
beberapa exo- dan endoselulase, dan satu
atau dua β-glukosidase. Banyaknya
komponen sistem enzim yang dilepaskan
tergantung kepada fungi itu sendiri. Hal ini
seperti yang ditunjukkan oleh Trichoderma
reesei yang melepaskan enzim komplit saat
mendegradasi crystalline selulosa. Sistem
enzim selulotik mengandung dua
cellobiohydrolases (CBH I dan CBH II),
setidaknya empat endoglukanase (EG I, EG
II, EG III dan EG IV) dan satu β-glukosidase
(Mattinen, 1998).
Sistem enzim selulase adalah lebih
sulit dibandingkan dengan sistem enzim
selulase fungi dan hanya sedikit yang baru
diketahui dari sistem enzim selulase bakteri.
Enzim selulase yang dihasilkan oleh
Cellulomonas fimi adalah yang paling sering
dilakukan studi. Beberapa bekteri terutama
bakteri anaerob menghasilkan komplek multi
enzim yang berukuran besar yang dikenal
dengan cellulosome. Contoh bakteri yang
memiliki cellulosome adalah Clostridium
thermocellum (Mattinen, 1998).
Pada degradasi selulosa murni laju
degradasi terjadi penurunan yang sangat
besar. Penurunan ini disebabkan kerena
adanya inhibitor yang sangat banyak jika
dibandingkan pada degradasi lignoselulosa.
Selobiosa adalah inhibitor utama dalam
degradasi selulosa, oleh karena itu kehadiran
enzim β-glukosidase menjadi sangat penting
dalam degradasi selulosa. Hal ini karena
setelah selobiosa diubah menjadi glulosa
Tabel 2.1 Struktural selulosa yang berpotensi
menghambat pada hidrolisis dari serat
selulosa pada beberapa level struktural
(Mansfields et al., 1999 dalam Palonen,
2004)
Level struktur Faktor substrat
Degree of polymerization
(DP)
Microfibril Crystallinity
Cellulose lattice structure (I,
II, III, atau IV)
Komposisi struktural
(kandungan lignin,
hemiselulosa dan
Fibril
persebarannya)
Particle size (fibril
dimension )
Luas permukaan
Fiber Degree of fibrer swelling
Struktur pori dan distribusi
Akses enzim selulase terhadap
selulosa pada lignoselulosa menjadi yang
penting dalam degradasi selulosa. Selulosa
memiliki akses baik eksternal (dipengaruhi
oleh bentuk dan ukuran paticle) dan internal
(struktur kapiler pada fibers). Pada
lignoselulosa yang tidak dilakukan
pretreatment hanya sedikit pori yang dapat
digunakan sebagai akses enzim selulase
terhadap sustrat (Palonen, 2004). Pada
pretreatment yang dilakuan untuk
menghilangkan hemiselulosa menunjukan
terjadi peningkatan pori dan terdapat
permukaan spesifik. Hasil hidrolisis
berkaitan dengan volume pori yang
digunakan dalam akses enzim selulase
(Grethlein, 1985 dalam Palonen, 2004). Pada
beberapa penelitian diketahui bahwa
pengeringan lignoselulosa menurunkan
maka laju degradasi menjadi jauh lebih cepat.
Hasil akhir pada degradasi lignoselulosa
tergantung kepada tipe bahan mentah yang
digunakan. Pada berbagai penelitian yang
dilakukan secra intensif dilakukan maka
diketahui bahwa tidak ada faktor yang paling
signifikan pada laju hidrolisis pada material
lignoselulosa yang berbeda. Secara umum
dapat dikatakan bahwa faktor pembatas
degradasi selulosa dapat dikelompokkan
menjadi dua yaitu struktur dari substrat
(Tabel 2.1), dan mekanisme dan interkasi
enzim selulase.
kapileritas sel dan menurunkan pori sehingga
menurunkan efektifitas enzim selulase
(Esteghlalian et al., 2001 dalam Palonen,
2004). Kandungan lignin dalam lignoselulosa
dan persebarannya mempengaruhi degradasi
selulosa (Palonen, 2004)
Kemampuan degradasi selulosa
oleh bakteri berbeda dengan kemampuan
degradasi fungi dalam mendegradasi
selulosa. Bakteri memiliki kecenderungan
untuk mendegradasi selulosa crystalline
dibandingkan dengan sisi a amorphous, dan
kemampuan ini dimiliki oleh hampir semua
bakteri pendegradasi selulosa baik secara
aerob atau anaerob. Namun karena selulosa
crystalline tidak dapat didegradasi oleh
enzim selulase tunggal karena sifat selulosa
crystalline yang rigrid, maka diduga
degradasi selulosa crystalline dilakukan lebih
dari satu enzim (Mulcahy, 1996). Sedangkan
fungi memiliki kecenderungan untuk
mendegrdasi selulosa pada sisi amorphous
dibandingkan dengan sisi crystalline.
Ektrasellular endo- dan exoglucanase
diproduksi oleh berbagai bakteri. Secara
umum struktur enzim selulase bakteri
memiliki kesamaaan dengan yang dhasilkan
fungi. Bakteri mensekresikan enzim selulase
sebagai enzim ekstraselluler yang bersifat
soluble atau pada keadaan anaerobik
membentuk komplek yang disebut dengan
cellulosome yang menempel dengan
permukaan sel bakteri . Cellulosome
nampaknya mampu mendegradasi tidak
hanya selulosa saja, namun semua jenis
polisakarida termasuk berbagai jenis
hemisellulosa seperti xylanases, mannanases,
arabinofuranosides, and pectin lyases
(Glazer and Nikaido, 2007).
2.3.2 Degradasi Lignin
Bakteri hanya dapat sedikit
mengdegradasi lignin saat terdapat oksigen
dan tidak ada satu pun bakteri yang dapat
mendegradasi lignin dalam keadaan anaerob
(Glazer and Nikaido, 2007). Degradasi lignin
memerlukan adanya oksigen. Degradasi
lignin adalah proses yang sederhana namun
tidak terjadi pada pada beberapa lingkungan
alami. Sebagai contoh bahwa tanaman yang
telah mati ratusan tahun yang lalu masih
sering ditemukan dalam timbunan tanah. Hal
ini utamanya terjadi karena tidak terdapat
oksigen. Pada lingkungan dengan keadaan
asam maka proses degradasi tidak terjadi.
Belum diketahui bahwa jika pH lingkungan
sedikit asam dan keaadaannya anaerobik
apakah proses degradasi akan terjadi, namun
diduga bahwa degradasi jika terjadi akan
berlangsung sangat lama (Kirk and Farrell,
1987 dalam Ahamed et al., 2001).
Degradasi lignin mungkin saja
terjadi dan dilakukan oleh bakteri, namun
tidak ada satupun yang dapat diisolasi dan
ditumbuhkan pada laboratorium. Banyak
filamentous bakteri (Actinomycetes) dapat
mendegradasi lignin. Actinomycetes tidak
dapat mengubah lignin menjadi CO2, tidak
dapat melakukan mineralisasi terhadap
lignin. Hanya Basidiomycetes (white rot
fungi) yang dapat melakukan meniralisasi
terhadap lignin. Pada saat terjadi mineralisasi
terhadap lignin yang terdapat pada kayu atau
daun maka terjadi bleaching (perubahan
warna menjadi putih pucat) (Ahamed et al.,
2001).
Degradasi lignin hanya dapat
dilakukan oleh white rot fungus. Kemampuan
fungi ini untuk mendegradasi lignin adalah
cukup besar. Hal ini dapat dilihat pada
kemampuan Phanerochaete chrysospirum
hingga 3 gram lignin setiap hari. Degradasi
ini terjadi optimum pada suhu 40°C dengan
triggernya adalah pembatasan nitrogen.
Proses degradasi ini dilakukan dengan
melepaskan lignin peroxidase. Selain itu P.
chrysosporium juga dapat mendegradasi
lignin dengan melepaskan manganese-
dependent peroxidase. Sampai saat ini dapat
diisolasi 10 isoenzim dari lignin peroxidase
dan lima manganese-dependent peroxidase.
Jadi ini bisa memberikan bukti bahwa ada
keragaman biokimia yang memungkinkan
adanya keberagaman kondisi optimum
tumbuh dengan berbagai kondisi lingkungan
seperti temperature, pH, dan kekuatan ionik.
Enzim ini mirip tetapi tidak identik dimana
tiap enzim dapat mendegradasi suatu struktur
polimer yang berbeda dalam satu tanaman,
dimana hal ini tergantung kepada struktur
kimia, keadaan fisik atau akses (Glazer and
Nikaido, 2007).
Degradasi lignin memerlukan
hidrogenperoksidase. Hidrogen peroksidase
diproduksi oleh white rot fungus dan
disekresikan untuk mengaktifkan lignin
peroxidase dan manganese-dependent
peroxidase dalam proses mendegradasi
lignin. Pada proses degradasi melalui lignin
peroksidase diperlukan kondisi asam untuk
menciptakan kondisi yang optimum pada
proses degradasi dengan menggunakan reaksi
oksidasi. Lignin peroksidase mengkatalisis
pembukaan ikatan pada sisi arylpropane,
ikatan pada ether, pembukaan ikatan siklik
aromatik dan hydroxylation. Kesuksesan
degradasi lignin tergantung kepada
penyerangan komponen nonfenol dan
fenollignin. Ektraselluler Mn (II)-dependent
peroxidase dalam mengoksidasi komponen
fenol lignin. Fenol lignin tidak dapat
didegradsi oleh lignin peroxsidase, seperti
veratryl alcohol, atau model nonfenol yang
merupakan subtruktur dari lignin. Mn (II)-
dependent peroxidase dan H2O2 diperlukan
untuk mengaktifkan isoenzim yang
digunakan dalam degradasi lignin. Quinon
merupakan produk yang dihasilkan dari
proses degradasi melalui peroksidase.
Sehingga diperlukan adanya quinon
reduktase baik intraselluler dan extraselluler.
Ektraselluler cellobiosa-quinon
oksidureduktase hanya akan aktif jika
terdapat selulosa. Enzim ini menggunakan
cellobiosa sebagai donor hydrogen untuk
mereduksi quinon menjadi hidroquinon.
Intraselluler quinon reduktase menggunakan
NAD(P)H sebagai kofaktor. Fungi dapat
menggunakan hidroquinon dalam
metabolismenya. Jadi dapat dikatakan bahwa
fungsi dari quinon reduktase adalah
mengubah produk dari degradasi lignin
sehingga dapat digunakan dalam
repolimerasi.Berikut merupakan skema
proses degradasi lignin (Glazer and Nikaido,
2007).
 Lignifikasi dan struktur selulosa
yang tersusun dengan baik pada polisakarida,
termasuk kristalisasi pada selulosa yang
terdapat pada dinding sel tanaman
mengakibatkan proses degradassi menjadi
terhambat (Chesson and Fosberg, 1988
dalam Matsui et al., 1998). Lignifikasi
adalah proses yang mana penambahan
melekul lignin memenuhi ruang kosong pada
fibril selulosa dan hemiselulosa serta
membentuk ikatan diantaranya pada dinding
sel (Glazer and Nikaido, 2007). Pada
penelitian yang dilakukan oleh Benoit et al.,
(1992), diketahui bahwa bakteri yang mampu
mendegradasi berbagai macam jenis selulosa
murni (sumber selulosa) termasuk selulosa
dengan tingkat kristalisasi yang tinggi (high
cristalin) hingga 60-80% hanya dapat
mendegradasi lignoselulosa seperti koran
sebesar 15% dan majalah sebesar 35 %. Pada
penelitian yang dilakukan oleh Sharma and
Hobson (1986) dalam Cailliez et al., (1993)
diketahui bahwa proses degradasi
lignoselulosa lebih tergantung kepada
kandungan lignin yang terdapat pada material
selulotik tersebut dibandingkan dengan
kristalitas suatu material selulotik.
Softwood mengandung lignin yang
lebih banyak dibandingkan dengan
hardwood. Hemiselulosa tertinggi terdapat
pada rumput-rumputan. Perbandingan
kandungan dari selulosa, lignin dan
hemiselulosa pada softwood, hardwood dan
rumput terdapat pada Tabel 2.2. Karena
kadar hemiselulosa yang besar maka proses
degradasi selulosa pada rumput-rumputan
relatif menjadi lebih sulit.
Tabel 2.2 Persentase perbandingan lignoselulosa
(Glazer and Nikaido, 2007)
Jenis
Lignin Selulosa Hemiselulosa
tanaman
Rumput-
10-30 25-40 25-50
rumputan
Softwood 25-35 45-50 25-35
Hardwood 18-25 45-55 24-50
2.3.3 Degradasi Hemiselulosa
Seperti selulosa, hemiselulosa juga
merupaka bagian dari penyusun sebagian
besar biomassa dan juga diperlukan enzim
hidrolitik untuk memutuskan ikatan. Namun
diperlukan 24 enzim untuk mendegradasi
seluruh hemiselulosa (Srinivasan, 1992).
Namun enzim yang paling dikenal adalah
xylanase yang terdiri dari endoxylanases
(1,4-β-D-xylan xylanohydrolases, EC
3.2.1.8) dan xylosidases yang merupakan
enzim pendegradasi xylan (senyawa
hemiselulosa yang terbanyak) (Moracci et
al., 2000). Selain enzim pendegradasi xylan
adalah enzim yang juga penting dalam
degradasi hemiselulosa adalah
endomannanases (1,4-β-D-mannan
mannanohydrolase, EC 3.2.1.78) yang
mendegradasi glucomannan. Enzim yang
digunakan dalam mendegradasi oligomer
berantai pendek yang dihasilkan oleh enzim
endo pada degradasi hemiselulosa adalah β-
xylosidase (1,4-β-D-xyloside xylohydrolase
EC 3.2.1.37), β-mannoside (1,4-β-D-
manoside mannohydrolase EC 3.1.1.25) dan
β-glukosidase (EC 3.2.21), enzim ini akan
memutuskan ikatan oligosakarida pada sisi β
pada xylan dan mannans. Sedangkan untuk
ikatan α pada sisi α oligomer maka ikatan
akan diputus dengan menggunakn enzim
diantaranya adalah α-glucoronidase (EC
3.2.1.139), α-arabinosidase (α-L-
arabinofuranoside arabinofuranohydrolase,
EC 3.2.1.55) dan α-D-galactosidase (α-D-
galactoside galactohydrolase, EC 3.2.1.22).
Gugus acetyl pada hemiselulase akan
dipindahkan melalui enzim esterase (EC
3.1.1.72) (Palonen, 2004)..
Degradasi hemiselulosa adalah
proses yang komplek karena tipe enzim yang
dihasilkan adalah multiple isoenzymes
(enzim yang mempunyai fungsi katalitik
yang sama namun memiliki lebih dari satu
karakteristik physical yang membendakan
antara komponen yang satu dengan
komponen yang lain seperti pH optimum),
beberapa mempunyai Cellulose Binding
Domain (CBD), beberapa menghasilkan
multi domain protein yang salah satu
domainya dapat mendegradasi selulosa.
Produksi enzim xylanase lebih dipengaruhi
oleh adanya selulosa dibandingkan dengan
xylan. Penjelasan mengenai hal ini belum
diketahui sampai saat ini (Ahmed et al.,
2001).
Dalam menghidrolisis hemiselulosa
diperlukan sinergi dari banyak untuk
memutuskan ikatan glikosida pada poly- atau
oligosakarida. Tiap-tiap enzim akan bekerja
secara spesifik memustuskan ikatan kimia
dalam mendegradasi hemiselulosa Cazemier
et al., (1997) dalam Zverlova et al. (2003)
enzim pendegradasi lignin tidak ditemukan
dalam keadaan anaerob Guo et al., (2001)
dalam Zverlova et al. (2003).
2.4 Derivat Selulosa
Selulosa memiliki banyak derivat
yang dimanfaatkan di berbagai bidang
kehidupan. Derivat selulosa dilakukan
dengan melakukan modifikasi selulosa murni
yang diisolasi. Derivat selulos yang sering
digunakan dalam isolasi bakteri pendegradasi
selulosa adalah Hydroxyethylcellulose (HE
cellulose) dan Carboxymethylcellulose
(CMC) (Klemm et al., 1998).
Carboxymethylation polisakarida adalah
suatu bidang penelitian yang diminati dan
banyak dilakukan. Hal ini kerena metode ini
adalah metode yang mudah dilakukan dan
hasil yang diperoleh banyak digunakan untuk
berbagai bidang kehidupan. Secara umum
dapat dikatakan bahwa metode yang
Tabel 2.3 Pembagian CMC berdasarkan kualitas dan pemanfaatannya (Heinze, 2005)
Kelompok kualitas
Contoh penggunaan
dari CMC
Ditergents, mining
Technical
flotation
Oil and gas drilling
Semi-purifed
muds
Paper coating, textile
sizing and printing,
Purired
ceramic glazing, oil
drilling muds
Food, toothpate,
Extra purified
pharmaceuticals
Pada CMC ada 2 istilah yang sering
digunakan yaitu Degree of Polimeritation
(DP) dan Degree of Substitution (DS). DP
menunjukkan seberapa panjang atau berapa
monomer penyusun suatu rantai CMC.
Sedangkan DS menunjukkan seberapa
banyak gugus hidroksi pada selulosa yang
diganti dengan gugus lainya setiap 100 AGU
(anhydroglucopyranose unit(s)), range dari
DS adalah 0-3. Semakin rendah DS maka
akan semakin mudah mikroorganisme
mendegradasi CMC tersebut. Sehingga
semakin tinggi DS maka aktifitas enzim
hidrolisis seperti enzim selulase akan
menunjukkan hasil yang semakin rendah. Hal
ini karena semakin tinggi DS maka terjadi
resistensi CMC terhadap enzim
selulase.Namun DS yang terlalu rendah (0,4
dilakukan adalah dengan menggunakan
larutan alkali hydroxide (umunya adalah
NaCl) pada polisakarida sehingga ada
penggantian gugus hidroksi yang terdapat
pada polisarida. Jadi Carboxymethylation
tidak terjadi hanya pada selulosa dan pati
namun pada polisakarida yang lain (Heinze,
2005).
Carboxymethylcellulose (CMC)
pertama kali ditemukan pada tahun 1918 dan
diproduksi secara masal pertama kali pada
awal 1920 oleh IG Farbenindustrie AG di
Jerman. Namun hingga sekarang peningkatan
teknologi yang digunakan dalam produksi
masih diperbaiki, peningkatan kualitas
produk, dan efisiensi dalam melakukan
produksi (Heinze, 2005). Saat ini terdapat
berbagai jenis kualitas CMC yang
digolongkan berdasarkan kandungan pada
CMC seperti yang tersaji pada Tabel 2. 3.
Kandungan CMC (%) Kandungan garam (%)
< 75 > 25
75-85 15-25
> 98 <2
> 99,5 < 0.5
dan 0,7) tidak efektif digunakan sebagai
CMC, sehingga disarankan menggunakan
CMC dengan DS 0,9 terutama pada
pengukuran aktifitas enzim selulase pada
bakteri (Hankin and Anagnostakis, 1977).
Disarankan untuk menggunakan CMC
dengan DS 1,2 untuk mendeteksi enzim
selulase yang dihasilkan oleh
mikroorganisme yang diisolasi dari tanah dan
air selokan (Hankin et al., 1974; Hankin and
Sands, 1974 dalam Hankin and
Anagnostakis, 1977). CMC dengan DS 0,4
baik digunakan untuk mendeteksi enzim
selulase pada beberapa fungi yang tidak
dapat efektif mendegradasi CMC dengan DS
0,9. CMC dengan DS 0,9 dapat digunkan
untuk mendeteksi secara efektif enzim
selulase pada semua mikroorganisme. Tidak
ada perbedaan yang nyata antara laju
degradasi CMC pada media padat dengan
media cair (Hankin and Anagnostakis, 1977).
Hal ini dapat diduga karena enzim selulase
disekresikan pada lingkungan sekitar yang
mengandung selulosa.
2.5 Mikroorganisme Pendegradasi
Selulosa (Bakteri Selulotik)
Bakteri pendegradasi karbohidrat
sering diisolasi dari tanah yang mengandung
seresah daun. Hal ini disebabkan karena
tanah mengandung bahan organik yang
relatif kaya dan terdapat seresah daun
mengandung polisakarida yang relatif
komplek. Kondisi tersebut menyebabkan
tanah dan seresah daun menjadi habitat yang
baik untuk berbagai mikroorganisme
(William and Govind, 2003). Pada penelitian
yang dilakukan oleh Hatami et al., (2008)
diketahui bahwa jumlah bakteri yang berhasil
diisolasi pada tanah hutan lebih banyak
dibandingkan dengan yang berhasil diisolasi
pada lahan pertanian. Dari total bakteri yang
berhasil diisolasi juga diketahui bahwa
jumlah total isolat bakteri pendegradasi
selulosa lebih banyak dibandingkan dengan
yang diisolasi dari lahan pertanian. Hal ini
terjadi karena terdapat perbedaan material
organik yang terdapat pada hutan dan lahan
pertanian. Hutan memiliki keanekaragaman
material organik yang lebih tinggi
dibandingkan dengan lahan pertanian.
Pada penelitian yang dilakukan
oleh Hatami et al., (2008) diketahui bahwa
rata-rata pada ratio Hydrolisys Capacity (HC)
isolat yang diisolasi pada lahan pertanian
lebih besar dibandingkan dengan ratio HC
yang diisolat pada hutan. Ratio HC yang
diperoleh pada hutan adalah 1,6 sedangkan
pada lahan pertanian ratio HCnya adalah 2.1.
Hal ini menunjukkan bahwa isolat bakteri
pendegradasi selulosa pada lahan pertanian
memiliki potensi yang lebih besar
dibandingkan dengan isolat bakteri yang
diperoleh pada hutan untuk digunakan dalam
mendegradasi material selulosa.
Sellulosa adalah polimer
karbohidrat yang terbanyak yang terdapat di
alam (Han and Chen, 2007). Oleh karena itu
mikroorganisme pendegradasi selulosa
ditemukan di berbagai ekosistem. Enzim
selulosa dapat dihasilkan oleh berbagai
bakteri dan fungi, aerob dan anerob, mesofil
dan termofil. Fungi aerob yang dapat
mendegradasi selulosa diantaranya adalah
Trichoderma viride, Trichoderma reesi,
Penicillium pinophilum, Sporotrichum
pulvelentum, Fusarium solani, Tolaromyces
emersonii, dan Trichoderma koningii. Hanya
sedikit mikroorganisme yang digolongkan ke
dalam kelompok seperti fungi termofilik
aerobik ( Sporotrichum thermophile,
Thermoascus aurantiacus, Chetomium
thermophile, Humicola insolens), fungi
mesofil anaerobik (Neocallimastix frontalis,
Piromonas communis, Sphaeromonas
communis), bakteri mesofilik dan termofilik
aerobik (Cellumonas sp, celvibrio sp,
Microbispora bispora, Thermomonospora
sp),bakteri mesofilik dan termofilik
anaerobik (Acentivibrio cellulolyticus,
Bacteriodes cellulosolvent, Bacteriodes
succinogenes, Ruminococcus albus,
Ruminococcus flavefaciens dan Clostridium
termocellum). Bakteri pendegradasi selulosa
termofil dapat menghasilkan enzim selulase
yang relatif stabil (tahan pada kondisi asam
atau basa dan pada suhu tinggi hingga 90°C)
(Bhat, and Bhat, 1997).
Organisme dapat mendegradasi
selulosa dan menjadikan selulosa sebagai
sumber karbon tunggal yang secara ekologi
menjadi sangat penting, dan sebagian besar
proses degradasi selulosa terjadi dalam
keadaan aerob. Hanya 5-10% degrdasi yang
berlansung secara anaerob. Bakteri selulotik
yang ditemukan terdapat pada filum
Thermotogae, Proteobacteria,
Actinobacteria, Spirochaetes, Firmicutes,
Fibrobacteres and Bacteroides. Diperkirakan
80% isolat yang diperoleh ditemukan pada
filum Firmicutes dan Actinobacteria dan
mayoritas bakteri pendegradasi selulotik
Gram positif masuk ke dalam kelas
Clostridia dan genus Clostridium yang
termasuk ke dalam Filum Firmicutes (Levin
et al., 2009).
Simbiosis antara hewan
(ruminansia) dan mikroorganisme adalah
hubungan yang saling menguntungkan.
Polimer karbohidrat tidak dapat dicerna oleh
kebanyakan hewan tetapi dapat dihidrolisis
dan difermentasi oleh mikroorganisme yang
terdapat di rumen. Hasil akhir yang diperoleh
adalah asam lemak yang digunakan dalam
metabolisme rumennansia. Mikroorganisme
pendegradasi selulosa yang terdapat pada
rumennasia antara lain adalah Butyrivibrio sp. E2, Piromyces rhizinflata, Prevotella
fibrisolvens, Fibrobacter succinogenes, ruminocola, Ruminococcus albus,
Neocallimastix frontalis, Neocallimastix Ruminococcus flavefaciens, dan Prevotella
patriciarum, Orpinomyces jayanii, albensis (Krause, et al. 2003).
Orpinomyces sp, Piromyces equi, Piromyces
Untuk mengokimalkan menghidrolisis secara acak ikatan pada serat
metabolisme bakteri pendegradasi selulosa selulosa (Wood, 1985). Hal ini
pada keadaan minimal nutrient, setiap bakteri mengakibatkan rantai polisakarida yang telah
mempunyai strategi yang berbeda-beda. terpotong (oligosakarida) mempunyai
Besar hasil akhir yang diperoleh pada proses panjang rantai yang berbeda-beda (Bhat,
degradasi tergantung kepada beberapa faktor 2000). Hasil dari hidrolisis serat sellulosa
yaitu pH, akses terhadap karbon (kecocokan adalah glukosa, cellobiose, cellotriose, dan
konformasi enzim dengan subtrat), reaksi oligosakarida yang lebih tinggi (Wood,
redok yang terjadi, konsentrasi produk. Dan 1985). Enzim endoselulase sangat aktif pada
untuk mengoktimalkan hasil yang diperoleh degradasi derivat selulosa seperti
maka diperlukan pengetahun tentang carboxymethylcellulose dan
genetika mikroorganisme yang digunakan, hydroxyethylcellulose, dalam degradasi ini
enzimatik, dan termodinamika dalam endoselulase bekerja sama dengan
mekanisme aliran karbon (karbon flow). exoselulase (Mattinen, 1998). Enzim
Detail pengetahuan mengenai hubungan eksoselllulase (EC 3.2.1.91) terdiri dari 1,4-
antara genome content, gen dan produk D-glucan glucanohydrolases (lebih dikenal
ekpresi gen, pathway utilization, dan hasil dengan cellodextrinases) dan1,4-D-glucan
akhir yang diperoleh akan sangat penting cellobiohydrolases (cellobiohydrolases).
untuk diketahui dalam degradasi selulosa Enzim eksoselulase adalah enzim yang aktif
(Levin et al., 2009). pada sisi crystalline selulosa (Mattinen,
1998). β-glucoside glucohydrolases lebih
2.6 Enzim Selulase dikenal sebagai β-glukosidase.
Di alam, enzim selulase ditemukan Cellobiohydrolyase, yang seing disebut
di berbagai ekosistem, terutama ditemukan dengan exoglucanse, adalah enzim
pada dekomposisi serasah daun pada tabah, pendegradasi selulosa yang ditemukan pada
hingga keadaan anaerobik pada rumenansia mayoritas fungi yang dapat mendegradasi
(Denman et al., 1996). selulosa (Wood, 1985). Cellobiohydrolyase
Sistem enzim sellulosa sangat dapat menghidrolisis microcrystalline namun
penting karena berperan dalam mengubah tidak dapat menghidrolisis CMC
sellulosa menjadi gula sederhana. Sellulosa (carboxymethylcellulose) (Kim and Kim,
relatif sulit diubah menjadi gula sederhana, 1995). β-glukosidase adalah enzim yang
namun jumlah sellulosa yang melimpah digunakan untuk menghidrolisis cellobiose
menjadikan sellulosa menjadi bahan yang dan pada beberapa kasus dapat
potensial untuk digunakan dalam produksi menghidrolisis cello-oligosakarida menjadi
bioetanol (Himmel et al.,1997 dalam glukosa. Enzim endogluconases dan β-
William and Govind, 2003). glukosidase dapat menghirolisis selulosa
Enzim sellulase terdiri dari enzim menjadi glukosa. β-glukosidase di butuhkan
Endosellulase , Eksosellulase, dan β- untuk menghidrolisis inhibitor cellobiose
glukosidase (tabel 2.1). Enzim selulase (Wood, 1985).
adalah enzim yang dapat mengkatalisis dan
menghidrolisis ikatan glukosidik pada
sellulosa (ikatan yang paling banyak di
sellulosa) (Bhat, 2000). Enzim endosellulase
(EC 3.2.1.4) terdiri dari satu jenis enzim
yaitu 1,4-D-glucan-4-glucanohydrolases
(Bhat dan Bhat, 1997 ; Wood, 1985).
Endoglucanases atau yang sering disebut
dengan CM-cellulases
(carboxymethylcellulose) atau Cx enzim,
 Tabel 2.4 Jenis-jenis enzim selulase (Bhat dan Bhat, 1997) 3. Hidrolisis sellulosa
Jenis enzim Kode Sinonim Mekanisme 4. Transfer sellodextrins, glukosa dan
EC reaksi sellobiosa ke bulk aqueous phase
Endo-(1- EC Endoselulase -G-G-G-G- 5. Hidrolisis sellodextrins dan sellobiosa
4)-β-D- 3.2.1.4 atau menjadi glukosa
selulase endoglukanase Fase adsopsi dan pembentukan
Memutuskan komplek enzim-substrat adalah fase kritis di
ikatan secara dalam hidrolisis selulosa (Bledman et al, 1988).
acak Tahapan hidrolisis selulosa tergantung kepada
Ekso-(1-4)- EC Selobiohidrolas G-G-G-G- struktur selulosa, interaksi anatara enzim
β-D- 3.2.1.91 e atau selulase dan serat selulosa, mekanisme hidrolisis
selulase eksoselulase Melepaskan enzim tersebut di alam dan inhibitor yang
selobiosa baik terbentuk (Coughlan, 1985). Glukosa dan
yang reducing sellobiose adalah inhibitor enzim dalam
atau non- menghidrolisis selulosa. Sellobiosa
reducing end menghambat enzim sellobiohidrolase pada
Ekso-(1-4)- EC Eksoglukanase G-G-G-G komplek enzim selulase dan glukosa
β-D- 3.2.1.74 atau menghambat enzim penghidrolisis sellobiosa .
selulase glukohidrolase Melepaskan Sellobiose mempunyai potensi menjadi inhibitor
glukosa dari yang lebih kuat dibandingkan dengan glukosa
non-reducing pada mekanime hidrolisis selulosa (Marsden
end and Gray, 1986). Dua mekanisme inhibibisi
β- EC Selobiose G-G, G-G-G- yaitu inhibitor kompetitif dan inhibitor non
glukosidase 3.2.1.21 kompetitif (Lee and Fan, 1982). Laju hidrolisis
Melepaskan enzim selulase ditentukan oleh struktur enzim
glukosa dari dan struktur substrat (Mandels, 1985), dimana
selobiosa atau struktur Kristal dari selulosa relatif lebih sulit
rantai cello- dihidrolisis dibandingkan dengan struktur amorf
oligosakarida ( Coughlan, 1985). Karena struktur kristal lebih
pendek sulit didegradasi dibandingkan dengan struktur
amorf, maka enzim selulase (enzim
Luas permukaan adalah faktor yang endosellulase) menghidrolisis struktur amorf.
berprngaruh dalam proses degadasi serbuk Mekanisme skematis kerja enzim selulase
selulosa crystalline. Hal ini dapat dilihat bahwa seperti pada Gambar 2.3.
luas permuaan mempengaruhi kontak enzim
selulase dengan permukaan selulosa (Weimer et
al., 1993 dalam Rodrigues et al., 2003).
Degradasi selulosa dengan menggunakan
meadow hay (rumput-rumputan) menunjukkan
bahwa dalam degradasi selulosa perlekatan dari
bakteri memainkan peran yang penting dalam
mendegradasi selulosa (Sequeira and Sequiera,
1993)
Enzim selulase dapat menghidrolisis
subtrat selulosa melalui sistem reaksi komplek
yang terdiri dari beberapa tahapan (Lee and Fan,
1982). Tahapan reaksi tersebut adalah :
1. Transfer enzim dari bulk aqueous phase ke
permukaan substrat selulosa
2. Adsopsi enzim dan pembentukan komplek
enzim-substrat

Gambar 2.3 Skematis mekanisme degradasi selulasa
(Beguin and Aubert, 1994)
Bakteri selulotik dapat bekerja pada
variasi keadaan lingkungan yang berbeda-beda
dalam mendegradasi seresah daun pada tanah
(Beguin and Aubert, 1994; Denman et al., 1996
dalam Linder dan Teeri, 1997). Mikroba ini
dapat mendegradasi melekul komplek, keadaan
dimana subtrat tidak larut dalam air dengan
menggunakan berbagai enzim melalui berbagai
cara didalam memutuskan bagian yang berbeda
di dalam substrat. Efisiensi degradasi kayu
dengan menggunakan mikorganisme sepeti
fungi filamentus, merupakan tipe yang
mengsekresikan dan mengsinergikan aksi enzim
selulase dimana bakteri menggunakan komplek
enzim (cellulosome) yang bekerja pada
permukaan substrat (Tomme et al., 1995; Bayer
et al., 1996 dalam Linder dan Teeri, 1997). Hal
ini juga terjadi pada fungi anaerob dimana
Enzim ada yang mempunyai singgel
Binding Domain dan ada yang mempunyai dua
atau lebih Binding Domain. Namun hampir
semua enzim selulase memiliki multidomain.
Berdasarkan perbedaan enzim selulase beberapa
lebih memilih mendegradasi substrat selulosa
pada bagian amorphous dibandingkan bagian
yang lain yaitu bagian kristalin. Beberapa
penelitian yang dilakukan terhadap enzim
memiliki komplek seperti cellulosome dengan
ukuran yang lebih besar (Fanutti et al., 1995;
Denman et al., 1996; Dijkerman et al., 1996).
Kedua tipe enzim dapat melepaskan ikatan β-
1,4-glukosida dengan menggunakan enzim endo
atau exoglukonase yang spesifik yang
didasarkan atas topologi dari sisi aktif.
2.7 Cellulose Binding Domain (CBD)
CBD pertama kali ditemukan pada
Trichoderma reesei. Sekarang telah behasil
diidentifikasi 120 CBD dan diklasifikasikan
menjadi 10 families (I-X). Ada dua families (II
dan III) yang memiliki anggota yang banyak
sehingga dibagi menjadi subfamilies (IIa, IIb,
IIIa dan IIIb). Sebagian besar CBD termasuk ke
dalam families I, II dan III, pada beberapa
families hanya mengandung beberapa anggota
dan pada families yang lain hanya memiliki satu
anggota. Families I hanya mengandung CBD
yang berasal dari fungi dan semua CBD yang
termasuk ke dalam families II-V, IX-X
semuanya merupakan CBD yang berasal dari
bakteri (Mattinen, 1998).
CBD yang termasuk ke dalam families
I adalah CBD yang berukuran kecil dan tersusun
oleh peptide yang kompak, mengandung 32-36
asam amino. CBD fungi memiliki kemiripan
yang sangat tinggi antara yang satu dengan yang
lain. Contoh terbaik CBD families I adalah yang
terdapat pada Trichoderma reesei. CBD bakteri
yang termasuk ke dalam families II tersusun dari
asam amino yang lebih banyak yaitu 95-108.
CBD yang termasuk ke dalam families III adalah
dihasilkan oleh bakteri yang dapat menghasilkan
cellulosome (Mattinen, 1998). Klasifikasi dari
CBD dari organisme yang berbeda disajikan
pada Lampiran 12.
selulase yang berbeda dapat digunakan untuk
mengidentifikasi enzim mana yang
kemungkinan pada masa yang akan datang
digunakan untuk mendegradsi selulosa pada
bagian kristalin (Wilson and Mertens, 1995;
Davies and Henrissat, 1995; Teeri, 1997 dalam
Linder dan Teeri, 1997). Salah satu yang
menjadi perhatian utama adalah mengenai
adsopsi yang berhubungan dengan aktifitas
katalitik pada substrat padat (Klyosov, 1990
dalam Linder dan Teeri, 1997). Karasteristik
struktural dari berbagai enzim selulase
didasarkan pada pengetahuan mengenai
melekuler yang merupakan bagian terpenting
dalam memahami degradsi selulosa.
Kebanyakan, namun tidak semua enzim selulase
efektif mendegradasi selulosa berdasarkan
model struktur penyusun sehingga tempat
perlekatan sisi katalitik berkaitan dengan
cellulose-binding domain (CBD) (Tomme et al.,
1995).
Mirip dengan enzim selulase,
pemindahan substrat binding domain
aktifitasnya meningkat pada subtrat yang tidak
larut namun tidak pada substrat yang larut
(Blaak and Schrempf, 1995 dalam Linder dan
Teeri, 1997). Hal ini menunjukan bahwa struktur
modular domain memiliki keuntungan yang
signifikan dalam mengdegradasi substrat yang
tidak larut (Linder dan Teeri, 1997).
2.8 Rumput Gajah (Pennisetum purpureum
Schum)
Rumput gajah adalah tanaman yang
termasuk ke dalam kelompok tanaman rumput-
rumputan. Rumput gajah banyak dimanfaatkan
pada bidang peternakan yaitu sebagai makanan
hewan ternak seperti sapi, kambing dan kuda.
Umumnya rumput gajah yang digunakan
diindonesia adalah rumput yang tumbuh secara
liar. Namun untuk peternakan yang relatif besar
maka rumput yang digunakan adalah rumput
yang sengaja ditanaman atau dipelihara secara
khusus. Hal ini dilakukan untuk memenuhi
kebutuhan pakan ternak. Rumput-rumputan
dipilih karena merupakan tanaman yang
produktifitasnya tinggi dan memiliki sifat yang
dapat memperbaiki kondisi tanah (Gonggo et al.,
2005).
Rumput-rumputan yang ditanam pada
suatu lahan dapat memperbaiki kondisi tanah.
Tanaman tumput-rumputan membuat tanah
menjadi lebih gembur. (Gonggo et al., 2005).
Hal ini dapat meningkatkan porositas, yang
menyebabkan terjadi aerasi yang lebih baik
terhadap lahan yang ditanami oleh rumput-
rumputan (Handayani, 2002). Banyaknya pori
juga membantu terjadinya degradasi oleh
mikroorganisme dari guguran daun. Potensi
untuk mendapatkan isolat bakteri pendegradasi
selulosa menjadi cukup besar . Lahan yang
ditanami rumput juga tahan terhadap
kekeringan, hal ini terjadi karena perakaranya
yang dalam (Rismunandar, 1989 dalam Gonggo
et al., 2005). Tanaman penutup tanah dari jenis
rumput-rumputan dapat juga berfungsi sebagai
pelindung permukaan tanah dari daya disperse
dan daya penghancur oleh butiran-butir air
hujan, memperlambat aliran permukaan
(Kartasapoetra et al., 2000 dalam Gonggo et al.,
2005).
Sumber energi yang ramah lingkungan
dan ekonomis menjadi perhatian utama
pengembangan teknologi dalam bidang energi.
Pada saat ini biomassa adalah menjadi perhatian
utama dalam pengembangan energi terbarukan.
Fokus utama yang menjadi pertimbangan dalam
memilih biomassa adalah bahan tersebut mudah
diperbaharui dan energi yang dapat diperoleh.
Biomassa adalah sumber energi terbarukan yang
melimpah dan dapat diperoleh dari berbagai
industri sebagai sampah/limbah seperti
pertanian, industri gula, limbah industri yang
menggunakan kayu, dan industri makanan.
Selain menggunakan bahan yang merupakan
limbah dari industri lain energi terbarukan dapat
berasal dari tanaman yang ditanam sebagai
sumber energi (sumber karbon) (Strezos et al.,
2008). Salah satu tanaman yang mempunyai
potensi dijadikan sumber biomassa pada energi
terbarukan adalah rumput gajah (Pennisetum
Purpureum Schum). Berikut adalah klasifikasi
dari Pennisetum purpureum Schum.
Kingdom : Plantae
Phlum : Spermatophyta
Class : Monokotil
Ordo : Poales
Family : Poaceae
Genus : Pennisetum
Spesies : Pennisetum purpureum Schum
(Tjitrosoepomoe, 2004)
Rumput gajah (Pennisetum purpureum
Shaum) berasal dari afrika tropik, tumbuh
berumpun dan tingginya dapat mencapai 3 m
lebih. Permukaan buluhnya licin dan pada buluh
yang masih muda bisanya ditutupi oleh sejenis
zat lilin tipis. Pelepahnya licin atau berbulu pada
waktu muda dan kemudian berbulu-bulu tersebut
gugur. Daunnya berbentuk garis, pangkalnya
lebar dan ujungnya lancip sekali. Tepi daun 45 ton per hektar berat kering pada daerah
kasar. Perbungaan berupa tandan tegak yang subtropis dan 80 ton per hektar berat kering pada
panjangnya sampai 25 cm. gagang-gagangnya daerah tropis (Woodard and Prine, 1993).
berbulu. Bulir-bulirnya berkelompok, terdiri dari Rumput gajah dapat hidup pada daerah dengan
3-4 buliran tiap kelompoknya dan bergagang kandungan nutrisi yang minimal. Dalam satu
pendek sekali. Pangkal bulirnya bulirannya tahun rumput gajah dapat dipanen hingga empat
berbulu panjang dan halus. Perbanyakan dapat kali. Menurut Okaraonye dan Ikewuchi (2009)
dilakukan dengan pemecahan rumpun dan analisis kandungan kimia dari rumput gajah ada
potongan-potongan buluhnya. Dapat tumbuh pada Tabel 2.5.
hingga pada ketinggian 1500 m dpl
(www.flickr.com). Tabel 2.5 Analisisa kandungan kimia rumput gajah
(Pennisetum purpureum Shaum)
Berat Berat
Parameter
basah kering
Kandungan air 89,0 -
Jumlah abu 2,00 18,18
Protein kasar 2,97 27.00
Lemak kasar 1,63 14.82
Jumlah total
3,40 30,91
karbohidrat
Serat kasar 1,00 9,09

Sedangkan menurut Strevoz (2008) kandungan

mineral pada rumput gajah ada pada Tabel 2.6.

Table 2.6 Analisis kandungan mineral pada rumput gajah

Analisis Mineral yang Jumlah
kandungan dianalisis senyawa dari
mineral pada dalam bentuk total berat
abu senyawa abu yang
dianalisis
Silikon SiO2 43
Almunium Al2O3 <0,1
Besi Fe2O3 1,4
Gambar 2.4 Rumput gajah (Pennisetum purpureum Shaum)
(www.flickr.com) Kalsium CaO 1,9
Magnesium MgO 9,9
Penamaman tanaman seperti rumput Natrium Na2O <0,01
gajah mengalami kompetisi perebutan lahan Kalium K2O 30,5
dengan tanaman pangan seperti jagung. Oleh Titanium TiO2 0,03
karena itu, untuk meminimalkan kompetisi Mangan Mn5O4 0,17
penggunaan lahan kritis perlu ditingkatkan. Fosfor P2O5 7,2
Lahan kritis umumnya tidak banyak digunakan Belerang SO3 5,7
sebagai lahan pertanian. Di dunia terdapat 2 Gha Strontium SrO 0,03
lahan kritis yang tidak dapat ditanami tanaman Barium BaO 0,08
pangan. Lahan kritis yang tidak digunakan Zink ZnO 0,08
memiliki kecenderungan mengalami kerusakan Vanadium V2O5 0,01
yang lebih parah seperti erosi. Penanaman
tanaman penghasil energi dapat memperbaiki Softwood mengandung lignin yang
kualitas tanah (Strezos et al, 2008). lebih banyak dibandingkan dengan hardwood.
Rumput gajah adalah tanaman yang Hemiselulosa tertinggi terdapat pada rumput-
berasal dari afrika yang dapat mencapai hingga
rumputan. Perbandingan kandungan dari
selulosa, lignin dan hemiselulosa pada softwood,
hardwood dan rumput terdapat pada Tabel 2.7
(Glazer and Nikaido, 2007). Karena kadar
hemiselulosa yang besar maka proses degradasi
selulosa pada rumput-rumputan relatif menjadi
lebih sulit.
METODOLOGI
3.1 Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian dilakukan pada bulan
Februari 2009 sampai April 2010 di
Laboratorium Mikrobiologi dan Bioteknologi
Biologi ITS Surabaya.
3.2 Pengambilan Sampel Sedimen dan
Serasah Daun
Lokasi pengambilan sampel di Wana
Wisata Air Panas Padusan Wisata Perum
Perhutani Unit II Pacet Mojokerto. Sampel
berupa sedimen, serasah daun rumput gajah (P.
purpureum Shaum) dan daun rumput gajah (P.
purpureum Shaum) segar. Sampel diambil pada
hari Kamis, 5 Februari 2009 pada pukul 00.00
WIB. Sampel diambil di 5 titik.
Sampel serasah daun rumput gajah (P.
purpureum Shaum) diambil dengan
menggunakan paralon dan sekop kecil. Sampel
serasah diambil mulai dari permukaan hingga
kedalaman ±15 cm. Sebelum diambil, terlebih
dahulu serasah dicampurkan agar homogen.
Sampel dari kelima titik dicampur menjadi satu
dan kemudian dimasukkan ke dalam kantong
plastik dan disimpan di dalam ice box yang
berisi dry ice. Sampel dibawa ke laboratorium
dan langsung dilakukan perlakuan sesuai dengan
prosedur isolasi bakteri.
3.3 Pengayaan Kultur Bakteri
Pendegradasi Selulosa
Perlakuan pengayaan kultur bakteri
dilakukan pada medium cair PCS. Medium ini
dibuat dengan memodifikasi metodologi dari
penelitian Haruta et al., 2002. Pembuatan
medium ini dengan mencampurkan 1 g ekstrak
yeast, 5 g pepton, 5 g CaCO3, 5 g NaCl ke dalam
gelas Erlenmeyer kemudian ditambahkan 800 ml
akuades. Material selulotik adalah 20 g daun
rumput gajah (P. purpureum Shaum) segar yang
sebelumnya diblender terlebih dahulu dengan
akuades 200 ml dan kemudian disaring. Filtrat
daun rumput gajah (P. purpureum Shaum)
dimasukkan ke dalam gelas Erlenmeyer yang
telah berisi medium PCS tersebut diatas
sehingga total volume menjadi 1 L. Medium
disterilisasi ke dalam autoklaf pada suhu 121°C
dan tekanan 1,5 atm selama 15 menit.
Sumber inokulum untuk pengayaan
kultur bakteri pendegradasi selulosa adalah
sedimen dan serasah daun rumput gajah (P.
purpureum Shaum). Serasah daun rumput gajah
(P. purpureum Shaum) sebanyak 5 g
dicampurkan secara aseptik ke dalam gelas
Erlenmeyer 500 ml yang berisi 250 ml medium
PCS (1:50 gr/vol). Kemudian kultur bakteri
diinkubasi di atas rotary shaker (Health/H-M-
SR) dengan kecepatan 100 rpm selama 2 minggu
pada suhu ruangan. Pada hari ke-5, ke-7 dan ke-
15 dilakukan perhitungan jumlah konsentrasi sel
bakteri yang bertujuan untuk mengetahui
pertumbuhan bakteri. Setelah 15 hari masa
inkubasi kultur pengayaan dipindahkan ke
medium PCS baru dengan perbandingan 1:10.
3.4 Isolasi Bakteri Pendegradasi Selulosa
Untuk mengisolasi bakteri pendegradasi
selulosa digunakan medium Cellulose Congo
Red Agar (CCRA) (Hendricks et al., 1995).
Medium CCRA dibuat dengan dengan
komposisi K2HPO4 sebanyak 0,5 gr, MgSO4
0,25 gr, Congo red 0,2 gr, agar 7,5 gr, gelatin 2
gr, CMC 1,88 gr, 100 ml filtrat serbuk daun
rumput gajah (P. purpureum Shaum) dan 900 ml
akuades steril. Bahan-bahan tersebut
dicampurkan kecuali agar dan gelatin.
Keasaman medium adalah pH 7,0. Agar dan
gelatin kemudian dilarutkan dalam medium
dengan pemanasan menggunakan hot plate.
Medium kemudian diautoklaf selama 15 menit
pada suhu 121°C dengan tekanan 1,5 atm,
didinginkan lalu dituangkan ke cawan Petri steril
dan disimpan pada suhu 4°C.
Pengenceran bertingkat dilakukan untuk
memudahkan isolasi. Kultur pengayaan yang
berusia 15 hari tersebut diatas (metode 3.3 )
diambil sebanyak 1ml dan dimasukkan ke dalam
tabung reaksi yang berisi 9 ml akuades steril lalu
di vorteks agar homogen. Ini merupakan
pengenceran tingkat 10-1. Pengenceran
bertingkat dilakukan hingga tingkat pengenceran
10-10 (Lampiran 1). Dari setiap tingkat
pengenceran diteteskan sebanyak 0,1 ml ke
permukaan medium padat (CCRA) dan
kemudian diratakan dengan menggunakan
spatula. Metode isolasi bakteri yang digunakan
pada penelitian ini adalah Spread Plate
Methode. Biakan bakteri di inkubasi dalam
inkubator pada suhu 37°C selama 1-7 hari.
Koloni yang tumbuh diamati zona
beningnya. Zona bening menunjukkan bahwa
koloni bakteri tersebut menghasilkan enzim
selulolitik dan mendegradasi selulosa yang ada
disekitarnya. Koloni dengan dengan rasio HC
tertinggi atau diameter dari zona bening yang
terbesar dipilih dan akan digunakan untuk
langkah selanjutnya. Koloni yang terpilih
diberikan kode PP. Huruf “PP” merupakan
singkatan dari Pennisetum purpureum Shaum.
3.5 Pemurnian Kultur
Setelah inkubasi selama 7 hari akan
tampak zona bening pada tiap koloni yang
terbentuk. Setiap koloni terpisah yang
memunculkan zona bening dimurnikan dengan
metode 16 goresan pada medium CCRA seperti
pada Lampiran 2. Pemurnian ini dilakukan
sebanyak lima kali tahap pemurnian. Setelah 3
kali proses pemurnian, isolat kultur diamati
secara mikroskopik. Jika telah ditemukan kultur
murni maka perlakuan pemurnian dihentikan.
Kultur murni adalah kultur yang terdiri dari sel
yang sama bentuk dan ukurannya. Dari hasil
pemurnian, isolat yang didapat disimpan pada
medium CCRA miring untuk dilakukan
pengamatan selanjutnya. Untuk uji biokimia,
digunakan isolat yang disimpan pada medium
Nutrient Agar (NA). Pembuatan medium NA
dapat dilihat pada Lampiran 3.
Pengamatan mikroskopik dilakukan
dengan melakukan metode pewarnaan
sederhana. Akuades steril diteteskan sebanyak
satu tetes pada bagian ujung dari kaca obyek.
Satu ose bakteri kemudian digoreskan pada
tetesan akuades dan diratakan. Preparat
kemudian difiksasi dengan melewatkan di atas
api bunsen hingga akuades mengering.
Penyediaan preparat dengan mengikuti langkah-
langkah tersebut di atas selanjutnya disebut
sebagai preparat ulas. Preparat ulas yang telah
dibuat kemudian diwarnai dengan methylen blue
(Merck®, Jerman). Sebanyak 2-3 tetes methylen
blue diteteskan diatas sediaan dan ditunggu
selama ± 3 menit. Setelah itu dibilas sisa
methylen blue pada preparat dengan
menggunakan akuades. Pengamatan sel bakteri
dilakukan dibawah mikroskop (Olympus,
CX21FSI®, Jepang) dengan perbesaran 1000X.
Untuk memperjelas pengamatan di berikan
bantuan dengan meneteskan satu tetes minyak
imersi pada permukaan atas gelas penutup.
3.6 Karakterisasi Bakteri
Isolat bakteri murni kemudian
dikarakterisasi dan diidentifikasi yang dilakukan
secara biokimia yang mengacu pada Bergey
Manual of Determinative Bacteriology 9th yang
merupakan bagan alir hasil modifikasi dapat
dilihat pada Lampiran 4 sampai dengan 7,
karakterisasi yang dilakukan meliputi:
1. Pengamatan makroskopik
Karakteristik koloni bakteri hasil
inokulasi pada media CCRA datar yaitu
berdasarkan:
a. Bentuk koloni (dilihat dari atas) :
berupa titik-titik, bulat, berbenang,
tak teratur, serupa akar, serupa
kumparan.
b. Permukaan koloni (dilihat dari
samping) : rata, timbul-datar,
melengkung, membukit, serupa
kawah.
c. Tepi koloni (dilihat dari atas) : utuh,
berombak, berbelah, bergerigi,
berbenang, keriting.
d. Warna koloni : keputih-putihan,
kelabu, kekuning-kuningan atau
hampir bening.
(Dwijoseputro,2005)
2. Pengamatan mikroskopik
Pengamatan mikroskopik dilakukan
untuk melihat bentuk sel bakteri dan
untuk melihat kemurnian dari isolat.
3. Uji biokimia
Uji biokimia yang dilakukan merupakan
hasil modifikasi metode dari Collins and
Lyne (1985), Lay (1994), Cappucino
and Sherman (2001), Harley and
Prescott (2002), Noviani dan Gusrizal
(2002). Uji biokimia yang dilakukan
terdiri dari pewarnaan Gram, kebutuhan
oksigen, kemampuan tumbuh pada
 medium NA+20% NaCl dan motilitas.
Uji biokimia mengikuti bagan alir
dikotomi (Lampiran 4-7) berdasarkan
buku panduan standar Bergeys Manual
of Determinative Bacteriology. Untuk
melakukan pengujian tersebut,
digunakan isolat bakteri sebelumnya
yang diremajakan dalam media padat
NA, hingga diperoleh isolat bakteri yang
berumur 24 jam.
Pewarnaan Gram
Preparat ulas ditetesi larutan kristal
violet sebanyak 2-3 tetes dan didiamkan selama
20 detik, selanjutnya dicuci preparat di bawah
air mengalir dan dikeringanginkan. Selanjutnya
larutan iodin (Merck, Jerman) diteteskan
sebanyak 2-3 tetes di atas permukaan preparat
dan didiamkan selama 1 menit, kemudian dicuci
di bawah air mengalir dan dikeringanginkan.
Larutan etil alkohol (Merck, Jerman) 95%
diteteskan setetes demi setetes di atas
permukaan lapisan preparat sampai kristal violet
tercuci dan kemudian dicuci di bawah air
mengalir dan dikeringanginkan. Larutan safranin
diteteskan di atas permukaan kaca obyek dan
didiamkan selama 20 detik, dicuci di bawah air
mengalir dan dikeringanginkan. Setelah kering,
preparat ditutup dengan gelap penutup untuk
diamati dibawah mikroskop pada perbesaran
1000X dengan bantuan minyak imersi (Lay,
1994).
Kebutuhan Oksigen
Sebanyak 3 gram agar dan 29.5 gram
media thioglycollate (Oxoid, CMO173®,
Inggris) (Lampiran) dilarutkan ke dalam 1 liter
akuades dan dipanaskan diatas pemanas sampai
agar larut dan homogen. Kemudian media
dipindahkan ke dalam tabung reaksi sebanyak 7
ml dan disterilisasi dalam autoklaf pada suhu
121°C selama 15 menit dan tekanan 1,5 atm.
Setelah dikeluarkan dari autoklaf, tabung reaksi
yang berisi media langsung dimasukkan ke
dalam bak yang berisi air yang telah diatur
suhunya setinggi 50°C untuk mencegah
terjadinya pemadatan agar. Setelah suhu media
teradaptasi pada suhu 50°C yang ditandai
dengan media terasa hangat-hangat kuku,
kemudian sebanyak satu ose isolat bakteri
berumur 24 jam di inokulasikan ke dalam media
tersebut secara aseptis. Tabung reaksi kemudian
diputar dengan bantuan telapak tangan, agar
bakteri terdistribusi merata di dalam agar.
Setelah masa inkubasi selama 48 jam pada suhu
37°C, pola pertumbuhan dari isolat bakteri
diamati. Apabila isolat bakteri hanya tumbuh di
permukaan media, maka isolat tersebut adalah
aerob obligat. Apabila isolat bakteri tumbuh
sepanjang kolom tabung reaksi, tetapi
pertumbuhan terpekat pada permukaan agar,
maka isolat adalah anaerob fakultatif. Apabila
isolat bakteri tumbuh merata sepanjang kolom
tabung reaksi, maka isolat adalah anaerob
aerotoleran. Apabila isolat bakteri hanya tumbuh
di bawah permukaan agar, tetapi tidak sampai
sepanjang kolom tabung reaksi, maka isolat
adalah mikroaeroflik. Sedangkan apabila hanya
tumbuh pada dasar tabung reaksi, maka isolat
adalah anaerob obligat (Cappuccino and
Sherman, 2001; Harley and Prescott, 2002).
3.7 Uji Hydrolisys Capacity (HC)
Uji HC ini dilakukan untuk mengetahui
kemampuan dari isolat untuk mendegradasi
selulosa di lingkungan sekitarnya. Rasio HC
(hydrolysis capacity / HC value) adalah rasio
antara diameter zona bening dengan diameter
koloni yang menghasilkan zona bening (Lu et
al., 2005). Medium CCRA padat digunakan
pada pengujian ini. Biakan dari isolat murni
diambil dengan menggunakan jarum ose tanam
tajam kemudian disentuhkan bagian ujung jarum
yang mengandung biakan pada bagian tengah
medium CCRA. Biakan dinkubasikan di dalam
inkubator pada suhu 37º C. Pengukuran rasio
HC dilakukan setiap hari selama 1 minggu.
3.8 Uji Kemampuan Degradasi Selulosa
dari Isolat
Uji kemampuan degradasi selulosa
dilakukan dengan memodifikasi metodologi
penelitian yang digunakan Lu et al., 2005. Pada
uji ini digunakan medium minimal (Lampiran 3)
yang didapatkan pada penelitian Widdel et
al.(1992). Medium sebanyak 88 ml dimasukkan
ke dalam gelas Erlenmeyer 250 ml yang telah
berisi 5 potong daun rumput gajah (P.
purpureum Shaum) dengan ukuran 2x2 cm.
Kelima potong daun rumput gajah (P.
purpureum Shaum) tersebut telah diketahui total
berat kering awal. Medium kemudian
disterilisasi di dalam autoklaf selama 15 menit
pada suhu 121º C dengan tekanan 1,5 atm.
Kedalam larutan yang telah disterilisasi,
dimasukkan isolat dengan konsentrasi 105 sel/ml.
Konsentrasi sel bakteri tersebut didapatkan
dengan cara memasukkan 1 ose isolat murni
bakteri pendegradasi selulosa ke dalam 2 ml
medium minimal steril dan dihomogenkan
dengan menggunakan vorteks (Lampiran 8).
Larutan isolat dinokulasikan ke dalam medium
minimal steril secara aseptik sehingga
volumenya menjadi 90 ml. Kemudian larutan
diinkubasikan pada suhu ± 45oC di atas rotary
shaker (Health, H-M-SR®) dengan kecepatan
100 rpm.
Kemampuan isolat untuk mendegradasi
selulosa diamati berdasarkan total berat kering
daun rumput gajah (P. purpureum Shaum)
setelah 7 hari masa inkubasi dan menghitung
konsentrasi sel dengan menggunakan
Haemacyometer. Perlakuan dilakukan secara
duplo.
Berat kering daun rumput gajah (P.
purpureum Shaum) dicari dengan cara
menimbang berat awal (basah) daun sebelum
dimasukkan ke dalam oven (Lampiran 9).
Setelah itu dibungkus daun rumput gajah (P.
purpureum Shaum) dengan menggunakan
aluminium foil dan dioven pada temperatur 80º
C selama 1-3 hari. Setiap hari dilakukan
penimbangan untuk mengetahui berat kering
yang konstan.
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Isolasi dan Karakterisasi
Pada penelitian ini berhasil diisolasi
dan dipurifikasi 5 isolat bakteri yang
berpotensi sebagai bakteri pendegradasi
selulosa. Material selulosa yang diambil
adalah berasal dari daun rumput gajah segar
baik yang masih muda atau sudah tua yang
diambil secara acak dari daerah wisita
pemandian air panas yaitu Wana Wisata Air
Panas Padusan wisata perum Perhutani unit
II Pacet Mojokerto. Rumput gajah dapat
tumbuh di daerah pantai hingga daerah
dengan ketinggian 1500 dpl (di atas
permukaan air laut). Kelima isolat itu dikode
dengan nama PP 127-A, PP 141-A, PP 146-
A, PP 79-D, dan PP 91-A. Huruf PP pada
kode isolat adalah kependekan dari
Penesetum purpureum (nama ilmiah dari
rumput gajah). Tabel 4.1. menunjukkan
karakter koloni isolat tersebut.
Selanjutnya kelima isolat
dikarakterisasi secara biokimia dengan
mengikuti dikotomi berdasarkan Bergey’s
Manual of Determinative Bacteriology 9th
edition ( Holt, et al., 1994). Karakter hasil
uji biokimia dari kelima isolat bakteri
tersebut terdapat pada Tabel 4.2.
Berdasarkan karakter biokimia tersebut
isolat bakteri PP 127-A dan PP 141-A
cenderung masuk ke genus Flavobacterium,
isolat bakteri PP 146-A cenderung masuk ke
genus Lampropedia dan isolat bakteri PP
79-D dan PP 91-A cenderung masuk ke
genus Halomonas.
Menurut Holt et al. (1994) karakter
dari koloni Flavobacerium adalah sebagai
berikut. Sel berbentuk batang dengan sisi
yang sejajar dan ujung bulat, berukuran
0,5x1,0-3,0 µm. endospora tidak terbentuk.
Sel bersifat Gram negatif, non motil,
aerobik, dan oksidase positif, serta dapat
tumbuh di lingkungan dengan suhu 37°C.
Flavobacterium terdapat di tanah, air, juga
ditemukan pula pada daging, susu dan
makanan yang lainnya, serta dapat
ditemukan di lingkungan rumah sakit dan
material klinis manusia.
Genus Flavobacterium adalah salah
satu genus yang penting dalam degradasi
polisakarida (Yang et al., 1985). Dari
penelitian yang dilakukan oleh Ishigaki et
al. (2000) untuk mengisolasi bakteri
pendegradasi selulosa asetat diketahui
bahwa 3 dari 35 strain yang berhasil
diisolasi adalah dari genus Flavobacterium.
Genus Halomonas menurut Bergey’s
Manual of Determinative Bacteriology 9th
edition ( Holt, et al., 1994), memiliki
karakter berbentuk batang, berukuran 1-2,5 sebagai aseptor elektron terminal, katalase
µm, Gram negatif, endospora negatif dan oksidase positif, anaerobic fakultatif,
aerobik obligat, tidak motil dan mempunyai dan halotoleran (0,05-20 ‰) . Dari hasil
flagella, koloni yang terbentuk sangat tipis yang didapat, dua isolat memiliki karakter
dan tampak kering, kemoorganotrof, tidak genus Halomonas yaitu dengan kode PP 79-
mempunyai karetenoid dan pigmen D dan PP 91-A.
fotosintesis, tidak mempunyai vakuola gas,
tidak menyimpan sulfur dalam tubuhnya
metabolismenya memerlukan oksigen
Tabel 4.1 Morfologi koloni bakteri
Kode
No. Bentuk Permukaan Pinggiran Warna
Isolat
1 PP 127-A Bulat Mencembung basah Utuh Merah
2 PP 141-A Bulat Mencembung basah Utuh Merah
3 PP 146-A Titik-titik - Utuh Putih susu
4 PP 79-D Rizoid Melengkung basah Utuh Putih susu
5 PP 91-A Bulat Mencembung basah Utuh Putih susu

Tabel 4.2 Karakteristik isolat pada uji biokimia

Kecenderungan
Genus
No. Kode isolat Gram Bentuk

1 PP 127-A Negatif Batang AO * - Flavobacterium

2 PP 141-A Negatif Batang AO * - Flavobacterium
3 PP 146-A Negatif Kokus AO * * Lampropedia
4 PP 79-D Negatif Batang AF + - Halomonas
5 PP 91-A Negatif Batang AF + - Halomonas

Keterangan : AO=Aerob Obligat

AF=Anaerob Fakultatif
*=Uji tidak dilakukan
Genus Halomonas dapat diisolasi
dari berbagai habitat laut termasuk garam
hasil dari evaporasi air laut (Vreeland et al.,
1980 dalam Gandbhir et al., 1995 ). Genus
ini termasuk ke dalam Gram negatif
proteobacteria, yang tersebar luas di habitat
laut (Gauthier et al., 1992; dalam Gandbhir
et al., 1995). Pada penelitian yang dilakukan
oleh Gandbhir et al., 1995 diketahui bahwa
Halomonas elongata dapat tumbuh hingga
salinitas 30 %. Dari hasil penelitian
menunjukkan bahwa H. elongate dapat
hidup pada lingkungan halofil. Genus
Halomonas tidak hanya dapat beradaptasi
terhadap daerah dengan kadar garam yang
tinggi tetapi juga dapat cocok hidup pada
habitat laut dengan range dari air tawar,
payau hingga air laut dengan kadar garam
yang tinggi. Halomonas bahkan ditemukan
di pH hingga 11 ( Yang et al., 2010).
4.2 Uji degradasi
Uji degradasi adalah uji yang
dilakukan untuk mengetahui seberapa besar
kemampuan isolat bakteri untuk
mendegradasi selulosa. Uji degradasi
dilakukan dengan dua uji dan berbeda yang
dilakukan secara terpisah, yaitu uji
Hidrolisis Capacity (HC) dan uji degradasi
material selulotik dari daun rumput gajah
secara in vivo.
Uji HC dilakukan dengan
menggunakan medium padat Cellulose
Congo Red Agar (CCRA) yang mengandung
2 macam material selulotik yaitu
Carboxymethylcellulose (CMC) dan filtrat
dari serbuk daun rumput gajah. Ratio HC
menunjukkan kemampuan isolat bakteri
yang diperoleh dalam mendegradasi selulosa
yang diindikasikan dengan terbentuknya
zona bening. Ratio HC adalah perbandingan
antara diameter zona bening dengan
diameter koloni.
(Sudiana et al., 2002)
Menurut Zverlova et al.,., (2003), uji
degradasi dengan menggunakan metode
zona bening adalah uji semi semi-quantitatif,
karena data hanya berupa perbandingan
antara diameter zona bening dan dengan
diameter koloni. Kesulitan metode ini adalah
apabila bentuk koloni atau zona bening
yang dihasilkan tidak benar-benar
benar berbentuk
bulat, atau bahkan tidak bulat sama sekali.
Zverlova et al.,., (2003) juga menyebutkan
zona bening yang terbentuk terkait dengan
kelarutan dari enzim selulase. Semakin
tinggi tingkat kelarutan suatu enzim maka
akan semakin
emakin besar zona bening yang
terbentuk. Diameter zona bening umumnya
berukuran lebih besar dibandingkan dengan
diameter koloni, karena enzim selulase
disekresikan ke lingkungan sekitarnya oleh
bakteri pendegradasi selulosa. Bakteri tidak
dapat memasukkan molekul selulosa, karena
ukuran selulosa lebih besar daripada ukuran
sel bakteri.
Luas zona bening tergantung pada
konsentrasi CMC dan/atau agar yang
digunakan. Semakin banyak CMC dan/atau
agar yang digunakan semakin tinggi
kepadatan medium. Semakin tinggi
konsentrasi agar, semakin kecil pori-pori
pori
medium sehingga enzim selulase yang
disekresikan lebih sulit melewati pori-pori
pori
tersebut dan mengakibatkan terhambatnya
proses degradasi. Demikian pula sebaliknya.
Namun penggunaan agar pada medium yang
digunakan juga tidak boleh terlalu sedikit,
penggunaan agar dibawah 0,8%
menyulitkan proses isolasi bakteri (Hankin
and Anagnostakis, 1997), medium menjadi
terlalu lunak sehingga sulit untuk isolasi dan
inokulasi. Pada awal penelitian ini agar yang
semula digunakan adalah 0,5 %, namun
karena medium yang dihasilkan terlalu
lunak maka agar ditingkatkan menjadi
1,5%.
 Tabel 4.3 Ratio HC hari ke-1 hingga ke-7 masa inkubasi
Kode PP 127-A PP 141-A PP 146-A PP 79-D PP 91-A
Isolat

DZB DK HC DZB DK DZB DK DZB DK DZB DK

HC HC HC HC
(cm) (cm) (cm) (cm) (cm) (cm) (cm) (cm) (cm) (cm)

Waktu
(Hari)
1 2,5 0,9 2,8 4,3 1,2 3,6 3,4 1,5 2,3 9 8 1,1 2,0 0,6 3,3
2 2,8 1 2,8 4,7 1,3 3,6 3,7 1,9 1,9 9 8 1,1 2,0 0,8 2,5
3 2,8 1 2,8 5 1,5 3,3 4,1 2 2 9 8 1,1 2,4 0,8 3
4 3,3 1,1 3 5,1 1,5 3,4 4,2 2,1 2 9 8 1,1 2,6 0,9 2,9
5 3,5 1,2 2,9 5,3 1,6 3,3 4,3 2,1 2 9 8 1,1 2,7 1,1 2,5
6 3,5 1,2 2,9 5,5 1,7 3,2 4,6 2,2 2 9 8 1,1 2,9 1,2 2,4
7 5,2 1,4 3,7 6 1,9 3,2 6,1 2,5 2,4 9 8 1,1 4,5 1,5 3

Keterangan : DZB = Diameter Zona bening

DK = Diameter Koloni
HC = Hidrolysis Capacity
 Tabel 4.4 Hasil uji kemampuan bakteri selulotik melakukan degradasi material selulotik dari
daun rumput gajah setelah 7 hari inkubasi
Rata-rata penurunan berat kering
No. Kode isolat
dalam (%)
1 PP 127-A
2 PP 79-D
3 PP 146-A
4 PP 141-A
5 PP 91-A
6 Kontrol
Berdasarkan ratio HC pada hari ke-
7 masa inkubasi, isolat PP 127-A adalah
yang mempunyai kemampuan tertinggi
dalam mendegradasi CMC dan filtrat
serbuk daun rumput gajah yang kemudian
diikuti oleh isolat PP 141-A, PP 91-A, dan
PP 146-A (Tabel 4.3). Sedangkan untuk
isolat PP 79-D, ratio HC stabil dan lebih
kecil daripada isolat yang lain. Hal ini
mungkin karena dari hasil pengamatan
koloni, diketahui bahwa sejak hari ke-1
isolat PP 79-D sudah memenuhi cawan
Petri sehingga tidak ada lagi tempat yang
dapat digunakan untuk pertumbuhan
bakteri sampai akhir masa inkubasi. Hal
ini mengakibatkan hasil pengukuran
diameter zona bening dan koloni adalah
tetap. Ratio HC menjadi stabil dan lebih
kecil dibandingkan dengan isolat yang
lain. Morfologi koloni bakteri PP 79-D
adalah rizoid (menyerupai akar).
Selanjutnya uji yang kedua adalah
uji kemampuan bakteri isolat
mendegradasi material selulotik dari daun
rumput gajah (P. purpureum Shaum)
secara in vivo selama 7 hari. Hasil dari uji
ini ada di Tabel 4.4 dan Lampiran 10. Dari
Tabel 4.4 terlihat bahwa isolat PP 79-D
yang berberbentuk rizoid dan tidak
terdeteksi kemampuan uji HC mampu
mendegradasi selulosa secara in vivo.
Kemampuan isolat PP 79-D setara dengan
isolat PP 127-A. Isolat PP 127-A
menunjukkan hasil yang setara antar uji
HC dan uji in vivo. Hal ini diduga bahwa
isolat PP 127-A mampu menghasilkan
enzim selulase sama banyak dan aktif pada
pengujian di medium padat dan cair.
25
22
21
19
17
14
Tidak semua isolat bakteri yang
ratio HC-nya tinggi juga menunjukkan uji
in vivo yang tinggi seperti PP 141-A dan
PP 91-A. Hal ini diduga bahwa isolat
tersebut hanya dapat mendegradasi
material selulotik sederhana, seperti CMC.
CMC adalah molekul selulotik sederhana
bila dibandingkan dengan daun rumput
gajah. Pada medium yang digunakan untuk
uji HC, kandungan CMC lebih banyak dari
pada serbuk rumput gajah (2:1). Perbedaan
hasil yang diperoleh bukan hanya
disebabkan oleh perbedaan panjang
polimer selulosa saja tetapi lebih
dipengaruhi oleh struktur selulosa tersebut
(Hankin dan Anagnostakis, 1997).
Material selulotik alami merupakan
struktur komplek yang tersusun atas
selulosa, hemiselulosa, lignin dan
beberapa kelompok senyawa lain yang
bukan merupakan penyususun yang
predominan. Sanchez (2009) menyebutkan
rumput gajah (P. purpureum Schaum)
mengandung 23,9% lignin, 24%
hemiselulosa, 22% selulosa dan 6% abu
(ash).
Dari Tabel 4.4 ternyata pada
kontrol juga terjadi penurunan berat
kering. Klemm et al., 1998 menyebutkan
bahwa degradasi selulosa dapat terjadi
secara mekanik, kimia, panas dan radiasi.
Akumulasi dari mekanisme tersebut
diduga merupakan faktor adanya degradasi
yang cukup besar pada kontrol.
Mekanisme mekanik diduga terjadi karena
inkubasi dilakukan di shaking incubator
pada kecepatan 100 rpm. Mekanisme
degradasi kimiawi pada kontrol diduga
melalui hidrolisis dengan menggunakan
alkalin, karena Minimal Media (MM) yang
digunakan banyak mengandung garam dari
golongan tersebut diantaranya adalah
NaCl, MgCl.6H2O, CaCl2.2H2O, Na2SO4,
KH2PO4 dan KCl. Sedangkan penggunaan
MM sangatlah penting untuk pengujian
degradasi selulosa in vivo, karena
diharapkan sumber karbon dan energi
hanya berasal dari selulosa tersebut
(Ljungdahl and Eriksson, 1985).Pada
penelitian ini inkubasi dilakukan pada
suhu 45°C untuk memicu ekpresi enzim
selulase. Untuk menciptakan kondisi suhu
45°C tersebut shaker ditutup rapat dengan
kardus. Penggunaan lampu dop tersebut
diduga dapat memberikan efek radiasi,
walaupun gelas Erlenmeyer tempat proses
degradasi sudah ditutup dengan kertas
karbon.
PENUTUP
5.1 Kesimpulan
1. Pada penelitian ini diperoleh 5 isolat yaitu
PP 127-A, PP 141-A, PP 146-A, PP 79-D
dan PP 91-A yang cenderung masuk ke
dalam genus Flavobacterium (PP 127-A
dan PP 141-A), Lampropedia (PP 146-A),
dan Halomonas (PP 79-D dan PP 91-A).
2. Berdasarkan uji HC, isolat PP127-A adalah
isolat yang memiliki ratio HC tertinggi
kemudian berturut-turut diikuti oleh isolat
PP 141-A, PP 91-A, dan PP 146-A.
3. Isolat PP 127-A juga menunjukkan
penurunan berat kering terbanyak pada uji
in vivo, kemudian secara berturut-turut
diikuti oleh isolat PP 79-D, PP 146-A, PP
141-A,dan PP 91-A.
5.2 Saran
Pada penelitian ini masih banyak
aspek yang masih bisa dijadikan bahan
kajian pada penelitian yang lain. Aspek
yang dapat dijadikan bahan kajian antara
lain:
1. Seberapa besar isolat bakteri dapat
mendegradasi selulosa crystalline (serbuk
selulosa, contoh avicel, sigmacel).
2. Apakah isolat yang diperoleh dapat
mendegradasi selobiosa, selotriosa dan
oligoselulosa yang lain.
3. Bagaimana kemampuan isolat dalam
mendegradasi selulosa pada daun rumput
gajah setelah dilakukan delignifikasi.
4. Apakah isolat bakteri yang diperoleh
dapat mendegradasi lignin dan
hemiselulosa
DAFTAR PUSTAKA
Ahmed, Z., Banu, H., Rahman, M. M.,
Akhter F., and Haque M. S.
2001. Microbial activity on the
degradation of lignocellulosic
polysaccharides. Journal of
biological sciences. 1(10):993-
997.
Beguin, P. and Aubert, J. P. 1994. The
biological degradation of
cellulose. FEMS Microbiology
Reviews, 13, 25-58.
Benoit, L., Cailliez, C., Petitdemange, E.
& Gitton, J. (1992).Isolation of
cellulolytic mesophilic clostridia
from a municipal solid waste
digestor. Microbia. Ecology.,
23, 117-25.
Bhat, M. K. (2000). Cellulose and releted
enzymes in biotechnology.
Biotecnology advanteces, 18,
355-358.
Bhat, M.K. and S., Bhat. 1997. Cellulose
degrading enzymes and their
potensial industrial applications.
Biotechnology Advances, Vol.
15, Nos. 3/4, pp. 583~20, 1997.
Brock, T. D., Madigan, M. T., Martinko, J.
M., Parker, J. 1994. Biology
of microorganisms.
Prantice Hall, Englewood
Cliffs.
Brown, M. R. Jr. 1996. The biosynthesis
of cellulose. Journal macromol
science-pure applied chemistry.
A33:1345-1373.
C. Cailliez, C., Benoit, L., Gelhaye, E.,
Petitdemange, H., and Raval, G.
1993. Solubilization of cellulose
by mesophilic cellulolytic
clostridia isolated from a
municipal solid-waste digester.
Bioresource Technology, 43:77-
83
Cappuccino, J,G. dan Sherman, N. 2001.
Microbiology A Laboratory
Manual. San Fransisco,
Benjamin Cummings.
Claassen, P. A. M., et al. 1999. Utilisation
of biomassa for the supply of
energy carrier. Applied
microbiology and
biotechnology, 52, 741-755.
Colombatto, D. Mould, F. L., Bhat, M. K.,
Morgavi, D. P., Beauchemin, K.
A., and Owen, E. 2004.
Influence of fibrolytic enzymes
on the hydrolysis and
fermentation of pure cellulose
and xylan by mixed ruminal
microorganisms in vitro.
Ameciran society of animal
science. 81:1040-1050.
Coughlan, M. P. 1985. The properties of
fungal and bacterial cellulases
with comment on their
production and application.
Biotechnology Genetic
Engginering. Review, 3, 39-109.
Davies, G., and Henrissat. 1995. Structures
and mechanism of glycosyl
hydrolases. Structure. 3:853-
859.
Denman, S., Xue, G., and Patel, B. 1996.
Characterisation of
Neocallomastix patriciarum
cellulose cDNA (CelA)
homologus to Tricoderma reesei
cellobiohydrolase II. Applied.
Environ. Microbiol, 62:1889-
1896.
Dijkerman, R., Vervurem, M., Camp, H.,
and Drif, C. van der. 1996.
Adsorption characteristics of
cellulolytic enzymes from the
anaerobic fungus Piromyces sp.
Strain E2 on microcrystalline
cellulose. Applied. Environ.
Microbiol, 62:20-25
Dunca, S., Nimitan, E., Ailiesei, O.,
Stefan, M., Olteanu, Z. 2000.
Reports of University Iasi, Iasi,
Romania.
Dwijoseputro. (2005). Dasar-dasar
Mikrobiologi. Djambatan :
Malang
Eynde, H. A. D., Peer, Y. V. D. Perry, J.,
and Wachter, R. D. 1990. 5s
rRNA sequences of
representatives of the genera
Chlorobium,Prosthecochloris,
Thermomicrobium, Cytophaga,
Flavobacterium, Flexibacter
and Saprospira and a discussion
of the evolution of eubacteria in
general. Journal of General
Microbiology.136: 11-18.
Fanutti, C., Ponyi, T., Black, G.,
Hazlewood, G., and Gilbert, H.
1995. The conserved
noncatalytic 40-residue
sequence in celluloses and
hemicelluloses from anaerobic
fungi functions as a protein
docking domain. Journal
Biology Chemistry. 270:29314-
29322.
Ferrera, I.R., Massana, R., Casamayor,
E.O., Balague´ , V., Pedro´ s-
Alio´ , C., Mas, J., 2004. High
diversity biofilm for the
oxidation of sulfidecontaining
effluents. Applied Microbiology
and Biotechnology.64:726–734.
Glazer, A. N., and Nikaido, H. 2007.
Microbial biotechnology:
fundamentals of applied
microbiology, second edition.
Cambridge:USA
Gonggo, B. M., Hermawan, B., and
Anggraeni, D. 2005. Pengaruh
jenis tanaman penutup dan
pengolakan tanah terhadap sifat
fisika tanah pada lahan alang-
alang. Jurnal ilmu-ilmu
pertanian Indonesia. 7(1):44-55.
Han, Ye Jun and H. Z., Chen. 2007.
Synergism between corn stover
protein and cellulose. Enzyme
and microbial technology,
41,638-645.
Handayani, I. P. 2002. Laporan penelitian
pendayagunaan vegetasi invasi
 dalam proses agradasi tanah Hendricks, C.W., J.D. Doyle and B.
untuk percepatan restorasi Hugley, 1995. A new solid
lahan kritis. Lembaga penelitian media for enumerating
Universitas Bengkulu, cellulose-utilizing Bacteria in
Bengkulu. soil. Environmental research
Hankin, L., and Anagnostakis, S. L. 1997. laboratory, u.s. Environmental
Solid media containing protection agency,1 and
carboxymethylcellulose to mantech environmental
detect Cx cellulase activity of technology, inc.,2 corvallis:
microorganisms. Journal of Oregon
general microbiology. 98:109- Hengstmann, U., Chin, K-J., Janssen, P.H.,
115. Liesack, W., 1999. Comparative
Hankin, L., Sands, D. C., and Hill, D. E. phylogenetic assignment of
(1974). Relation of land use to environmental sequences of
some degradative enzymatic genes encoding 16S rRNA and
activities of soil bacteria. Soil numerically abundant culturable
Science:118: 38-44. bacteria from an anoxic rice
Harley dan Prescott. 2002. Laboratory paddy soil. Applied and
Exercises in Microbiology. Environmental Microbiology.
McGraw-Hill Company. 65:5050–5058.
Haruta, S., Cui, Z., Huang Z., Li, M., Holt, J.G. 1994. Bergey’s Manual of
Ishii, M. and Igarashi, Y. 2002. Determinative Bacteriology
Construction of a stable microbial ninth ed. Williams and Wilkins:
community with high cellulose- USA
degradation ability. Applied Jeschu, L. 1995. Celulaze de origine
Microbiol Biotechnol, 59:529– microbiana. St. cerc. Biochim.
534 38:65-78.
Hatami, S., Alikhani, H. A., Besharati, H., Kim, C. H., and Kim, D. S., 1995.
Salehrastin, N., Afrousheh, M., Purification and specificity of a
and Jahromi, Y. Z. 2008. specific endo-β-D-glucanase
Investigation on aerobic (Avicelase II) resembling exo-
cellulolytic bacteria in some of cellobiohydrolase from Bacillus
north forest and farming soils. circulans. Enzyme and
American-Eurasian J. Agric. & Microbial Technology, 17: 248-
Environ. Sci. 3 (5): 713-716 254.
Hatfield, R. D. 1993. Cell wall Klemm, D., Philipp, B., Heinze, T.,
polysaccharide interactions and Heinze, U., Wagesknecht. 1998.
degradability. Pages 285-314 in Comprehensive cellulose
forage cell wall structure and chemistry, volume 1:
degesbility. H. G. Jung, D. R. fundamentals and analytical
Buxton, R. D. Hatfield, and J. methods. Germany:Wiley-VCH.
Ralph, (ed).ASA-CSSA- Krause, D. O., Denman S. E., Mackie R.
SSSA,Madison, WI. I., Morrison, M., Rae, A. L.,
Heinze, T. 2005. Carboxymethyl ethers of Attwood, G. T., and
cellulose and starch-a review. MacSweeney, S. C. 2003.
Center of excellence for Opportunities to improve fiber
polysaccharide research, degradation in rumen:
Friedrich Schiller University, microbiology, ecology, and
Germany. genomics. FEMS Microbiology
Reviews 27:663-696.
Landy, E. T., Mitchella, J. I., Hotchkissa,
S., and Eatona, R. A. 2008.
Bacterial diversity associated
with archaeological waterlogged
wood: Ribosomal RNA clone
libraries and denaturing gradient
gel electrophoresis (DGGE).
International Biodeterioration
& Biodegradation.61:106–116.
Lay, B. 1994. Analisis Mikroba di
Laboratorium. Raja Grafindo
Persada. Jakarta.
Lee, Y.H., and L.T., Fan. 1982. Kinetic
studies of enzymatic hydrolysis
of insoluble cellulose : (II).
Analysis of extended hydrolysis
time. Biotechnology
Bioengginering, 25,939-66.
Lehninger, A. L. 1982. Dasar-dasar
biokimia jilid 1. Jakarta:
Erlangga.
Levin, D. B., Carere C. R., Cicek R., and
Sparling R. 2009. Challenges for
biohydrogen production via
direct lignocellulose
fermentation. International
journal of hydrogen energy,
34:7390–7403.
Linder, M., and Teeri, T. 1997. The role
and fungtion of cellulose-
binding domains. Journal
Biotechnology, 57:15-28.
Ljungdahl, L. G. and Eriksson, K. E. 1985.
Ecology of microbial cellulose
degradation. In: Marshall (Ed).
Advances in microbial ecology
vol 8.
Llobet-Brossa, E., Rosello´ -Mora, R.,
Amann, R., 1998. Microbial
community composition of
Wadden sea sediments as
revealed by fluorescence in situ
hybridisation. Applied and
Environmental
Microbiology.64:2691–2696.
Lo, Y. C., Saralate, G. D., Chen, W. M.,
Bai, M. D., and Chang, J. S.
2009. Isolation of cellulose-
hydrolytic bacteria and
applications of the cellulolytic
enzymes for cellulosic
biohydrogen production.
Enzyme and microbial
tehnology, 44:417–425
Lu, W.J., Wang, H., Yang, S., Wang, Z.
and Nie, Y. 2005. Isolation and
Characterization of Mesophilic
Cellulose-Degrading Bacteria
From Flower Stalks- Vegetable
Waste Co-Composting System.
J.Gen.Appl.Microbiol. 51: 353-
360
Mandels, M. 1985. Aplication of
cellulases. Biochem Society
Trans., 13, 414-16.
Matsui, H., Ushida, K., Miyazaki, K., and
Kojima, Y. 1998. Use of ratio of
digested xylan to digested
cellulose (X/C) as an index of
fiber digestion in plant cell-wall
material by ruminal
microorganisms. Animal feed
science technology, 71:207–215.
Mattinen, M. L. 1998. Structural and
functional studies of fungal
cellulose binding domain by
NMR spectroscopy. Academic
dissertation from University of
Helsinki, Finland.
McCammon, S.A., and Bowman, J.P.,
2000. Taxonomy of Antarctic
Flavobacterium species:
description of Flavobacterium
gillisae sp. nov.,
Flavobacterium tegetincola sp.
nov. and Flavobacterium
xanthum sp. nov. mon. rev. and
re-classification of
[Flavobacterium] salengens as
Salegentibacter salegens gen.
nov., comb. nov. International
Journal of Systematic
Bacteriology.50:1055–1063.
Moracci, M., Ponzano, B. C., Trincone,
A., Fusco S., De Rosa, M., Van
der Oost, J., Sense C. W.,
Carlobois R. L., and Rossi, M.
2000. Identification and
molekuler characterization of
the first alpha –Xylosidase from
 an Archaeon. J. Biol. Chem. under varying osmotic pressure.
275:22082-22089. Anim feed science
Mulcahy. 1996. An investigation of technology,41:65-72.
cellulose Binding Domain in Sjostrom, E. 1995. Kimia kayu, dasar-
non-celululose binding domains dasar dan penggunaan. edisi
in non-cellulolytic enzymes. kedua. Yogyakarta: Gajah Mada
Final year project university of University Press.
Limerick. Srinivasan, M. C., 1992. Lignocelluloses
O’Sullivan, L.A., Weightman, A.J., Fry, biotechnology: Recent advance
J.C., 2002. New degenerate and technology prospects.
Cytophaga–Flexibacter- In:New trends abiotechnology.
Bacteroides-specific 16S R. N. S. Subba, C. Balagopalan
ribosomal DNA-targeted and S. V. Ramakrishna (Ed). Pp
oligonucleotide probes reveal 315-320. Oxford and IBH
high bacterial diversity in river publishing Co. Pvt. Ltd., New
Taff epilithon. Applied and Delhi, India.
Environmental Strezos, V., J. E. Tim, H., Cris. 2008.
Microbiology.68:201–210. Thermal conversion of elephant
Okaraonye, C. C., and Ikewuchi, J. C. grass (Pennisetum Purpureum
2009. Nutritional and Schum) to bio-gas, bio-oil and
antinutritional components of charcoal. Bioresource
Pennisetum purpureum Technology, 99 (2008) 8394–
Schumach. Pakistan journal of 8399.
nutritional 8(1): 32-34. Sudiana, I. M., Kanti, A., Rahmansyah,
Palonen, H. 2004. Role of lignin in the M., Widawati, S., Suliasih,
enzymatic hydrolysis of Rahayu R. W., and Imanuddin,
lignocelluloses. Disertation at H. 2002. Populasi dan
University of karakterisasi bakteri selulotik
Technology.Helsinki Finland. yang diisolasi berbegai
Rodrigues, M. A. M., Cone, J. W., van ketinggian lokasi di taman
Gelder, A. H., Sequieria, J. C., nasional gunung Halimun.
and Fonseca, A. M. 2003. The Laporan teknik proyek
effect of cellulose crystallinity inventarisasi dan karakterisasi
on the in vitro digestibility and sumberdaya hayati, Puslit
fermentation kinetics of biologi-LIPI, Indonesia.
meadow hay and barley, wheat Sun, Y., and J., Cheng. 2002. Hydrolysis
and rice straws. Journal of the of lignocelluloses material for
science of food and ethanol production: a review.
agriculture,83:652-657. Bioresource technology, 83, 1-
Sanderson, M. A. and R. A., Paul. 2008. 11.
Perennial forages as second Tjitrosoepomo, G. 2004. Taksonomi
generation bioenergy crops. tumbuhan (spermatophyta).
International Journal of Yogyakarta: Gajah Mada
Molecular Sciences, 9, 768-788. University Press.
Schlegel, H. G. 1994. Mikrobiologi Umum Tomme, P., Waren, R., Miller, R., Kilburn,
edisi keenam. Yogyakarta : D., and Gilkes, N. 1995.
Gajah Mada University Press. Cellulose binding domains:
Sequeira, C. A., and Sequeira, J. C. 1993. Clasification and properties. In:
Bacterial adhesion to fibre Saddler. J., and Penner M. (Ed).
during in vitro degradations Enzymatic degradation of
 insoluble carbohydrates. pada 10 Juni 2010 pada pikul
American chemical society, 19.09 WIB
Washington DC, 618:143-163. Yang, C., Niu, Y., Su, H., Wang, Z., Tao,
Varnaite, R., Paskevicius, A., and F., Wang, X., Tang, H., Ma, C.,
Raudoniene, V. 2008. Cellulose and Xu, P. 2010. A novel
degradation in rye straw by microbial habitat of alkaline
micromycetes and their black liquor with very high
complexes. Ekologija 54 (1): pollution load: microbial
29-31. diversity and the key members
Walker, L. P., and D.B. Wilson. 1991. in application potentials.
Enzymatic hydrolysis of Bioresaouce technology.
cellulose: an overview. 101:1737-1744.
Bioresource Technology, 36 Yang, V. C., Linhardt, R. J., Bernstein, H.,
(1991) 3-14. Cooney, C. L. and Langer, R.
Widdel, F., and F. Bak. 1992. Gram- (1985) Purification and
negative mesophilic characterization of heparinase
sulfatereducing bacteria, p. from Flavobacterium
3352-3378. In A. Balows, H. G. heparinum. J. Biol. Chem.260,
Truper, M. Dworkin, and K.-H. 1849-1857.
Schleifer (ed.), The prokaryotes, Zhang Y. H. P., and Lynd, R. L. 2004.
2nd ed., vol. IV. Springer- Kinetics and relative importance
Verlag, New York. of posphorylytic and hydrolytic
William R. and N. S., Govind. 2003. cleave of cellodextrins and
Identification of carbohydrate cellobiose in cell extracts of
degrading bacteria in sub-tropical Clostridium thermocellum.
regions. Rev. Biol. Trop., 51, Appl. Environ. Microbiol. 70:
Supl. 4: 205-210. 1563-1569.
Wilson, J. R. and Mertens, D. R. 1995. Zverlova, V. V., Holl, W., and Schwarz,
Cell wall accessibility and cell H. 2003. Enzymes for digestion
structure limitations to microbial of cellulose and other
digestion of forage. Crop sci. polysaccharides in the gut of
35:251-259. longhorn beetle larvae, Rhagium
Wood, T. M. 1985. Properties of inquisitor L. (Col.,
cellulolytic enzyme systems. Cerambycidae). International
Biochem Society Trans, 13, 407- biodeterioration &
10. biodegradation. 51:175–179.
Woodard, K.R., and G.M., Prine, 1993.
Dry matter accumulation of
elephantgrass, energycane and
elephantmillet in a subtropical
climate. Crop Science, 33, 818–
824.
www. flickr.com Diakses pada tanggal 5
Januari 2009 pukul 21.13 WIB
www.astbury.leeds.ac.uk/history/astbury1
8.htm diakses pada 10 Juni 2010
pada pukul 18.15 WIB
www.biomassmagazine.com/images/uploa
d/20080403103622.jpg diakses