Sumber alami: bakteri asam laktat (BAL), 'tapai pulut', 'tempe', 'tempoyak' dan

'fu yu'
Bagaimana cara isolasi
Sebanyak 10 g sampel makanan dicampur dengan 90 mL air yang dilindungi oleh
pepton dan diinkubasi pada suhu kamar selama 30 menit. Pengenceran beberapa
kali lipat dilakukan secara teratur di luar ruangan dari 10 hingga 1 − 10. Volume
10 μm dari sampel yang dimasukkan ke dalam pelat lebar, MR, Rogosa, dan
lempeng yang disesuaikan dengan suhu. MRS agar adalah media selektif untuk
pertumbuhan BAL. Setelah inkubasi, koloni-koloni dengan morfologi yang
berbeda dipilih secara acak, diberi pewarnaan Gram yang dilaminasi
untukselorfologi di bawah mikroskop optik.
Pemeliharaan dan persiapan isolat bakteri Setiap isolat LAB diawetkan dalam 20%
(v / v) gliserol dan disimpan dalam freezer −20 ° C sampai digunakan. Awalnya,
isolat tetap aktif melalui subkultur dengan pipet 0,2 mL kultur aktifke
10mLMMRKulur, diikuti oleh inkubasi pada suhu 37 ° C hingga 72 jam sebelum
dan sesudah budidaya. Jika tidak ada pertumbuhan, 0,2 mL stok gliserol
diinokulasi dalam 10 mL kaldu MRS dan diinkubasi pada suhu 37 ° C selama 24
jam. Kemudian, empat titik garis dilakukan pada agar MRS untuk memastikan
tidak ada kontaminasi terjadi. Koloni murni tunggal dipilih dan diinokulasi dalam
10 mL kaldu MRS dan diinkubasi pada suhu 37 ° C selama 24 jam, diikuti oleh
subkultur lain dalam 10 mL kaldu MRS dan inkubasi pada suhu 37 ° C selama 24
jam, membentuk LAB lama aktif 24-jam. Dua hari sebelum pengujian, 0,2 mL
isolat BAL aktif diinokulasi dalam 10 mL kaldu MRS pada suhu 37 ° C selama 24
jam dan disubkultur sekali lagi untuk membentuk BAL 24-jam aktif yang siap
digunakan. Persiapan crudeenzymes Enzim kasar yang diproduksi oleh isolat LAB
disiapkan segar sebelum digunakan. Sebanyak 2% (v / v) LAB 24-jam (rata-rata
OD600nm = 0,713) diinokulasi dalam 10mL kaldu MRS dan diinkubasi pada suhu
37 ° C selama 24 jam. Supernatan bebas sel (CFS) yang mengandung enzim kasar
dikumpulkan dengan sentrifugasi kultur bakteri pada 10000g selama 10 menit pada
4 ° C danwaskeptinicetill digunakan.

Apa saja yang dikarakterisasi, bagaimana metodenya

Skrining untuk produsen enzim Amylaseactivityassay Uji ini diadaptasi dari
metode oleh Zhang dan Zeng (2007) untuk mengevaluasi aktivitas amilase dari
crudeenzymes dari isolat LAB. Dalam pengujian ini, 1-kali lipat, 2 kali lipat dan
10 kali lipat CFS diencerkan digunakan sesuai untuk mendapatkan pembacaan
absorbansi kurang dari 2,5. Pati (1g / 100 mL; Bendosen) digunakan sebagai
substrat dan α-amilase (16 unit / mg padatan; Sigma-Aldrich) digunakan sebagai
kontrol positif. Campuran reaksi dibuat sesuai dengan Tabel 1. Campuran reaksi
diinkubasi pada suhu 37 ° C selama 30 menit, dan reaksi enzimatik dihentikan oleh
rendaman usinganice. Total 0, 3 mL, 3, 3, 3, 3,, dinitrosalisilat, asam (DNS)
ditambahkan ke campuran reaksi dan campuran dipanaskan selama 5 menit dalam
penangas air 90 ° C. Reaksi itu kemudian dihentikan menggunakan penangas es.
Kemudian, 0,2 mL campuran reaksi dipipet ke dalam pelat 96-sumur dan diukur
absorbansi pada panjang gelombang 550nm menggunakan pembaca
FluostarOPTIMAmicroplate. Kurva standar maltosa dihasilkan untuk menghitung
jumlah gula pereduksi dalam campuran reaksi. Satu unit amilase didefinisikan
sebagai aktivitas enzimatik yang membebaskan satu mikrogram maltosa per menit
per mililiter CFS. Kecepatan awal (V0) dari enzim kasar untuk membebaskan satu
mikromolofal dari perminutepermillilitreCFS ditentukan.Cellulaseactivityassay
Assay ini diadaptasi dari metode oleh Wood dan Bhat (1988) untuk mengevaluasi
aktivitas selulase enzim kasar dari isolat LAB. Dalam pengujian ini, 1 g / 100 mL
karboksimetil selulosa (CMC; Sigma-Aldrich) dilarutkan dalam 0,05 M glycine /
NaOH buffer (pH 9) dan digunakan sebagai substrat. Campuran reaksi dibuat
sesuai dengan Tabel 1. Campuran reaksi diinkubasi pada suhu 37 ° C selama 30
menit, dan reaksi enzimatik dihentikan dengan menggunakan penangas es. Total
0,36 mL DNS ditambahkan ke campuran reaksi dan campuran dipanaskan selama
5 menit dalam penangas air 90 ° C. Reaksi itu kemudian dihentikan menggunakan
penangas es. Kemudian, 0,2 mL campuran reaksi dipipet ke dalam lempeng 96-
sumur dan diukur absorbansi pada panjang gelombang 550nm menggunakan
FluostarOPTIMAmicroplate reader. Kurva standar glukosa dihasilkan untuk
menghitung jumlah gula pereduksi dalam campuran reaksi. Satu unit selulase
didefinisikan sebagai aktivitas enzimatik yang membebaskan satu mikrogram
glukosa per menit per mililiter CFS. V0 enzim kasar untuk membebaskan satu
mikromol glukosa per menit per mililiter CFS ditentukan. Kontrol positif tidak
tersedia karena keterbatasan sumber daya di laboratorium.Proteaseactivityassay Uji
ini diadaptasi dari metode oleh Kanekar et al. (2002) untuk mengevaluasi aktivitas
protease dari enzim kasar dari isolat LAB. Dalam pengujian ini, 0,6 g / 100 mL
kasein (SigmaAldrich) dilarutkan dalam 0,4 M Tris-HCl buffer (pH 9) dan
digunakan sebagai substrat. Campuran reaksi dibuat sesuai dengan Tabel 1.
Campuran reaksi diinkubasi pada suhu 37 ° C selama 30 menit, dan reaksi
enzimatik diakhiri dengan menambahkan 0,5 mL asam trikloroasetat 5 g / 100 mL
Apa hasil karakteriasi nzimnya
Isolasi LAB dari makanan yang difermentasi Sebanyak 12 LAB diisolasi dari
empat makanan yang difermentasi, dua isolat dari 'tapai pulut' (TAP1–2), empat
isolat dari 'tempe' (TEM1–4), tiga isolat dari 'tempoyak' (TYK1) –3) dan tiga isolat
dari 'fu yu' (FY1-3). Namun, hanya 7 dari 12 masih layak setelah subkultur
berulang, maka hanya TAP2, TEM1, TEM2, TYK2, TYK3, FY2 dan FY3 dipilih
untuk penyaringan awal produsen enzim. Hilangnya viabilitas untuk lima isolat ini
bisa disebabkan oleh dua faktor, (i) media selektif (MRS) yang digunakan tidak
menyediakan nutrisi yang dibutuhkan dan (ii) perubahan dalam lingkungan
pertumbuhan. Temuan ini mirip dengan yang dilaporkan oleh Birollo, Reinheimer
dan Vinderola (2000) menunjukkan bahwa MRS dapat menunjukkan jumlah
bakteri yang dapat hidup dan ada alternatif lain yang sesuai untuk menumbuhkan
BAL. Selain itu, isolat BAL lainnya mungkin dalam bentuk unik dari keadaan aktif
tetapi tidak dapat dibiakkan, di mana mereka tidak dapat dikultur pada media
mikrobiologis rutin tetapi masih layak (Fakruddin, Mannan dan Andrews, 2013).
Dengan demikian, isolat LAB kemungkinan besar tidak dapat menyesuaikan diri
dan tumbuh terus menerus dalam kaldu MRS. Ini mungkin karena faktor
lingkungan yang tidak menguntungkan seperti kelaparan, pH tidak optimal atau
lainnya (Pinto, SantosandChambel, 2015).
Aktivitas theamylase ofisolate FY3 menduduki peringkat tertinggi, diikuti oleh
FY2 dan TEM1 (Tabel 3). Temuan ini menarik karena ketiga isolat ini tidak
diisolasi dari sumber makanan kaya karbohidrat ('fuyu' dan 'tempe'), sedangkan
isolat dari sumber makanan kaya karbohidrat ('tapai' dan 'tempoyak') seperti TAP2,
TYK2 dan TYK3 lakukan. tidak menunjukkan tingkat aktivitas amilase yang
tinggi. Demikian pula, aktivitas selulase FY3 juga peringkat tertinggi, diikuti oleh
FY2 dan TEM1 (Tabel 3). Koefisien uji Pearson menunjukkan bahwa ada
hubungan positif yang positif (r2 = +0.979) antara aktivitas amilase dan selulase di
semua isolat LAB. Temuan ini menunjukkan bahwa produksi amilase dan selulase
dapat dikorelasikan. Namun, sepengetahuan penulis,
norelevantpublishedliteraturditemukan. Semua isolat BAL adalah produsen
protease yang baik seperti yang terlihat pada Tabel 3. Aktivitas protease dari
semua isolat setidaknya2 kali lipat lebih tinggi dari aktivitas amilase dan selulase
dalam kondisi pengujian. Namun, tidak ada perbedaan signifikan dalam aktivitas
protease yang diamati antara isolat. Temuan ini sesuai dengan penelitian oleh Shin
et al. (2008), di mana BAL dari genus Pediococcus dan Enterococcus
menunjukkan aktivitas amilase dan selulase yang tinggi tetapi tidak menunjukkan
perbedaan signifikan dari aktivitas protease dibandingkan dengan bakteri lain.
Oleh karena itu, dua produsen teratas untuk amilase dan selulase yang diisolasi dari
‘fu yu' — FY2 dan FY3 dipilih untuk identifikasi lebih lanjut dan
ujienzenzekinetika.