Peran Bakteri Anaerob dan Oral terhadap

Pneumonia pada Komunitas

Abstrak
Latar Belakang
Terapi biologi molekuler dengan tingkat deteksi yang lebih baik selama ini telah
diterapkan untuk mengetahui penyebab penyakit menular yang disebabkan oleh
bakteri. Sekitar 10-48% patogen dari bakteri yang menyebabkan pneumonia
pada komunitas tidak teridentifikasi menggunakan metode kultivasi
konvensional. Studi ini mengevaluasi penyebab oleh bakteri terhadap
pneumonia pada komunitas menggunakan analisis clone library kultivasi mandiri
(cultivation-independent clone library analysis) terhadap gen RNA ribosom 16S
dari jaringan bronchoalveolar lavage, dan membandingkan hasilnya dengan
metode kultivasi konvensional.

Metode
Pasien dengan pneumonia pada komunitas dilibatkan berdasarkan fakta klinis
dan radiologinya. Jaringan bronchoalveolar lavage dikumpulkan dari lesi
patologis paru menggunakan bronkoskopi dan dievaluasi oleh metode molekuler
kultur mandiri (culture-independent) dan metode kultivasi konvensional. Pada
metode molekuler kultivasi mandiri, sekitar 600 pasangan basa (base pairs) pada
gen RNA ribosom 16S diperbesar menggunakan reaksi rantai polimerase dengan
primer universal, diikuti dengan konstruksi clone libraries. Urutan nukleotida dari
96 klon yang dipilih secara acak untuk setiap jaringan ditetapkan, dan homologi
bakteri diidentifikasi. Metode kultivasi konvensional, termasuk kultur anaerob,
dilakukan dengan menggunakan jaringan yang sama.

Hasil
Selain patogen dari pneumonia pada komunitas yang telah diketahui secara
umum [Streptococcus pneumoniae (18,8%), Haemophilus influenzae (18,8%),
Mycoplasma pneumoniae (17,2%)], analisis molekuler terhadap jaringan pada 64
pasien dengan pneumonia pada komunitas menunjukkan tingkat anaerob yang
relatif lebih tinggi (15,6%) serta bakteri oral (15,6%) dibandingkan dengan
beberapa penelitian sebelumnya.

Kesimpulan
Penelitian ini menunjukkan bahwa bakteri anaerob dan oral lebih sering
terdeteksi pada pasien dengan pneumonia pada komunitas dari temuan yang
diyakini sebelumnya. Terdapat kemungkinan bakteri ini memainkan peran yang
lebih signifikan terhadap pneumonia pada komunitas.
Pendahuluan
Pneumonia menjadi penyebab kematian keenam dan ketiga di Indonesia,
Amerika Serikat dan Jepang, di mana 14,3 / 100.000 dan 98,9 / 100.000 orang
meninggal karena penyakit per tahun, masing-masing [1,2]. Pneumonia juga
merupakan penyebab utama kematian pada orang tua (0,80 tahun) dikedua
negara [1,2]. Diperkirakan kematian tersebut akan meningkat pada populasi yang
menua.
Pemahaman yang tepat tentang pathogen penyebab pneumonia sangat
penting untuk mencapai diagnosa yang cepat dan untuk menentukan perawatan
antimikroba yang tepat. Namun menurut laporan sebelumnya, 10 -48% dari
penyebab yang didapat masyarakat pneumonia (CAP) secara etiologis tidak
diketahui ketika dahak dan kultivasi darah dilakukan dalam kombinasi dengan
serologis tes dan tes untuk mendeteksi antigen kemih [3-9]. Sebagai tambahan,
insiden anaerob yang relative rendah telah dilaporkan sebagai bakteri penyebab
(0-5,5%) [3-9]. Berspekulasi bahwa bakteri yang kurang berbudaya, seperti
anaerob dan flora Bakteri oral, dan mereka dianggap asli dan cenderung
diabaikan dalam sampel dahak dalam pengaturan klinis biasa, mungkin
bertanggung jawab atas etiologi bakteriologis yang tidak diketahui pada CAP.
Namun, inkubasi sampel di piring agar di bawah kondisi anaerob di laboratorium
mikrobiologi klinis tidak biasa dilakukan.
Baru-baru ini, microbiota dari saluran pernapasan bagian bawah pada
pasien dengan infeksi paru, seperti unit perawatan intensif pneumonia [10],
cystic fibrosis [11] dan berhubungan dengan ventilator pneumonia (VAP) [10],
dipelajari menggunakan 16S ribosomal RNA (rRNA) amplifikasi gen diikuti oleh
metode klon perpustakaan.
Sebelumnya kami melaporkan utilitas diagnostik klon perpustakaan
analisis gen 16S rRNA menggunakan lavage bronchoalveolar (BAL) cairan untuk
informasi bakteriologis pada pasien dengan pneumonia yang disebabkan oleh
Legionella sp. [16] dan Leptotrichia sp. [17]. Metode molekuler ini dapat
mendeteksi filotipe 16S urutan gen rRNA adalah yang paling mirip dengan tipe
gen strain, dan dapat menentukan rasio filotipe (flora bakteri) disetiap spesimen
dengan cara yang bebas kultivasi.
Utilitas diagnostik kultur cairan BAL menggunakan serat optik
bronkoskopi dengan tingkat deteksi lebih tinggi daripada sampel dahak di
Indonesia pasien CAP juga dilaporkan [18].
Berdasarkan hasil penelitian, kami melakukan bronkoskopi untuk
mengevaluasi pathogen penyebab pada pasien CAP, dan spesimen BAL dianalisis
oleh kedua analisis molekuler mikrofloral dari 16S gen rRNA dan metode kultivasi
biasa, dalam kombinasi dengan tes serologis dan deteksi antigen kemih.
Metode
Enam puluh empat pasien CAP berturut-turut di rumah sakit universitas
kami dan rumah sakit rujukan antara April 2010 dan Desember 2011 terdaftar
dalam penelitian ini. Bronkoskopi dilakukan untuk mengevaluasi patogen
penyebab dalam lesi pneumonia ini pasien. CAP didefinisikan sesuai dengan
Penyakit Menular Society of America (IDSA) / American Thoracic Society (ATS)
pedoman untuk mendiagnosis CAP pada orang dewasa [19]. Penelitian ini tidak
termasuk pasien dengan pneumonia terkait perawatan kesehatan (HCAP) dan
pneumonia yang didapat di rumah sakit (HAP) [20]. Penelitian ini disetujui oleh
Komite Peninjau Etika Manusia dan Hewan dari Universitas Universitas
Kesehatan Kerja dan Lingkungan, Jepang (No.09-118). Informed consent tertulis
diperoleh dari keduanya pasien atau wali mereka. Jika pasien berusia di bawah
20 tahun tua, orang tua mereka memberikan persetujuan tertulis pada mereka
kepentingan. Informasi pasien yang dikumpulkan sebagai berikut : usia, jenis
kelamin, manifestasi klinis dan laboratorium dan temuan radiologis.
Tabel 1. Gambaran klinis dan laboratorium pasien dengan pneumonia yang didapat dari komunitas

Pasien (n = 64) IIPs (n = 30)

Usia(y); mean 6 SD [rata- 63.2620.7 [16–91] 61.4620.0 [16–80]

rata]
Jenis Kelamin Perempuan; n (%) 31 (48.4) 10 (33.3)
Laki-laki; n (%) 33 (51.6) 20 (66.7)
Penyakit penyerta Penyakit paru kronis; n (%) 13 (20.3) 2 (6.7)
Asma Bronchial; n (%) 3 (4.7) 1 (3.3)
Keganasan; n (%) 9 (14.1) 5 (16.7)
Penyakit serebrovascular; n (%) 5 (7.8) 1 (3.3)
Diabetes mellitus; n (%) 14 (21.9) 5 (16.7)
Penyakit Kolagen; n (%) 2 (3.1) 0 (0.0)
Penyakit Jantung; n (%) 5 (7.8) 7 (23.3)
Penyakit Ginjal; n (%) 6 (9.4) 1 (3.3)
Bukan penyakit penyerta; n (%) 20 (31.3) 14 (46.7)
Immunosupresi; n (%) 10 (15.6) 1 (3.3)
Dua atau lebih penyertaan; n (%) 19 (29.7) 6 (20.0)
Parameter klinis Gangguan orientasi (kebingungan); n (%) 8 (12.5) 1 (3.3)
Suhu badan ,35uC or .40uC; n (%) 3 (4.7) 0 (0.0)
Systolik BP,90 mmHg or diastolik BP#60 n (%) 1 (1.6) 1 (3.3)
mm Hg;
Denyut nadi $125 denyut/min; n (%) 7 (10.9) 1 (3.3)
Tingkat pernapasan $30 detak/min; n (%) 11 (17.2) 6 (20.0)
SpO2#90%, PaO2$60 Torr; n (%) 13 (20.3) 7 (23.3)
Temuan laboratorium BUN $10.7 mmol/L; n (%) 6 (9.4) 3 (10.0)
Na ,130 mEq/ml; n (%) 1 (1.6) 0 (0.0)
Glukosa $13.9 mmol/L; n (%) 5 (7.8) 2 (6.7)
Hematocrit ,30%; n (%) 4 (6.3) 2 (6.7)
Temuan radiografi Keterlibatan satu zona; n (%) 26 (40.6) 6 (20.0)
Keterlibatan dua atau lebih zona, tidak (%) 6 (9.4) 5 (16.7)
bilateral
Keterlibatan Bilateral paru; n (%) 32 (50.0) 19 (63.3)
Pleural efusi; n (%) 7 (10.9) 2 (6.7)
 BUN; blood urea nitrogen, IIPs; Idiopathic interstitial pneumonias, SD;
standard deviation. doi:10.1371/journal.pone.0063103.t001

Table 2. Perbandingan dari bakteri terdeteksi antara kultur konvensional dan metode molekuler dari cairan
bronchoalveolar lavage

Cairan Bronchoalveolar Lavage

Nomor Sel Hasil dari analisis klon perpustakaan dari

Kas No. Usia/J. (Sel/ml) kultur gen 16S ribosomal RNA Penanaman dahak
us kelamin
Filotipe dominan (klon/klon, %)

1 81 M 1.56106 Streptococcus oralis Streptococcus oralis 13/69, 18.8% Tidak dianalisis

2 80 M 1.56108 Streptococcu pneumoniae Haemophilus Streptococcus pneumoniae 65/65, 100% Tidak dianalisis
s influenzae ,
3 80F 4.96106 Streptococcus pneumonia Streptococcus pneumoniae 83/88, 94.3% Streptococcus
e pneumoniae
4 59F 6.26107 Tidak Prevotella tannerae 33/77, 42.9% Tidak dianalisis
tumbuh
5 88F 1.66106 Tidak Haemophilus influenzae 71/77, 92.2% Tidak dianalisis
tumbuh
6 24F 9.76106 bakteri oral# Mycoplasma pneumoniae 83/91, 91.2% bakteri oral
7 74 M 1.96107 Streptococcus pneumonia Streptococcus pneumoniae 93/93, 100% Streptococcus
e pneumoniae
8 29 M 9.86106 Tidak Prevotella melaninogenica 36/91, 39.6% Bakteri Oral
tumbuh
7
9 83 M 7.1610 Streptococcus pneumonia Streptococcus pneumoniae 92/92, 100% Streptococcus
e pneumoniae
10 65 M 1.16106 Tidak Streptococcus pneumoniae 90/93, 96.8% Streptococcus
tumbuh pneumoniae
11 80 M 1.36107 Streptococcus pneumonia Streptococcus pneumoniae 51/88, 58.0% Streptococcus
e pneumoniae
12 70 M 1.36107 Tidak Streptococcus intermedius 57/57, 100% Bakteri Oral
tumbuh
13 80 M 1.96106 Moraxella catarrhalis Moraxella catarrhalis 58/58, 100% Moraxella
catarrhalis
14 63 M 4.06106 Streptococcus pneumonia Neisseria mucosa 14/47, 29.8% Streptococcus
e pneumoniae
15 73F 1.66105 Streptococcus pneumonia Streptococcus pneumoniae 78/85, 91.8% Tidak dianalisis
e
16 60 M 1.16108 Streptococcus pneumonia Streptococcus 20/80, 25.0% Bakteri Oral
e pseudopneumoniae
17 79 M 6.86106 Moraxella catarrhalis Moraxella catarrhalis 57/58, 98.3% Escherichia coli
18 65F 7.66107 Tidak Prevotella veroralis 10/50, 20% Tidak dianalisis
tumbuh
19 45 M 2.76105 Tidak Mycoplasma pneumoniae 81/84, 96.4% Tidak dianalisis
tumbuh#
6
20 80F 2.4610 Moraxella catarrhalis, Haemophilus influenzae Moraxella catarrhalis 50/96, 52.1% tidak dianalisis
21 28 M 5.66105 Tidak Fusobacterium nucleatum 51/53, 96.2% Bakteri Oral
tumbuh
22 36F 1.66106 Tidak Clostridium sp. 35/83, 42.2% Bakteri Oral
tumbuh
6
23 64 M 2.1610 Haemophilus influenzae Haemophilus influenzae 94/94, 100% Streptococcus spp.
24 79 M 2.56108 Haemophilus influenzae Haemophilus influenzae 24/91, 26.4% Tidak dianalisis
25 91F 1.06108 Moraxella catarrhalis Moraxella catarrhalis 70/96, 72.9% tidak dianalisis
26 81F 1.36104 Tidak Fusobacterium nucleatum 44/85, 51.8% Tidak dianalisis
tumbuh
27 79 M 1.36107 Haemophilus influenzae Haemophilus influenzae 87/95, 91.6% Tidak dianalisis
28 73F 1.96105 Moraxella catarrhalis Moraxella catarrhalis 69/87, 79.3% tidak dianalisis
29 72F 1.96106 Tidak Streptococcus pneumoniae 45/86, 52.3% Streptococcus
tumbuh pneumoniae
30 68 M 1.26107 Streptococcus pneumonia Streptococcus pneumoniae 92/93, 98.9% Streptococcus
e pneumoniae
31 23F 4.66106 Tidak Mycoplasma pneumoniae 68/69, 98.6% Bakteri Oral
tumbuh
5
32 80F 3.4610 Pseudomona cepacia Corynebacterium propinquum 65/80, 81.3% bakteri Oral
 s
33 57 M 3.76105 Streptococcu pneumoniae Haemophilus Streptococcus pneumoniae 96/96, 100% Tidak dianalisis
s influenzae ,
34 69F 2.06106 Streptococcus pneumonia Streptococcus pneumoniae 62/81, 76.5% Tidak tumbuh
e
8
35 32F 1.9610 Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus 63/65, 96.9% Staphylococcus
aureus
6
36 88F 3.1610 Haemophilus influenzae Haemophilus influenzae 69/74, 93.2% Bakteri Oral
37 87 M 1.76106 Haemophilus influenzae Streptococcus salivarius 12/58, 20.7% Haemophilus
influenzae
Tabel lanjutan
2.
Cairan Bronchoalveolar lavage

Nomor sel Hasil dari analisis klon perpustakaan

kasus No. usia/J. (cells/ml) kultur dari gen 16S ribosomal RNA Penanaman
kelamin dahak
Filotipe dominan (klon/klon, %)

38 64 M 5.66106 Prevotella melaninogenica, spp. Haemophilus influenzae 52/82, 63.4% Tidak dianalisis
Streptococcus
7
39 71 M 1.9610 Bakteri Oral Streptococcus intermedius 77/77, 100% Tidak dianalisis

40 73 M 3.16104 Tidak tumbuh# Mycoplasma pneumoniae 93/93, 100% Bakteri Oral

41 16 M 3.46106 a-Streptococcus# Mycoplasma pneumoniae 85/88, 96.6% Tidak dianalisis

5
42 33 M 7.1610 Staphylococcus sp. Neisseria mucosa 13/61, 21.3% Tidak dianalisis

4
43 57F 3.1610 Tidak tumbuh Fusobacterium nucleatum 31/68, 45.6% Tidak dianalisis

44 18F 1.46107 Tidak tumbuh# Mycoplasma pneumoniae 88/88, 100% Tidak dianalisis

45 65F 7.56106 Haemophilus spp. Streptococcus Haemophilus influenzae 28/61, 45.9% Tidak dianalisis
spp.
5
46 63F 2.7610 Streptococcus pneumoniae Streptococcus pneumoniae 37/66, 56.1% Tidak dianalisis

47 74F 2.36106 Tidak tumbuh Haemophilus influenzae 75/76, 98.7% Tidak tumbuh
48 81 M 9.36104 Tidak tumbuh Neisseria perflava 22/76, 28.9% Tidak dianalisis

5 #
49 28F 1.1610 a-Streptococcus Mycoplasma pneumoniae 70/76, 92.1% Tidak dianalisis

6
50 87F 3.7610 Haemophilus influenzae Haemophilus influenzae 23/59, 39.0% Haemophilus
influenza
4 #
51 23F 1.5610 Actinomyces myeri Mycoplasma pneumoniae 63/78, 80.8% Streptococcus
pneumonia
52 40F 3.16104 Tidak tumbuh# Mycoplasma pneumoniae 71/82, 86.6% Bakteri Oral
5
53 57 M 6.8610 Tidak tumbuh Prevotella veroralis 33/85, 38.8% Tidak dianalisis

5
54 84 M 1.5610 Streptococcus intermedius Streptococcus intermedius 58/84, 69.0% Tidak dianalisis

55 44F 8.66106 a-Streptococcus, Neisseria# Mycoplasma pneumoniae 50/81, 61.7% Streptococcus spp.
56 73F 6.26107 Staphylococcus aureus, a- Staphylococcus aureus 48/79, 60.8% Tidak dianalisis
Streptococcus
57 66 M 3.16105 Bakteri Oral Veillonella atypica 17/69, 24.6% Tidak dianalisis

7
58 82F 7.6610 Haemophilus influenzae, Haemophilus influenzae 62/62, 100% Tidak dianalisis
Streptococcus dysgalactiae
59 83 M 2.56106 Pasteurella multocida Pasteurella multocida 22/73, 30.1% Bakteri Oral
60 79F 3.76109 Haemophilus influenzae Haemophilus influenzae 93/93, 100% Haemophilus
influenzae
61 66 M 3.86107 Bakteri Oral ? Prevotella veroralis 18/77, 23.4% Tidak dianalisis

62 55 M 1.26106 Haemophilus influenzae Haemophilus influenzae 71/73, 97.3% Tidak dianalisis

6 #
63 32 M 1.0610 Tidak tumbuh Mycoplasma pneumoniae 41/65, 63.1% Bakteri Oral
64 67F 6.26105 Tidak tumbuh Moraxella catarrhalis 67/83, 80.7% Moraxella
catarrhalis
# Penilaian Serologikal dari Mycoplasma pneumonia
sebelumnya positif.
doi:10.1371/journal.pone.0063103.t002
Spesimen BAL diperoleh dari 30 pasien dengan idiopatik interstitial pneumonia
(IIPs) menggunakan metode yang sama, juga dievaluasi sebagai sampel yang
representatif dari paru yang tidak menular penyakit.

Kumpulan Sampel
Bronkoskopi serat optik dilakukan sesuai dengan Pedoman British Thoracic
Society untuk bronskoskopi fleksibel diagnostik [21] berkumur dengan solusi
povidone yodium adalah dilakukan sebelum bronkoskopi untuk meminimalkan
kontaminasi oleh Bakteri oral, dan bronskokopi serat optik kemudian
diperkenalkan secara transoris ke dalam trakea dengan melewatkannya melalui
pita suara tanpa kontak atau aspirasi untuk menghindari kontaminasi Bakteri
oral. Spesimen BAL kemudian diperoleh dari lesi yang terkena menggunakan 40
ml saline steril. Apalagi dahak sampel dievaluasi pada pasien dengan produksi
dahak.

Jumlah Sel Bakteri Total dan Analisis Efisiensi Lisis Sel

Untuk memberikan evaluasi microbiota yang tepat, kami mengevaluasi jumlah
sel bakteri total dan efisiensi penggunaan lisis sel mikroskop epiflouresen, seperti
yang dilaporkan sebelumnya [22].

Pemeriksaan Mikrobiologis
Spesimen BAL dan sampel dahak secara kuantitatif dikultivasikan di
bawah kondisi aerob dan anaerob sebagaimana dijelaskan sebelumnya [22].
Metode serologis menggunakan sera tunggal atau berpasangan
digunakan untuk memeriksa keberadaan antibody terhadap Mycoplasma
pneumoniae Antigen Fiksasi Komplemen (Denka Seiken, Tokyo, Jepang), dan
Chlamydophila psittaci Complement Fiksasi Antigen (Denka Seiken, Tokyo,
Jepang). Tingkat anti-Chlamydophila pneumoniae antibody ditentukan oleh ELISA
SeroCP untuk immunoglobulin G (IgG) dan IgA (Savyon dan Hain Lifescience,
Nehren, Jerman).
Tes antigen kemih untuk mendeteksi Streptococcus pneumoniae dan
Legionella pneumophila (Binax, Portland, ME, USA) juga dilakukan.

Karakter dari Diagnosis Etiologik Konvensional

Bakteri dianggap organisme penyebab ketika mereka diisolasi dari kultur
darah. Mikroorganisme apa pun yang diisolasi dari spesimen BAL dianggap
sebagai dugaan pathogen ketika konsentrasinya mencapai $ 104 pembentuk
koloni unit (CFU) / ml dalam budaya kuantitatif [23,24].
 Untuk menilaian serologis M. Pneumoniae dan C. Pneumoniae,
peningkatan titer antibody empat kali lipat antara serum yang dipasangkan
dianggap sebagai dugaan L. Pneumoniae dan S. Pneumoniae dianggap agen
dugaan saat tes kemih antigen positif.

Ekstraksi DNA
Sampel DNA diekstraksi dari spesimen BAL kemudian dikocok dengan kuat
Bersama dengan sodium dodecyl sulfate (final konsentrasi: 3,0%) dan manik-
manik kaca, seperti yang telah dilaporkan sebelumnya [22].

Kondisi PCR
Gen 16S rRNA diperbesar dengan system PCR GeneAmp 9700 thermocycler
(Applied Biosystemns; Fosfer City, CA). hal tersebut merupakan campuran reaksi
yang mengandung set primer universal [25] (E341F; 5´-CCTACGGGAGGCAGCAG-
3´ dan E907R; 5´-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3´) dan AmpliTaq Gold DNA
polymerase LD (Biosystems Terapan; Fosfer City, CA) adalah diinkubasi dalam
thermocycler pada 96°C selama 5 menit. Hal ini diikuti 30 siklus pada 96°C
selama 30 detik, 53°C selama 30 detik dan 72°C selama 1 menit dan langkah
perpanjangan terakhir pada 72°C selama 7 menit.

Konstruksi dan penentuan perpustakaan klon urutan Nukleotida

Produk PCR dikloning dengan kit kloning TA TOPO (Invitrogen; Carlsbad, CA)
sesuai dengan pabrikan instruksi. Sebanyak 96 koloni dipilih secara acak setiap
perpustakaan klon untuk analisis sekuensing. Fragmen parsial vektor kloning
(pCR II) yang mengandung produk PCR yang dimasukkan diperbesar dengan
AmpliTaq Gold DNA polimerase dan a set primer (M13 Maju; 5´-
GTAAAACGACGGCCAG-3´ dan M13Balik; 5´-CAGGAAACAGCTATGAC-3´). Setelah
Primer dan deoksiribo-nukleotida trifosfat dieliminasi dari campuran PCR dengan
ExoSAP-IT (GE Health care UK Ltd.; Inggris, Inggris) sesuai dengan instruksi
pabrikan, 1-µl aliquot digunakan sebagai templat untuk reaksi sekuensing. Reaksi
sekuensing dilakukan dengan primer ‘‘ M13Forward ’dan Urutan Siklus
Terminator BigDye Kit v3.1 (Biosystems Terapan). Urutan asam nukleat adalah
ditentukan pada Penganalisis Genetik 3130xl (Biosystems Terapan).

Pencarian Homologi
Urutan yang sangat akurat dipilih oleh nilai kualitas Phred dibandingkan
dengan urutan gen 16S rRNA dari tipe strain menggunakan alat pencarian
penyelarasan local dasar (BLAST) algoritma, seperti yang dijelaskan sebelumnya
[22].
Gambar 1. Persentase bakteri yang terdeteksi oleh penanaman dahak dan bronchoalveolar dan
metode molekuler. Persentase sampel di mana bakteri terdeteksi oleh penanaman dahak
konvensional (A), sampel bronchoalveolar lavage (BAL) (B) dan metode molekuler menggunakan
gen 16S rRNA (C). Metode molekuler mendeteksi bakteri penyebab dalam semua sampel BAL,
dan ada rasio streptokokus oral yang lebih tinggi dan anaerob terdeteksi menggunakan metode
molekuler dibandingkan dengan metode kultur. ‘‘ Tidak dianalisis ’berarti bahwa pasien tidak
dapat menghasilkan dahak apa pun untuk pemeriksaan dahak pada saat masuk rumah sakit. doi:
10.1371 / journal.pone.0063103.g001

Sebuah filotipe berbagi 97% atau homologi lebih tinggi dengan urutannya
dari jenis strain dianggap spesies dugaan, sebagaimana dijelaskan sebelumnya
[26], dan filotipe dengan berbagai urutan antara 90% dan 97% dari tipe strain
diasumsikan menjadi gen dugaan dalam penelitian ini.

Penilaian keparahan pneumonia dan kematian 30 hari

Penilaian tingkat keparahan pneumonia pada setiap pasien dilakukan dengan
menggunakan indeks keparahan pneumonia (PSI) [27]. Kematian 30 hari setelah
masuk juga dievaluasi.

Hasil
Karakteristik Pasien
Karakteristik dasar pasien disajikan dalam tabel 1. Usia rata-rata 64 pasien (33
tahun laki-laki dan 31 tahun perempuan) berusia 63,2 (kisaran: 16-91) tahun.
Empat puluh empat pasien (68,8%) memiliki setidaknya satu penyakit penyerta,
seperti penyakit paru kronis (20,3%), diabetes mellitus (21,9%), keganasan
(14,1%), atau penyakit ginjal (9,4%). Tidak ada pasien yang memiliki sindrom
imunodefisiensi atau telah menerima transplantasi organ apapun. Tingkat
keparahan pneumonia dievaluasi menggunakan skor PSI. Tingkat kematian kasus
ringan, sedang, dan berat pada 30 hari setelah masuk adalah 0% (0/45), 11,1%
(1/9), dan 20% (2/10), masing-masing.

Gambar 2. Persentase phylotypes yang terdeteksi pada kelompok 'dominan monobakteri' dan
'bakteri campuran' menggunakan metode molekuler. Persentase filotipe dalam setiap sampel
pada 33 pasien dalam in ‘kelompok dominan monobakterial’ (A) dan persentase filotipe dalam
setiap sampel pada 31 pasien dalam patients ‘kelompok bakteri campuran’ (B). Streptococcus
pneumoniae, Mycoplasma pneumoniae, Haemophilus influenzae, Moraxella catarrhalis,
Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, dan Pseudomonas aeruginosa ditampilkan
sebagai spesies dugaan, dan yang lainnya ditampilkan sebagai gen dugaan. Phylotypes yang
mendominasi kurang dari 5% di setiap perpustakaan diklasifikasikan sebagai ‘‘ Lainnya. ’Doi:
10.1371 / journal.pone.0063103.g002
Jumlah bakteri total yang diperoleh dengan evaluasi mikroskopi epifluorescent
dan Analisis efisiensi lisis sel
Jumlah bakteri dalam setiap spesimen BAL dihitung menggunakan analisis
mikroskopis epiflourescent. Jumlah bakteri berkisar antara 1,36104 hingga
3,76109 (median 2,56106) sel/ml (tabel.2). efisiensi lisis sel dipertahankan pada
80% atau lebih besar di semua sampel.

Perbandingan antara hasil metode kultivasi konvensional dan atau Serologis

dan Analisis Mikrofloral Gen 16S rRNA
Penanaman dahak mengidentifikasi beberapa bakteri di 32 (50,0%) dari
64 pasien CAP, dengan S. pneumoniae menjadi yang paling umum terdeteksi
bakteri (9/64, 14,1%), diikuti oleh H. influenzae (3/64, 4,7%), Moraxella
catarrhalis (2/64, 3,1%), dan streptokokus oral (2 / 64, 3,1%; Gambar 1A).
Kultivasi konvensional sampel BAL dan metode serologis menunjukkan itu yang
paling umum patogen yang terdeteksi adalah S. pneumoniae (12/64, 18,8%),
diikuti oleh M. pneumoniae (11/64, 17,2%), H. influenzae (9/64, 14,1%), dan M.
catarrhalis (5/64, 7,8%). Kehadiran dua atau lebih pathogen terdeteksi pada
empat pasien (S. pneumoniae dan H. influenzae di tiga; M. catarrhalis dan H.
influenzae dalam satu) (4/64, 6,3%) (Gambar 1B).
Phylotypes dominan pertama dalam sampel BAL terdeteksi oleh metode
molekuler (Gambar 1C) menunjukkan hal yang paling umum patogen yang
bertanggung jawab untuk CAP juga terdeteksi [S. pneumoniae (18,8%, 12/64), H.
influenzae (18,8%, 12/64), M. pneumoniae (17,2%, 11/64), dan M. catarrhalis
(9,4%, 6/64)], sedangkan streptokokus oral (9,4%, 6/64), Neisseria spp. (4,7%, 3 /
64), dan anaerob (Prevotella spp., Fusobacterium spp., Veillonella spp., dan
Clostridium sp.) (15,6%, 10/64) jauh lebih banyak sering dideteksi dengan
metode molekuler ini daripada oleh kultur metode. Urutan ini telah disimpan di
GenBank (nomor aksesi AB787661 – AB792640).
Selain itu, penanaman dahak mengungkapkan bahwa selain bakteri pada
mulut pada 18 pasien, dan bakteri yang dikultur dalam 12 dari 18 sampel dahak
ini (66,6%) konsisten dengan filogenipe bakteri dominan pertama yang terdeteksi
dengan metode molekuler dalam sampel BAL. [S.Pneumoniae (7/12), H.
influenza (2/12), M. Catarrhalis (2/12) dan Staphylococcus aureus (1/12)].
Organisme pathogen maupun antigen terdeteksi pada 12 (18,8%) dari 64
pasien CAP menggunakan metode konvensional, termasuk kultivasi, pemeriksaan
serologis, dan deteksi antigen urin. Sebaliknya, anaerob (prevotella spp. Dalam
empat; Fusobacterium spp. Dalam tiga; Clostridium spp. Dalam satu) sangat
terdeteksi dalam delapan (66.7%) dari 12 pasien menggunakan metode
molekuler.
 Untuk tujuan deskriptif, kami mendefinisikan ‘kelompok dominan
monobakterial’ sebagai kelompok yang termasuk pasien dimana filotipe dominan
pertama terdiri lebih dari 80% bakteri yang terdeteksi, sementara pasien lain
ditugaskan ke ‘kelompok bakteri campuran’. Menurut definisi ini, 33 pasien
dikategorikan sebagai milik kelompok monobakteri, dan 31 pasien didefinisikan
sebagai milik kelompok bakteri campuran (Gambar 2).
Pathogen CAP yang umum seperti S. Pneumoniae, H. Influenzae, M.
Pneumoniae, M.Catarrhalis, dan S.Aureus, terdeteksi pada 29 dari 33 (87,9%)
pasien yang diklasifikasikan ke dalam kelompok dominan monobakteri, mikroba
oral (6,1%, 2/33) dan anaerob (3,0%, 1/33) terdeteksi hanya dalam beberapa
kasus. Sepuluh dari 31 kasus (32,3%) yang diklasifikasikan ke dalam kelompok
“kelompok bakteri campuran” memiliki lebih dari 30% dari filotipe bakteri yang
terdeteksi sebagai streptokokus oral. (Gambar 2).
Spesimen BAL yang diperoleh dari 30 pasien dengan IIP sebagai
perwakilan dari penyakit paru tidak menular juga ikut dievaluasi. Spesimen-
spesimen tersebut tidak menunjukkan pertumbuhan bakteri dan tidak ada
amplifikasi gen 16S rRNA pada subjek mana pun yang menggunakan metode
penanaman konvensional atau metode molekuler. Selain itu, analisis mikroskopi
epiflourescent dari spesimen BAL ini juga menunjukkan hasil di bawah batas
deteksi (<1,3 x 104 sel/ml) pada semua pasien dengan IIP, dibandingkan dengan
hasil dari 64 pasien CAP (dari 1.3x104 sampai 3.7 x 109:median 2.5x106 sel/ml)
(Gambar 3)
tabel 3 menunjukkan rasio spesies bakteri yang terdeteksi disetiap
kategori PSI dan setiap kelompok umur. Dalam kasus ringan, M.pneumoniae
adalah spesies yang paling dominan, S.pneumoniae, M.Catarrhalis, dan
streptokokus oral sebagian besar terdeteksi pada kasus yang parah.
Sebagai filotipe dominan pertama, M.pneumoniae adalah filotipe yang
paling sering terdeteksi pada pasien, 40 tahun, dan M.pneumoniae, H.Influenzae
dan anaerob terutama terdeteksi pada pasien berusia 40-64 tahun.
S.Pneumoniae, H.Influenzae, M.Catarrhalis, dan streptokokus oral sebagian besar
terdeteksi pada pasien berusia 64 tahun.

Pembahasan
Penelitian ini, kami menganalisis spesimen BAL yang diperoleh dari 64 pasien
CAP menggunakan analisis pustaka klon dari gen 16S rRNA. Berdasarkan
pengetahuan kami, hal ini merupakan laporan pertama yang menunjukkan
insiden anaerob yang lebih tinggi terdapat pada pasien CAP daripada laporan
sebelumnya. Laporan sebelumnya [3-5,9,28,29] telah menunjukkan bahwa 10-
48% mikroorganisme secara etiologis tidak diidentifikasi menggunakan metode
kultur tradisional untuk dahak, dalam kombinasi dengan deteksi antigen kemih
serologis dan/atau spesifik pada pasien CAP. Berbeda dengan laporan
sebelumnya dengan menggunakan metode kultivasi, metode molekuler tersebut
dapat mendeteksi filotipe bakteri pada semua pasien CAP, dan filogen yang
dominan serupa dengan yang ditemukan dalam laporan sebelumnya
menggunakan metode kultivasi tradisional [3-5]. (Gambar 1 dan Tabel 2) selain
itu, pathogen umum yang terkenal dari CAP terutama terdeteksi pada “kelompok
dominan monobakteri”, sedangkan sebagian besar pasien dalam “kelompok
bakteri campuran” menunjukkan beberapa filotipe bakteri termasuk anaerob
dan/atau streptokokus oral.
Dengan menggunakan metode molekuler, anaerob obligat seperti
prevotella spp. Dan fusobacterium spp. (10/64, 15,6%) dan streptokokus oral,
termasuk S.intermedius (6/64, 9,4%), lebih disukai terdeteksi, terutama pada
pasien CAP dengan etiologi yang tidak diketahui ditunjukkan dengan metode
berbasis kultivasi. Hasil ini menunjukkan bahwa streptokokus oral dan anaerob
residen mungkin menjadi bakteri utama yang bertanggungjawab terhadap
pathogen penyebab CAP yang tidak diketahui dalam laporan sebelumnya [3-5].
Bakteri ini umumnya tidak dianggap sebagai pathogen penyebab CAP; namun,
dalam penelitian ini tingkat deteksi anaerob lebih tinggi pada pasien CAP
daripada laporan sebelumnya, dimana laporan sebelumnya menunjukkan bahwa
bakteri ini mungkin memainkan peran penting dalam CAP.
Sebelumnya kami menerapkan metode molekuler untuk evaluasi etiologi
pleurisy bakteri, dan melaporkan bahwa anaerob terdeteksi pada sekitar
setengah dari permohonan bakteri [22]. Namun, baru-baru ini penelitian
molekuler menunjukkan hasil bahwa anaerob sering terdeteksi pada pasien
dengan fibrosis kistik stabil [11].
Bakteri oral (enam streptokokus non-pneumokokus, tiga Neisseria spp.
Dan satu corynebacterium spp) terdeteksi sebagai filotipe dominan pertama
pada 10 pasien CAP. S. Intermedius adalah anggota kelompok S.anginosus, dan
bakteri ini telah dilaporkan berkisar antara 1,1% sampai 3,1% [3-5] sebagai
bakteri penyebab pada pasien CAP. Beberapa laporan CAP yang disebabkan oleh
S. viridans (atau streptokokus oral) atau neissseria spp. telah dilaporkan [30],
meskipun Lambotte dkk melaporkan bahwa streptokokus oral dan Neisseria spp.
bisa menjadi bakteri penyebab pada pasien VAP [31]. Selain itu, 76 (6.8%) dari
1.118 pasien CAP menunjukkan pneumonia bakteremik dan tujuh (9.2%)
diantaranya memiliki kultur darah positif untuk berbagai streptokokus non-
pneumokokus dalam penelitian ini; oleh karena itu, bakteri oral dapat
menyebabkan CAP pada host yang relative immunocompromised.
Evaluasi mikroskopis epifluoresen pada pasien CAP dan pasien dengan IIP
(Gambar 3) menunjukkan bahwa kombinasi metode molekuler dan evaluasi
mikroskopis epifluoresen mendeteksi beberapa filotipe bakteri hanya pada
penyakit infeksi bakteri. Menggunakan metode ini bersamaan dengan metode
bronkoskopik, kami dapat menghindari kontaminasi dengan bakteri oral, yang
memungkinkan untuk membedakan infeksi bakteri saluran pernapasan bawah
dari penyakit brokopulmoner tidak menular lainnya.
Terdapat beberapa keterbatasan yang terkait dengan penelitian ini yang
harus diingat ketika menafsirkan hasil. Pertama, primer universal yang digunakan
tidak dapat memperkuat semua gen 16S rRNA bakteri, dan sensitivitas primer
adalah sekitar 92% untuk spesies bakteri yang terdaftar dalam database
Ribosomal Database Project II. Namun, sekitar 8% bakteri yang tidak terdeteksi
menggunakan primer ini tidak termasuk pathogen manusia yang dilaporkan.
Kedua, jumlah klon yang dianalisis dalam penelitian ini adalah sekitar 100
perperpustakaan, menunjukkan bahwa metode ini mungkin tidak dapat
mendeteksi sekuens gen 16S rRNA bakteri ketika mereka hadir pada fraksi yang
sangat kecil (kurang dari 1% dari setiap sampel). Urutan kedalaman yang
digunakan dalam penelitian kali ini tidak cocok untuk mendeteksi
Mycobacterium tuberculosis, yang merupakan bakteri penting untuk dinilai
ketika mendapatkan diagnosis penyakit pernapasan, bahkan jika bakteri
merupakan konstituen minor dari jaringan klinis.

Kesimpulan
Kami telah mengevaluasi spesies bakteri penyebab pasien CAP menggunakan
analisis mikrofloral sebagai metode kultivasi mandiri mendeteksi keberadaan gen
16S rRNA dalam spesimen BAL. Hasil penelitian kami menunjukkan bahwa
kejadian anaerob dan bakteri oral pada pasien CAP, terutama pada pasien
dengan PSI ringan, lebih tinggi dari yang dilaporkan sebelumya. Oleh karena itu,
dokter harus mempertimbangkan bahwa anaerob dan bakteri oral lebih sering
menjadi pathogen daripada yang dilaporkan sebelumnya pada pasien CAP.