Prosedur pengujian sesepora β- laktam

Penetapan Lokasi pemantauan:

Penetapan lokasi pemantauan ambien :

1. Pertimbangan dalam menetapkan lokasi pemantauan ambien meliputi: arah angin,

tata guna lahan, tinggi cerobong, luas sebaran bahan pencemaran.

2. Titik lokasi pemantauan pada: titik nilai ekstrim, pada kawasan pemukiman,

kawasan kehidupan makhluk hidup lainnya atau pada tempat-tempat spesifik

seperti rumah sakit, purbakala benda. Penetapan titik pemantauan dengan nilai

ekstrim dapat dilakukan melalui pendekatan dengan model dispersi atau

pengamatan lapangan.

3. Pada arah angin dominan: titik pemantauan kualitas ambien minimum 2 titik

dengan mengutamakan pada daerah pemukiman atau tempat-tempat sensitif.

Sedangkan pada arah angin lainnya minimum 1 titik dengan kriteria penetapan

lokasi seperti pada arah angin dominan (Penetapan jarak titik pengambilan sampel

dari industri akan ditetapkan oleh Pemerintah, sedangkan pemantauannya menjadi

tanggung jawab industri). Data arah angin dapat merupakan data sekunder dari

stasion meteorologis terdekat atau data pengukuran langsung di lapangan yang

dapat digolongkan dalam satuan sepanjang waktu untuk satu arah tertentu atau arah

angin pada tiap periode tertentu (harian, bulanan, tahunan) ( SNI, 2005).
Metode Penelitian

Pengumpulan Sampel Pengambilan sampel untuk penelitian ini dilakukan

dengan cara mengambil sampel dengan cara mengusap 5 - 10 kali pada tempat atau

benda yang ada pada titik sampel yang ditentukan. Sampel diusap menggunakan

kertas saring yang sudah dibasahi. Sampel diuji dengan menggunakan metode:

a. Uji tapis untuk mendeteksi residu beta laktam dalam sampel dilakukan

dengan menggunakan metode bioassay. Uji ini untuk mendeteksi adanya

residu antibiotika dengan cepat, mudah digunakan, dan relatif tidak mahal.

Secara umum, tahapan pengujiannya terdiri dari persiapan, pengujian, dan

pembacaan hasil. Persiapan, meliputi persiapan media agar, kultur media,

larutan dapar, dan larutan baku. Persiapan media agar, sebanyak 5 g

peptone, 12 g yeast extract, 15-18 g bacto agar, 1 g dextrose, dilarutkan

dalam 1000 mL aquadest, kemudian diukur pada pH 5.7±0.1 dan

dididihkan.

Media disterilisasi menggunakan autoklaf pada suhu 121 °C

dengan tekanan 15 psi (pound per square inchi) selama 15 menit. Persiapan

kultur media. Bakteri Bacillus stearothermophilus ATCC 7953

diinokulasikan ke dalam agar miring dan diinkubasi pada suhu 55 °C selama

1 minggu. Bakteri yang telah ditumbuhkan tersebut dipanen dan

dimasukkan ke dalam tabung berisi larutan NaCl fisiologis steril 20 mL.

Larutan kemudian dipanaskan dalam penangas air pada suhu 65 °C selama

30 menit. Selanjutnya disentrifugasi dengan kecepatan 3000 rpm selama 10

menit dan supernatan (lapisan atas) dibuang. Kemudian ditambahkan NaCl

fisiologis steril secukupnya lalu dikocok. Selanjutnya, dimasukkan ke

dalam refrigerator dengan suhu 4 °C selama 18-24 jam. Larutan tersebut

dipanaskan kembali dalam penangas air pada suhu 65 °C selama 30 menit.

Selanjutnya disentrifugasi dengan kecepatan 1 000 rpm selama 5 menit dan

diambil supernatannya. Hasilnya disimpan dalam refrigerator sebagai

suspensi spora. Pembuatan larutan dapar fosfat. Sebanyak 7 g K2HPO4, 6

g Na2HPO4, dilarutkan dalam 1000 mL aquadest, kemudian larutan

disterilisasi menggunakan autoklaf pada suhu 121°C dengan tekanan 15 psi

selama 15 menit.

Larutan baku untuk kontrol antibiotika. Standar penicillin ditimbang

kemudian diencerkan dengan larutan dapar dari konsentrasi 1 000 IU/mL

hingga 0.01 IU/mL. Larutan dengan konsentrasi 0.01 IU/mL digunakan

sebagai larutan standar kerja. Pengujian dengan bioassay. Sebanyak 10 mL

sampel dimasukkan dalam tabung reaksi. Sementara itu, kultur media

disiapkan dengan menuangkan 8 mL pada setiap cawan petri. Selanjutnya

kertas cakram steril diletakkan di atas permukaan kultur media. Tiap cawan

petri berisi 5 buah kertas cakram, yang terdiri dari 3 buah cakram yang

masing-masing ditetesi 75 μL sampel yang akan dianalisa, satu kertas

ditetesi 75 μL larutan baku antibiotika 0.01 IU/mL sebagai kontrol positif,

dan satu kertas lagi ditetesi larutan dapar fosfat sebagai kontrol negatif.

Cawan petri ditutup dan diinkubasi pada suhu 55 °C selama 16-18 jam.

Pengujian sampel dilakukan dengan tiga kali pengulangan untuk

mendapatkan data yang akurat. Pembacaan hasil dilakukan dengan

mengamati dan mengukur diameter zona hambatan yang terbentuk

disekeliling kertas cakram menggunakan jangka sorong. Sampel dinyatakan

 positif mengandung antibiotika apabila zona hambat yang terbentuk ≥ 2 mm

dari tepi kertas cakram. Sampel dinyatakan negatif apabila zona hambat

yang terbentuk 0 – 2 mm. Karena zona hambat yang terbentuk < 2 mm

dianggap akibat adanya natural inhibitor. Diameter zona hambatan pada

kontrol positif sebesar 20 ± 1 mm, sedangkan kontrol negatif tidak

membentuk zona hambat.

b. Uji Konfirmasi (HPLC) Uji konfirmasi untuk mendeteksi residu beta laktam

dalam sampel dilakukan dengan menggunakan HPLC. Metode ini

didasarkan pada reservedphase chromatography dan multisignal UV-

visiblediode-aray detection (UVDAD). Spektrum UV berperan sebagai alat

identifikasi tambahan (Husgen dan Schuster 2001). Alat HPLC diatur pada

kolom 15 cm x 3.9 mm, kecepatan aliran 0.8 mL/menit, fase gerak (A:

aquades/10 mM amonium asetat dan B: asetonitril), run time 12 menit, jeda

3 menit, suhu 180 °C, injeksi 50 μL. Tahap persiapan: 5 mL sampel

dimasukkan dalam tabung sentrifus yang mempunyai tutup, ditambahkan

25 mL aquadest dan 4 mL H2SO4 0.17 M serta 4 mL Sodium Tungstad 5%,

dihomogenkan selama 2 menit kemudian disentrifus dengan kecepatan

3.000 rpm selama 10 menit. Larutan supernatant dipisahkan dari residunya

kemudian ditambahkan 10 mL NaCl 20% pada filtratnya. Tahap pemurnian,

yaitu ke dalam kartrid C18 dialirkan perlahan-lahan 10 mL metanol, 10 mL

aquades, 10 mL NaCl 2%. Kemudian dialirkan sampel. Bilas kartrid C18

dengan mengalirkan 10 mL NaCl 2% dan 10 mL aquades. Selanjutnya

sampel di-elusi dengan 3 mL bufer fosfat 0.2 M dalam asetonitril (pelarut

elusi penisilin). Hasil elutan kemudian dipindahkan ke dalam aliran gas

nitrogen sampai kering. Residu disuspensikan kembali dengan 10 mL fase

gerak (asetonitril 0.1%), kemudian divortex selama 2 menit dan

dipindahkan ke dalam vial 2 mL untuk dimasukkan dalam alat HPLC. Hasil

dari pengujian dengan HPLC ditampilkan dalam bentuk kromatogram.

Waktu dan volume retensi pada setiap senyawa ditunjukkan dengan

munculnya beberapa puncak. Uji kualitatif dilakukan dengan mencocokkan

waktu retensi masing-masing puncak pada kromatogram sampel dengan

waktu retensi senyawa standar. Lebar dan tinggi puncak digunakan untuk

menentukan besarnya konsentrasi diukur secara otomatis oleh alat pengolah

data (Ningrum, 2011).