RETRIKSI DAN ELUSI

VEKTOR KLONING GEN Gα

ANGGRAINI PUTRI UTAMI

P051190061

DEPARTEMEN BIOTEKNOLOGI
SEKOLAH PASCASARJANA
IPB UNIVERSITY
BOGOR
2019
 1

1 PENDAHULUAN

Latar Belakang

Enzim restriksi atau juga disebut endonuklease merupakan enzim yang

memotong DNA pada urutan tertentu. Biasannya ditemukan pada bakteri untuk
melawan patogen. Para peneliti telah membuktikan bahwa enzim ini merupakan
asset yang kuat untuk digunakan untuk aplikasi bioteknologi, seperti DNA cloning
(Susan et al., 2018).
Endognuklease adalah enzim bakteri yang mengenal sekuen nukleotida
spesifik dalam suatu molekul DNA double-stranded, dan memisahkan DNA pada
lokasi tersebut. Enzim-enzim ini memotong DNA ke dalam fragmen-fragmen dari
berbagai ukuran, tergantung dari jumlah waktu situs pengenalan enzim yang
berulang dalam molekul. Endoglukanase merupakan enzim yang umumnya
diisolasi dari mikroorganisme prokariotik (Noviendri, 2007). .
Hingga saat ini, paling tidak sudah terdapat ribuan enzim yang diperoleh
dari berbagai jenis mikroorganisme. Beberapa di antaranya yang terkenal dan sering
digunakan adalah enzim Eco RV, HindIII, SacI, TaqI, BamHI, MspI dan lain-lain
(Stansfield, 2003). Pemanfaatan teknik DNA rekombinan dalam usaha penyisipan
suatu gen dari DNA donor ke plasmid bakteri membutuhkan enzim yang cocok
untuk pemotongan DNA. Oleh karena itu, mula-mula harus diketahui terlebih
dahulu ruas-ruas restriksi yang mengapit gen yang akan diisolasi. Selain itu, setiap
enzim restriksi bersikap selektif sehingga akan dikenali oleh nama dan runtunan
basa ruas restriksinya. Enzim yang digunakan pada praktikum ini adalah enzim Eco
RI. Enzim ini hanya mengenali urutan (sekuen) 5′-G’AATCC-3′ (Saputra 2008).
Elusi atau isolasi fragmen tunggal DNA adalah proses pemisahan fragmen
DNA target dari campuran fragmen‐fragmen DNA pengotornya. Hal ini penting
dalam rekayasa genetik karena fragmen tersebut dapat digunakan untuk pelacak
dalam mendeteksi gen DNA lain dan dapat dicangkokkan ke fragmen DNA lainnya.
Teknik elusi atau disebut juga teknik preparasi gel elektroforesis merupakan tekni
isolasi fragmen DNA plasmid dari gel agarosa. Tujuan dilakukannya teknik elusi
adalah untuk mengisolasi fragmen tunggal DNA yang diinginkan misalnya dalam
sebuah penelitian dikatakan teknik ini digunakan untuk mengisolasi protein spesifik
dalam intestin suatu organisme (Fitriyah 2006).

Tujuan Penelitian

Praktikum restriksi dan elusi bertujuan untuk memotong DNA vector

cloning gen Gα yang sudah diisolasi dari bakteri Escherichia coli dengan enzim
restriksi Eco R1 dan mengisolasi fragmen DNA tersebut dari gel agarose supaya
diperoleh DNA vector dan insert DNA.
 2

2 METODE

Waktu dan Tempat

Praktikum dilaksanakan dari tanggal 5 September sampai 12 September 2019.

Praktikum ini dilakukan di laboratorium Biorin lantai IV gedung Pendidikan Antar
Universitas, Institut Pertanian Bogor.

Alat dan Bahan

Alat-alat yang digunakan dalam praktikum ini adalah tabung mikro steril 1.5
mL, pipet mikro (100 µL, 200 µL, dan 1000 µL), MaxiMix®II vortex mixer (Thermo
Scientific, Jerman), microlitre centrifuges Z 216 MK (HERMLE Labortechnik
GmbH, Jerman), Sorvall™ Legend™ Micro 17 microcentrifuge (Thermo Scientific,
Jerman) lemari pendingin, Jenway®7315 spektrofotometer (Cole-Parmer, UK),
microwave, perangkat elektroforesis Mupid®exU (Eurogentec, Belgia), spindown,
dan gel doc.
Bahan-bahan yang digunakan untuk restriksi dan elusi adalah plasmid
pGEM®-T Easy yang sudah disisipi gen Gα, gel agarose 1%, ETBR, ddh2O, enzim
Eco R1 10x , buffer elusi, buffer restriksi, NaOAC 3 M 0,1 ml x Vol, Ethanol
70%, Buffer Tris-Asetat-EDTA

Prosedur

Aplikasi Enzim Restriksi Eco R1

Pre-mix restriksi dibuat dengan cara sebanyak 12,5 µl ddH2O dimasukkan
kedalam tube, 5 µl DNA hasil isolasi ditambahkan, kemudian ditambahkan 2 µl
buffer, lalu ditambah dengan enzim restriksi Eco R1 sebanyak 0,5 µl. Pre mix
restriksi dihomogenkan dengan cara vortex dan diinkubasi pada suhu 30ºC selama
5 menit dan kemudian dilakukan spindown. Larutan diinkubasi pada suhu 37ºC
selama 24 jam. Larutan hasil retriksi dianalisis secara kualitatif menggunakan
metode elektroforesis menggunakan gel agarosa 1% (b/v). Gel hasil elektroforesis
yang mengandung pita DNA vektor dan DNA insert dipotong dan digunakan untuk
tahap elusi.

Elusi Vektor dan Insert Hasil Restriksi Plasmid

Hasil elektroforesis restriksi gel agarose dipotong pada bagian DNA vector
dan insert. Setelah gel terpotongan, gel dicacah sampai halus. Gel yang telah
dicacah dimasukkan ke dalam corong nylon hybond (netral) yang telah dibasahi
oleh 50 µl larutan buffer elusi. Kemudian kedua tube disentrifugasi dengan
kecepatan 10.000 rpm selama 5 menit, selanjutnya ditambahkan buffer elusi
sebanyak 150 µl (diulang sebanyak 3x), dari proses pengulangan didapatkan
volume sebanyak 500 µl, Selanjutnya fipresipitasi dengan ditambahkan NaOAC 3
M 0,1 x volume campuran (volume akhir 550 µl), dan kemudian di inkubasi 24 jam
pada suhu 20ºC . Campuran disentrifugasi 10.000 rpm selama 30 menit dengan suhu
4ºC. pelet diambil dan ditambahkan dengan ethanol 70% sebanyak 500 µl dan
disentrifugasi 10.000 rpm selama 5 menit dengan suhu 4ºC. supernatan dibuang dan
 3

pelet dibersihkan dari ethanol dengan dikeringkan di vacuum dry selama 15-20
menit. Setelah keting, ditambahkan sebanayak 15-20 µl ddH2O. Selanjutnya DNA
vektor dan insert dianalisa secara kuantitatif dengan menggunakan elektroforesis
agarose 1% dan secara dianalisa kualitatif menggunakan metode spektrofotometri
dengan panjang gelombang 260 nm dan 280 nm.
 4

3 HASIL DAN PEMBAHASAN

Restriksi dilkukan dengan cara mencampurkan DNA plasmid yang

menggandung gen insert dengan enzim restriksi. Enzim restriksi yang digunakan
pada percobaan ini adalah Eco R1. Enzim Eco R1 ini memotong DNA pada bagian
yang urutan basanya adalah GAATTC sekuens pengenal bagi Eco R1 adalah pada
nukleotida 5′-G’AATCC-3′ diposisi antara basa G dan A dan pada urutan
polindromiknya 3’-CTTAAG-5’ diposisi antara basa A dan G . Pada DNA utas
ganda, sekuens GAATTC ini akan berpasangan dengan sekuens yang sama tetapi
akan tetapi berlawanan arah. Enzim Eco RI ini memotong setiap utas dari utas
ganda tersebut pada bagian antara G dan A. Sebagai akibatnya, potongan-potongan
atau fragmen-fragmen DNA utas ganda yang dihasilkan akan memiliki ujung
berutas tunggal. Ujung seperti ini yang dikenal dengan istilah sticky ends atau
cohesive ends (Tjahjoleksono, 2009).
Sampel DNA plasmid yang digunakan pada praktikum ini merupakan
vektor pGEM®-T Easy. Plasmid pGEM®-T Easy ini merupakan vektor yang biasa
digunakan dalam penyisapan gen pada teknik DNA rekombinan. Plasmid pGEM®-
T Easy merupakan vektor kloning gen Gα. Vektor pGEM®-T Easy merupakan
Multiple Cloning Site (MCS) yang mengandung situs pemotongan oleh Eco R1.
Enzim retriksi Eco R1 yang memotong pada MCS situs dapat memisahkan secara
jelas fragmen DNA vektor dan insert. Penyisipan gen Gα pada vektor disisipkan di
situ MCS yaitu diantara sac II dan spe I, situs ini merupakan situs spesifik untuk
pemotongan oleh enzim Eco R1.

Gambar 1. Kontruksi pGEM®-T Easy sebagai vektor pengklonan gen Gα.

(Suharsono & Suharsono, 2004).

Pada praktikum ini hasil restriksi yang telah dianalisa dengan metode
elektroforesis pada gel dokumentasi dapat dilihat pada (Gambar 1) yaitu didapatkan
2 jenis pita DNA yang berbeda. Pita ini merupakan pita DNA vektor dan pita DNA
insert. Pada DNA vektor yang didapatkan ukuran pitanya adalah 3 kb dan ukuran
pita pada DNA insert yaitu 1,4 kb. Ukuran pita DNA ini didapatkan dengan
perbandinganukuran marker yang digunakan yaitu 1 kb. DNA vektor dan insert
yang telah di analisa kemudian dicincang untuk selanjutnya dilakukan tahap elusi.
 5

Gambar 2. Uji Kualitatif DNA Plasmid Hasil Restriksi

Elusi merupakan isolasi fragmen tunggal DNA. Analisis dari fragmen DNA
secara tidak langsung akan mendeteksi perbedaan tertentu yang ada dalam urutan
basa nukleotida. Dalam percobaan ini menggunakan elektroforesis gel untuk
memilih bedasarkan ukuran fragmen DNA yang dihasilkan dari molekul panjang
dengan suatu enzim restriksi. Campuran DNA dengan enzim restriksi akan
menghasilkan pita yang khas. (Campbell, 2002).
Prinsip pemisahan DNA target dari pengotornya yaitu persamaan sifat
kepolaran. Larutan ddH2O dan DNA keduanya bersifat polar, sehingga saat
dilakukan sentrifugasi, DNA plasmid dapat terpisah dari pengotornya. DNA akan
keluar melalui membran (Rachmawati et al, 2011). Pada praktikum ini membran
yang digunakan adalah merupakan membran nilon hybond netral. Membran nilon
hybond netral ini memiliki sensitivitas yang tinggi terhadap penyaringan DNA atau
RNA. Filtrat atau larutan yang diambil merupakan filtrat atau larutan cair yang
terdapat pada eppendorf. Sedangkan membran nilon hybond dengan muatan positif
sampel yang digunakan ialah zat yang berada di atas membran atau bukan larutan
yang berada pada eppendorf. Namun zat tersebut harus menggunakan larutan
lainnya untuk mengikat DNA yang berada pada zat tersebut (Muladno 2002).
Pada praktikum ini senyawa yang digunakan adalah larutan buffer elusi.
Biasanya buffer elusi terdiri dari Tris pH 7,5, SDS (Sodium Dodecyl Sulfate),dan
H2O atau TE. Larutan Sodium asetat (NaOAC), etanol absolute, etanol 70%, serta
ddH2O Fungsi dari larutan buffer elusi atau penyangga yaitu untuk menyesuaikan
kondisi yang tepat untuk enzim agar dapat bekerja maksimal dan untuk menjaga
kondisi sel agar sel tidak lisis (Lodish, et al 1995). SDS( Sodium Dodecyl Sulfate)
yang digunakan adalah detergen yang berfungsi untuk membantu proses pelisisan
sel dengan cara melarutkan fosfolipid pada membran sel dan mendenaturasi protein
sehingga membran sel akan mengalami kerusakan (Brown 1991). NaOAC dan
etanol absolute berfungsi untuk presipitasi yaitu pengendapkan DNA. Pencucian
terakhir pada proses elusi ini yaitu etanol 70% dan ddH2O (Stansfield et al. 2003).
 6

Tabel 1. Uji Kuntitatif DNA Hasil Elusi dengan Sprektrofotometri

Panjang Gelombang Konsentrasi

Sampel Kemurnian
λ 260 λ 280 (ng/µL)
Vektor 0.041 0.033 1.242 478.333
1
Insert 0.065 0.052 1.250 758.333
Vektor 0.064 0.047 1.362 746.667
2
Insert 0.059 0.028 2.107 688.333
Vektor 0.040 0.038 1.053 466.667
3
Insert 0.045 0.034 1.324 525.000
Vektor 0.041 0.036 1.139 478.333
4
Insert 0.031 0.028 1.107 361.667
Vektor 0.055 0.043 1.279 641.667
5
Insert 0.039 0.034 1.147 455.000
Vektor 0.047 0.039 1.205 548.333
6
Insert 0.026 0.024 1.083 303.333
Vektor 0.038 0.025 1.520 443.333
7
Insert 0.095 0.088 1.080 1108.333
Vektor 0.032 0.028 1.143 373.333
8
Insert 0.049 0.045 1.089 571.667

Hasil praktikum yang didapatkan dari uji kualitatif DNA dengan metode
spektrofotometer dapat dilihat pada (Tabel 1) adalah kemurnian DNA yang
didapatkan pada setiap kelompok baik vektor maupun insert tingkat kemurniannya
rendah atau tidak baik. Rentang tingkat kemurnian yang baik adalah antara 1,8 –
2,00. Hal ini dapat terjadi dikarenakan DNA yang didaptatkan belum murni, hal ini
disebabkan karena pada DNA masih belum bersih dari pengotor. Pada praktikum
ini kemurnian yang diukur adalah DNA vektor dan insert, dan dapat dilihat pada
(Tabel 1) bahwa pada kelompok 1,3,7 dan 8 nilai kemurnian DNA insert lebih besar
dibandkan dengan DNA vektor. Pada kelompok 2,4,5 dan 6 nilai kemurnian DNA
vektor lebih besar dibandingkan dengan DNA insert. Pads hasil elusi dengan
spektrofotometri seharusnya nilai kemurnian DNA vektor harus lebih besar dari
DNA insert.

Gambar 3. Uji Kualitatif Hasil Elusi DNA Vektor dan Insert

 7

Pada praktikum analisis kualitas dengan uji kualitatif hasil elusi DNA vektor
dan insert dengan elektroforesis hasil yang didapatkan adalah dari semua kelompok
tidak ada band atau pita DNA yang didapatkan. Hal ini dapat dikarenakan oleh
pengerjaan pada langkah – langkah elusi yang kurang baik, atau mungkin
dikarenakan DNA vektor dan DNA insert tidak ikut tersaring sehingga masih
tertinggal di nylon hybon.

4 KESIMPULAN

Pada praktikum ini dapat disimpulkan bahwa restriksi plasmid pGEM®-T

Easy yang telah disisipin gen Gα berhasil dengan ukuran DNA vektor 3 kb yang
DNA insert 1,4 kb. Pada elusi dengan uji kuatitatif hasil yang didapatkan kurang
baik dikarenakan kemurnian DNA vektor dan DNA insert yang didapatkan
rentangnya tidak besar. Pada elusi dengan uji kulitatif hasil spektrofotometri hasil
yang didpatkan yaitu tidak terdapat band DNA insert maupun vektor.

DAFTAR PUSTAKA

Brown, T.A. 1991. Pengantar Cloning Gen. Yogyakarta: Yayasan Essentia Medica.
Campbell NA, Reece JB, Mitchell LG. 2002. Biologi jilid 1. Jakarta: Erlangga.
Fitriyah Juliani. 2006. Isolasi protein spesifik intestine cacing Mecistocirrus
digitatus dewasa dengan teknik elusi. [Skripsi]. Surabaya: UNAIR Press
Lodish, H., Baltimore, D. & Berk, A. 1995. Molecular Cell Biology. New York:
Scientific American Books.
Muladno. 2002. Seputar Teknologi Rekayasa Genetika. Bogor: Pustaka Wirausaha
Muda.
Noviendri, D. 2007. Teknologi DNA Rekombinan dan Aplikasinya dalam
Eksplorasi Mikroba Laut. Squalen, 2 (2).
Rachmawati R, Susilowati, P. E. & Raharjo, S. 2011. Analisis Gen Merkuri
Reduktase (Mera) pada Isolat Bakteri dari Tambang Emas Kabupaten
Bombana Sulawesi Tenggara. Jurnal Progres Kimia Sains 3(2) : 108-123.
Saputra A. 2008. Analisis ukuran kromosom dan pola restriksi Bacillus
thuringiensis dengan elaktroforesis medan berpulsa [skripsi]. Bogor: Fakultas
Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor.
Susan B. W., C. Person, I. L. Mendintz and E. R. Goldman. 2018. Restriction
Enzymes as a Target for DNA-Based Sensing andStructural Rearramgement.
Journal America Chemical Society, 3: 495-502.
Tjahjoleksono, A. (2009). Plasmid. [Online]. Diakses
darihttp://web.ipb.ac.id/tpb/files/materi/genetika/dnarekombinan/plasmid.pd
f.
Zahran, M., I. Daidone, J. C. Smith and P. Imhof, 2010. Mechanism of DNA
Recognition by the Restriction Enzyme EcoRV. J. Mol. Biol, 401 ; 415-432.