1.

Soal Latihan Isolasi DNA Tumbuhan

1) Jelaskan prinsip utama dalam isolasi DNA !

2) Dalam kegiatan pengurusan sering dipergunakan nitrogen cair, jelaskan

apa keuntungan penggunaan nitrogen cair tersebut !

3) Apa fungsi senyawa CTAB yang digunakan dalam isolasi DNA !

4) Mengapa sampah hasil ekstraksi DNA yang mendukung CTAB dan CI

harus dibuang pada tempat khusus ?

5) Apa fungsi deproteinasi dalam proses isolasi DNA, Dari Praktikum yang
saudara lakukan, sebutkan senyawa yang berfungsi dalam proses
deprotensi !

Jawab :
1) Prisnsip isolasi DNA pada berbagai jenis sel atau jaringan pada berbagai
organisme pada dasarnya sama namun memiliki modifikasi dalam hal
teknik dan bahan yang digunakan. Bahkan beberapa teknik menjadi lebih
mudah dengan menggunakan kit yang diproduksi oleh suatu perusahaan
sebagai contoh kit yang digunakan untuk isolasi DNA pada tumbuhan
seperti Kit Nucleon Phytopure sedangkan untuk isolasi DNA pada hewan
digunakan GeneJETTM Genomic DNA Purification Kit. Namun tahapan-
tahapan isolasi DNA dalam setiap langkahnya memiliki protokol sendiri
yang disesuaikan dengan keperluan. Penggunaan teknik isolasi DNA
dengan kit dan manual memiliki kelebihan dan kekurangan. Metode
konvensional memiliki kelebihan harga lebih murah dan digunakan secara
luas sementara kekurangannya membutuhkan waktu yang relatif lama dan
hasil yang diperoleh tergantung jenis sampel.
2) Untuk memudahkan dalam mengahaluskan dan mendapatkan DNA yang
akan diambil.
3) CTAB sebagai pemecah larutan harus dengan NaCl dengan konsentrasi
minimal 1.4 M. Kedua, ekstrak dan larutan sel yang mengandung CTAB
harus disimpan pada suhu ruang karena kompleks CTAB-DNA
 bersifatinsolublepada suhu di bawah 15°C. Ketiga, penggunaan CTAB
dengan kemurnian yang baik akan menentukan kemurnian DNA yang
didapatkan dan dengan sedikit sekali kontaminasi polisakarida. Setelah
ditambahkan CTAB, sampel diinkubasikan pada suhu kamar. Tujuan
inkubasi ini adalah untuk mencegah pengendapan CTAB karena CTAB
akan mengendap pada suhu 15°C. Karena efektivitasnya dalam
menghilangkan polisakarida, CTAB banyak digunakan untuk purifikasi
DNA pada sel yang mengandung banyak polisakarida seperti terdapat pada
sel tanaman dan bakteri gram negatif seperti Pseudomonas,
Agrobacterium, dan Rhizobium.
4) Untuk mengurangi dampak studi populasi yang telah dikembangkan
prosedur ekstraksi DNA yang noninpasif seperti dengan memanfaatkan
rambut, pinja dan lainnya.
5) Proses deproteinisasi yang efektif bergantung pada besarnya fase antara
kloroform-air. Proses ini dapat dilakukan dengan membentuk emulsi dari
air dan kloroform. Hal ini hanya dapat dilakukan dengan penggojogan atau
sentrifugasi yang kuat karena kloroform tidak dapat bercampur dengan air.
Isoamil alkohol berfungsi sebagai emulsifier dapat ditambahkan ke
kloroform untuk membantu pembentukan emulsi dan meningkatkan luas
permukaan kloroform-air yang mana protein akan mengalami presipitasi.
Penggunaan kloroform isoamil alkohol ini memungkinkan untuk
didapatkan DNA yang sangat murni, namun dengan ukuran yang terbatas
(20.000–50.000 bp). Fungsi lain dari penambahan CIA ini adalah untuk
menghilangkan kompleks CTAB dan meninggalkan DNA pada fase
aquoeus. DNA kemudian diikat dari faseaquoeus dengan presipitasi etanol.
Senyawa digunakan kitin

2. Soal Latihan elektroforesis

1) Jelaskan apa yang dimaksud elektrophoresis ?

2) Pada elektrophoresis kenapa DNA dapat berpindah dari kutub negatif

kearah kutub positif ?
 3) Apa pengaruh konsentrasi agar/agarose terhadap laju imigrasi DNA dan
resolusi pemindahan elektrophoresis yang diperoleh ?

4) Mengapa DNA didalam gel yang diberi paparan sinar UV dapat

memancarkan cahaya (berpendar) ?

5) Salah satu variasi sistem elektrophoresis adalah menggunakan

piliacrylamid (PAGE). Jelaskan apa yang dimaksud dengan PAGE tersebut
?

Jawab:

1) Elektroforesis teknik pemisahan komponen atau molekul bermuatan

berdasarkan perbedaan tingkat migrasinya dalam sebuah medan listrik.
Kecepatan molekul yang bergerak pada medan listrik tergantung pada
muatan, bentuk dan ukuran. Elektroforesis dapat digunakan untuk separasi
makromolekul (seperti protein dan asam nukleat). Pemberian aliran listrik
dapat menyebabkan terjadi perpindahan aliran elektron dan zat objek,
kemudian akan bergerak dari elektroda negatif ke arah sisi elektroda
positif. Kecepatan pergerakan ini berbeda-beda, tergantung dari muatan
dan berat molekul DNA. Kisi-kisi gel berfungsi sebagai pemisah. Objek
yang berberat molekul lebih besar akan lebih lambat berpindah..
2) Elektroforesis gel agarosa digunakan untuk memisahkan fragmen DNA
yang berukuran lebih besar dari 100 pb dan dijalankan secara horizontal,
sedangkan elektroforesis poliakrilamid dapat memisahkan 1 pb dan
dijalankan secara vertikal. Elektroforesis poliakrilamid biasanya
digunakan untuk menentukan urutan DNA (sekuensing). Molekul organik
yang dapat dielektroforesis antara lain DNA, RNA, dan protein. Molekul-
molekul yang bermuatan positif akan bergerak menuju elektroda negatif,
sedangkan molekul bermuatan negatif akan bergerak ke elektroda positif
melalui gel elektroforesis. Lokasi fragmen DNA yang terbentuk seperti
pita-pita pada elektroforesis dapat diamati secara spesifik dengan
menggunakan pewarna. Pewarna yang digunakan adalah etidium bromida
yang dapat menyisip di antara basa-basa pada DNA. Gel yang diberi
 etidium bromida dan disinari dengan UV akan memperlihatkan lokasi
DNA sebagai untai berwarna merah-jingga. Etidium bromida merupakan
senyawa karsinogenik sehingga dalam melaksanakan percobaan yang
menggunakan etidium bromida harus menggunakan sarung tangan.
3) Molekul DNA bermuatan negative sehingga dalam medan listrik akan
bermigrasi melalui ,matriks gel menuju kutub positif (anode). Makin besar
ukuran molekulnya makin rendah laju migrasinya.
4) Karena banyka zat termasuk mineral tumbuhan jamur dan mikroba serta
bahan kimia prganik dan anorganik dapat menyerap radiasi UV.
Penyerapan menyebabkan electron dalam material melompat ke tingkat
energy yang lebih tinggi. Electron kembali ketingkat energy yg lebih
rendah dalam serangkaian langkah yg lebih kecil dan memancarkan
srbagaian energy yg diserapnya sebagai cahaya yg Nampak.
5) Penggunaan Polyacrylamide dalam pembuatan kertas adalah terutama
untuk meningkatkan kekuatan dari kertas dan meningkatkan tingkat retensi
pengisi. Industri minyak, produksi minyak, Pengeboran Lumpur, Lumpur
pengolahan limbah, mencegah penyaluran air, mengurangi gesekan dan
meningkatkan pemulihan. Hal ini digunakan untuk mencegah dan
mengendalikan ukuran agen, digunakan dalam penebalan, menstabilkan
koloid, mengurangi hambatan, ikatan, film membentuk, biomedis bahan
dan sebagainya. Tebu juice dijelaskan dalam produksi gula tebu dan gula
bit. Pengolahan limbah ini juga banyak digunakan, dan udara Azura di
industri Azura udara secara efektif digunakan untuk Lumpur dewatering.

3. Soal latihan PCR

1) Jelaskan apa yang dimaksud dengan amplifikasi DNA ?

 2) Jelaskan prinsip kerja yang dilakukan oleh mesin PCR ?

3) Jelaskan apa yang terjadi pada saat denaturasi , annealing, dan ekstensi !

4) Apa fungsi dari :

 Primer dalam amplifikasi DNA ?

 Dntps dalam amplifikasi DNA ?

 DNA templet dalam amplifikasi DNA ?

 Enzim polymerase dalam aplifikasi DNA ?

5) Mengapa pada proses amplifikasi dengan satu primer RAPD bisa

dihasilkan beberapa fragmen dengan ukuran yang berbeda-beda ?

Jawab:

1) suatu metode enzimatis untuk melipatgandakan secara eksponensial suatu

sekuen nukleotida tertentu dengan cara in-vitro .
2) Prinsip proses PCR pertama kali adalah denaturasi pita ganda DNA
melalui reaksi pemanasan dengan suhu 940 C selama bebrapa saat
kemudian pengikatan primer primer (annealing) ke pita tunggal molekul
DNA yang biasanya berlangsung pada suhu tertentu tergantung
karakterisik dari primer yang digunakan. Selanjutnya adalah reaksi
pembentukan molekul DNA sintesis (extension) dari bahan dNTPS. Proses
pembentukan /perpanjangan molekul DNA sintesis yang katalisasi oleh
enzim Taq- polymerase memiliki kecepatan pembentukan sekitar 150
nukleotid perdetik. Jumlah silus dan kondisi kondisi yang lain tentu saja
akan bergantung dari materi yang digunakan yang biasanya juga dapat di
tentukan secar empiris melaui serangkaian percobaan.
3) Denaturasi adalah perubahan atau modifikasi struktur sekuender, tersier
dan kuartener molekul tanpa adanya pemecahan ikatan peptida. Denaturasi
DNA tamplate adalah proses terputusnya ikatan hidrogen antar basa yang
terdapat dalam pasangan untai DNA tamplate. Untai ganda DNA template
(unamplified DNA) dipisahkan dengan denaturasi termal (suhu 95°C).
 Proses ini menyebabkan DNA yang semula untai ganda, kini terpecah
menjadi untai tunggal. Sampai di sini, proses berlanjut pada tahapan
berikutnya yaitu penempelan primer.
Penempelan (Annealing) Primer, Tahapan ini merupakan tahap lanjutan
dari terputusnya ikatan ganda DNA tamplate menjadi untai tunggal.
Masing-masing untai tunggal DNA template akan mengalami proses
‘pendinginan’ hingga mencapai suhu tertentu. Hal ini dimaksudkan untuk
memberi jeda bagi penempelan primer. Setiap untai tunggal DNA template
akan ditempeli pasangan primer. Di alam, primer dibuat oleh enzim yang
disebut primase. Ada dua jenis primer yang akan menempel, yaitu primer
maju (forward primer) dan primer mundur (reserve primer).
Pemanjangan (Extension) Primer, DNA Polimerase digunakan untuk
proses memperpanjang primer (extend primers) dengan adanya bantuan
dari dNTPs (dATP, dCTP, dGTP dan dTTP) dan buffer yang sesuai. DNA
Polimerase yang paling sering digunakan dalam PCR berasal dari strain
bakteri Thermus aquaticus yang hidup di sumber air panas Yellowstone
National Park. Bakteri ini dapat bertahan hidup pada suhu medekati titik
didih dan bekerja optimal pada 72 °C (162 ° F). Primer yang telah
menempel pada untai tunggal DNA template akan mengalami
perpanjangan pada sisi 3’ dengan penambahan dNTP yang komplemen
dengan template DNA polimerase. Proses pemanjangan (extension) primer
ini juga dikenal dengan istilah polimerisasi primer.
4) a. Fungsi primer sebagai pembatas pragmen DNA target yang akan di
amplifikasi dan sekaligus menyediakan gugus hidroksi (-OH) pada ujung 3
yg diperlukan untuk proses eksistensi DNA.
b. Dalam proses PCR bertindak sebagai building block DNA yg
diperlukan dalam proses ekstensi DNA. Dntp akan menempel pada gugus
–OH pada ujung 3’ dari primer membentuk rantai baru yg komplementer
dengan untai DNA templet.
c. Fungsinya sebagai cetakan untuk membentuk molekul DNA baru yg
sama, template DNA ini dapat berupa DNA kromosom, DNA plasmid,
atau fragmen DNA. Apapun asal didalam DNA templet tersebut
mengandung fragmen DNA yg dituju.
 d. Enzim polimerase, berfungsi sebagai katalisis untuk reaksi polimorisasi
DNA, enzim polymerase DNA yg digunakan untuk proses PCR diisolasi
dari bakteri termofilik/hipertermofilik oleh karena itu enzim ini bersifat
termostabil sampai temperature 95℃
5) karena bersifat dominan yg artinya ia dapat membedakan kelas genotype,
resesif, dari kelas-kelas genotype yang lain.