MEDIDA DE MASA CELULAR

3.1.1 MÉTODOS DIRECTOS

En estos métodos se requieren preparaciones limpias, sin partículas

extrañas.

1) Determinación del peso húmedo:

se tara un tubo de centrífuga;

se centrifuga el cultivo y se elimina el sobrenadante;
se determina el peso del sedimento.

Inconvenientes: grandes errores, debido al líquido intercelular retenido, cuya cuantía depende a
su vez de la forma y tipo de agrupaciones de la cepa, intensidad del empaquetamiento, etc.

2) Determinación del peso seco: como el anterior, pero el sedimento

se seca antes de ser pesado (105ºC, toda la noche), hasta peso
constante. Las medidas de peso seco suelen representar el 10-15%
de los valores de peso húmedo.
Inconvenientes: método tedioso (requiere mucho tiempo) y con bastantes errores: es difícil
pesar menos de 1 mg con exactitud en las balanzas habituales de laboratorio. 1 mg de peso
seco equivale a unas 5x109bacterias.

3) Determinación del nitrógeno total: técnica de micro-Kjeldahl.

4) Determinación de un componente característico:

peptidoglucano, ADN, ARN, proteínas, ATP, clorofilas en organismos
fotosintéticos, etc.
Comentarios: se suele usar en bacterias para las que otros métodos más fáciles dan errores
debido a que forman grumos no dispersables, crecen en filamentos, etc. Se emplean en
determinaciones de crecimientos en ambientes naturales.

3.1.2 MÉTODOS INDIRECTOS

1) Medida de consumo de nutrientes o de producción de algún

metabolito por unidad de tiempo . Ejemplos: consumo de oxígeno
(QO2) y consumo de carbónico (QCO2), determinados por el
respirómetro de Warburg. Producción de ácidos.

2) Métodos turbidimétricos (ópticos). Son muy usados en la

práctica cotidiana del laboratorio. La base común de estos métodos
consiste en la medición de la cantidad de luz dispersada o transmitida
a través de un cultivo bacteriano.
Recordemos aquí que las suspensiones bacterianas dispersan la luz,
al igual que cualquier partícula pequeña suspendida en agua (efecto
Tyndall). La dispersión de la luz es, dentro de ciertos límites,
proporcional a la masa del cultivo.

a) Espectrofotómetro: Este aparato es de uso habitual en cualquier

laboratorio de Microbiología o Bioquímica. Mide la densidad óptica
(D.O.), es decir la absorbancia (una medida de la luz transmitida a
través de la supensión).

Por supuesto, hay que realizar una curva estándar para relacionar los
valores de A con la masa bacteriana en una muestra problema.
Comentarios: La cantidad de luz dispersada es proporcional al cociente entre el tamaño de la
partícula y la longitud de onda incidente; la sensibilidad de la técnica aumenta pues a
longitudes de onda () cortas. La proporcionalidad entre A y masa bacteriana sólo es válida
para >107céls/ml.

b) Nefelómetro: Es un aparato similar al anterior, pero el dispositivo

sensor está situado en ángulo recto respecto de la dirección de la luz
incidente, y lo que se mide es pues, la luz dispersada directamente por
la preparación. Posee mayor sensibilidad que el espectrofotómetro.

3.2 MEDIDA DEL NÚMERO DE INDIVIDUOS

3.2.1 MÉTODOS DIRECTOS

1) Cámara de recuento de Petroff-Hauser: Consiste en un

portaobjetos especial con una graduación en superficie y unas
medidas muy concretas:

excavación con 0.02 mm de profundidad;

área de 1 mm2, dividida en un retículo de 25 cuadrados grandes;
cada cuadrado grande está subdividido a su vez en 4x4 = 16 cuadrados
pequeños.
O sea, la muestra se distribuye en 16 x 25 = 400 celdillas (cuadros
pequeños).

La muestra, una vez dispensada entre el porta y el cubre, se deja

reposar sobre la plataforma del microscopio durante unos minutos, y
se cuenta el número de células en varias celdillas (normalmente en
16, equivalentes a uno de los cuadros grandes). Se anota el
número n de células observadas en esas 16 celdillas. Entonces, la
concentración celular es fácil de establecer:

n x 25 x 50 x 1000 = concentración en células/ml.

Ventajas: es un método muy rápido.

Inconvenientes: sólo sirve para suspensiones relativamente concentradas (>10x10 6 céls./ml).

Por debajo de este valor el número de células vistas en el campo del microscopio es muy
pequeño y poco significativo estadísticamente. En bacterias móviles, hay que inmovilizarlas
previamente, con una mezcla de alcohol y agua.

2) Contadores electrónicos de partículas (tipo Coulter): Se hace

pasar una suspensión microbiana por un tubo capilar, entre los dos
polos de una corriente eléctrica. Cada vez que por un orificio (30 m
diámetro) pasa una partícula (p. ej., bacteria) se interrumpe la
corriente, lo cual es recogido por un dispositivo de registro electrónico,
que detecta el número y el tamaño de las partículas que van pasando.
(El tamaño detectado es función de la intensidad del pulso de voltaje
al paso de la partícula).
Comentarios: hay que usar suspensiones absolutamente libres de partículas extrañas (las
pequeñas serían contabilizadas erróneamente como bacterias, y las mayores pueden obturar el
orificio del aparato).

3.2.2 MÉTODOS INDIRECTOS

1) Recuento de viables en placa: Los métodos de recuento de

número de células que hemos visto hasta ahora (los directos) no
distinguen entre células vivas y muertas. En muchos casos conviene
contar las células vivas, y esto en laboratorio se suele hacer mediante
el recuento de viables. (Una célula se define como viable cuando,
colacada en un medio adecuado, es capaz de dividirse y dar
descendencia). El método habitual de lograr esto es sembrar
pequeñas alícuotas de diluciones adecuadas de un cultivo original
sobre placas de Petri con medio sólido (con agar). Cada célula viable
dará origen a una colonia visible después del tiempo adecuado de
incubación. Contando las colonias visibles, teniendo en cuenta la
dilución de la que proceden y el volumen de alícuota utilizado, es fácil
deducir el número de células viables en la suspensión original. (Para
esto, mira el ejemplo de la diapositiva, y sobre todo, estate atento a la
práctica correspondiente, que se suele realizar en la 3ª tanda)

Ciclo celular y crecimiento

https://www.ugr.es/~eianez/Microbiologia/12crecimiento.htm
se toma el concepto de longitud de onda, definiéndolo como la distancia entre dos máximos
consecutivos de la onda.

2010 TP ESPECTROFOTOMETRIA
 www.fcn.unp.edu.ar/sitio/quimicabiologica1/wp.../TP-ESPECTROFOTOMETRIA.pdf
Otro mecanismo de resistencia a arsenito, no conferido por plásmidos, se encontró en
bacterias del tipo Alcaligenest y consiste en la oxidación del arsenito (AsIII), a la forma menos
tóxica de arseniato (AsV) (Williams y Silver, 1984), no se conoce si en T. ferrooxidans se
presenta un mecanismo similar. Como puede observarse, el conocimiento actual sobre los
mecanismos de resistencia de T. ferrooxidans a metales pesados, es aún limitadoAislamiento
de cepas de T. ferrooxidans. A partir del cultivo de pre-enriquecimiento, se tomó una alícuota
de 50 pl y se distribuyó homogéneamente sobre cajas de Petri, conteniendo diferentes medios
selectivos (Harrison, 1989; Kelly y Harrison 1989) para la identificación de cepas de T.
ferrooxidans y de otro tipo de microorganismos presentes en estos consorcios. Las cepas puras
de T. ferrooxidans fueron crecidas en medio líquido 9K suplementado con sulfato ferroso, para
su caracterización posterior, y unas alícuotas fueron almacenadas en presencia de glicerol al
50% en un congelador REVCO a -70°C.

Aislamiento y caracterización de cepas de Thiobacillus Ferroxidans ...

eprints.uanl.mx/529/1/1080080858.PDF

1.
2.
por E Orrantia Borunda - 1997
El hemocitómetro (cámara de Neubauer) es un instrumento ideado para contar células
sanguíneas y se puede usar también para estimar la concentración de conidias en una
suspensión acuosa de esporas (Figura 1). El reglaje del hemocitómetro en su base
consiste de 9 mm 2. Las líneas limítrofes son las líneas centrales en grupos de a tres. El
milímetro cuadrado localizado en el centro, está formado por 25 grupos cada uno de 16
pequeños cuadrados, cada grupo separado por una triple línea, siendo la del medio el
limite. Los cuatro milímetros cuadrados de las esquinas están divididos en 16 pequeños
cuadros (Figura 2). Estas diferencias en las divisiones se hacen para ayudar en la
orientación cuando se esté contando. La altura del área del contaje cuando se coloca el
cubreobjetos es de 0,100 mm, de tal manera que el volumen de la suspensión sobre un
milímetro cuadrado es de 0,1 rnm". Los hemocitómetros son dobles o sea que tienen dos
áreas sobre las cuales se puede efectuar el conteo están localizadas una a cada lado de
las áreas planas levantadas en la sección central del hemocitómetro.

(PDF) MÉTODO PARA CUANTIFICAR SUSPENSIONES DE ...

https://www.researchgate.net/.../277870402_METODO_PARA_CUANTIFICAR_SUSPE...

DETERMINACION DEL CRECIMIENTO MICROBIANO

El cálculo del número de células que existen en una suspensión se puede
llevar a cabo mediante el recuento celular (microscopía, número de colonias),
masa celular (peso seco, medida del nitrógeno celular, turbidimetría) o
actividad celular (grado de actividad bioquímica en relación al tamaño de la
población). Todos estos métodos se clasifican en dos apartados: métodos
directos y métodos indirectos.

 Métodos directos:

o Recuento del número de células en una cámara Thoma

o Peso seco celular
o Determinación de nitrógeno o de proteínas totales
o Determinación de DNA

 Métodos indirectos:

o Recuento de colonias en placa

o Recuento sobre filtro de membrana
o Consumo de oxígeno
o Liberación de dióxido de carbono
o Concentración de un enzima constitutivo
o Decoloración de un colorante
o Incorporación de precursores radiactivos
o Medida de la turbidez

Crecimiento microbiano
webcd.usal.es/Web/educativo/micro2/tema07.html

El método se basa en el muestreo del aire problema mediante el aparato SAS (Surface Aire
System) compact. De los muestreadores descritos en la NTP-203, se escogió éste por ser de
fácil manejo, portátil y que permite elegir el medio de cultivo adecuado a cada requerimiento.
El aire muestreado se hace incidir sobre un medio de cultivo determinado, según se pretendan
valorar bacterias u hongos. Posteriormente se procede a la incubación a una temperatura
adecuada y finalmente se efectúa el contaje de colonias expresando el resultado en ufc/m3
(unidades formadoras de colonias por metro cúbico)

NTP 299: Método para el recuento de bacterias y hongos en ... -

INSST
https://www.insst.es/documents/94886/.../c33a7078-3608-4c56-914e-12946c3c660c