ARTIKEL ILMIAH

PRAKTIKUM BIOKIMIA

PENGARUH WAKTU HIDROLISIS PROTEIN GELATIN OLEH ENZIM

PROTEASE TERHADAP VOLUME NaOH DAN mg NITROGEN ASAM AMINO
MELALUI TITRASI FORMAL ASAM AMINO

Oleh:

Ni Putu Fitria Atrisa (1213031068)

JURUSAN PENDIDIKAN KIMIA

FAKULTAS MATEMATIKA DAN PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS PENDIDIKAN GANESHA
SINGARAJA
2015
 PENGARUH WAKTU HIDROLISIS PROTEIN GELATIN OLEH ENZIM
PROTEASE TERHADAP VOLUME NaOH DAN mg NITROGEN ASAM AMINO
MELALUI TITRASI FORMAL ASAM AMINO
Ni Putu Fitria Atrisa*, 1213031068

*Mahasiswa Jurusan Pendidikan Kimia, Fakultas MIPA, Undiksha Singaraja

Jalan Udayana, Singaraja 81117 Telepon (0362) 25072

ABSTRAK

Tujuan percobaan ini adalah untuk menghidrolisis protein dengan enzim protease dan untuk membuat kurva
hubungan antara volume NaOH terhadap waktu hidrolisis pada titrasi formal asam amino. Percobaan ini
dilakukan dengan metode kuantitatif yaitu titrasi formal asam amino. Hasil yang diperoleh dari percobaan ini
adalah volume NaOH yang dibutuhkan pada titrasi menit ke-0, 15, 30, 45 dan 60 berturut-turut sebanyak 13,00
mL, 16,50 mL, 18,00 mL, 21,8 mL dan 25,7 mL. Berdasarkan perhitungan yang dilakukan, jumlah mg nitrogen
yang dihasilkan pada sampel menit ke-0, 15, 30, 45 dan 60 berturut-turut sebanyak 3,64 mg, 4,62 mg, 5,04 mg,
6,104 mg dan 7,196 mg. Derajat hidrolisis protein gelatin berdasarkan percobaan dan perhitungan yang
dilakukan adalah 0,211. Kurva hubungan antara waktu dengan volume NaOH dan mg Nitrogen adalah
berbanding lurus. Semakin lama waktu hidrolisis, maka volume NaOH yang digunakan dalam titrasi dan jumlah
mg nitrogen yang dihasilkan akan semakin banyak.

Kata Kunci : Titrasi formal, asam amino, gelatin, hidrolisis, enzim protease.

ABSTRACT

This experiment aims to hydrolyze the protein with protease enzymes and to make the curve of the relationship
between the volume of NaOH and hydrolysis time on formal titration of amino acids. This experiment was
conducted using a quantitative formal titration of amino acids. The results obtained from this experiment is the
volume of NaOH used to titrate sample from minute 0, 15, 30, 45 and 60 respectively as 13,00 mL, 16,50 mL,
18,00 mL, 21,8 mL and 25,7 mL. Based on calculations performed mg amount of nitrogen produced in minute
samples of 0, 15, 30, 45 and 60 respectively as much as 3.64 mg, 4.62 mg, 5:04 mg, 6104 mg and 7196 mg. the
degree of protein hydrolysis of gelatin based on experiments conducted is 0,211. Curve relationship between time
with the volume of NaOH and mg Nitrogen is directly proportional. The longer the time of hydrolysis, the volume
of NaOH used in titration and the amount of nitrogen mg produced will be more

Keywords: formal titration, amino acids, gelatyn, hydrolyze, protease enzymes.

PENDAHULUAN
Protein berasal dari akar kata protos dari
bahasa Yunani yang berarti “yang paling
utama”. Protein adalah senyawa organik
kompleks dengan berat molekul tinggi yang
merupakan polimer dari monomer-monomer
asam amino yang dihubungkan satu sama lain
dengan ikatan peptida. Molekul protein
mengandung unsur karbon, hidrogen,
oksigen, nitrogen dan kadang sulfur serta
fosfor. Suatu molekul protein disusun oleh
sejumlah asam amino tertentu dengan
susunan yang sudah tertentu dan bersifat
turunan (Aisjah Girindra dalam Tika, 2010).
Asam amino merupakan ion dipolar
yang pada umumnya mempunyai dua atau
lebih pKa. Asam amino yang menyusun suatu
protein tertentu, kadar asam aminonya tidak
sama. Protein jika dihidrolisis akan
menghasilkan asam amino bebas. Asam
amino tidak larut di dalam eter karena
merupakan senyawa dipolar dan dalam air
menunjukkan struktur kutub ganda (Zwitter
ion) yaitu:
 H H
R C COOH
(aq)
NH2
Gambar 1. Struktur dipolar asam amino
Dari gambar tersebut, gugus amino
diprotonasi dan hadir sebagai ion
ammonium, sedangkan gugus karboksil
kehilangan protonnya dan hadir sebagai
anion karboksilat. Struktur ini konsisten
dengan sifat asam amino yang seperti
garam, yang memiliki titik leleh agak
tinggi. Asam amino bersifat amfoterik
artinya berperilaku sebagai asam dan
mendonasikan proton pada basa kuat atau
dapat juga berperilaku sebagai basa dan
menerima proton dari asam kuat.
Bila suatu protein dihidrolisis, akan
didapatkan asam aminonya. Hidrolisis
protein dapat dilakukan dengan
menggunakan enzim protease dari tripsin.
Protein jika dihidrolisis akan menghasilkan
asam amino bebas. Asam amino bebas ini
bila direaksikan dengan formaldehid
berlebih akan membentuk derivate metilol.
Reaksi ini menyebabkan asam amino bebas
bentuk isoelektrik kehilangan satu proton
dari gugus NH3+ (Tika, 2010).
H+ yang dilepaskan pada reaksi ini
dapat dititrasi langsung dengan NaOH
sampai dengan pH 8,0 (titik akhir indicator
ekuivalen). Titrasi asam amino atau
campuran asam amino dalam keberadaan
formaldehid disebut dengan titrasi formal
asam amino. Titrasi ini merupakan metode
analisis untuk mengikuti pembentukan
asam amino bebas yang dihasilkan pada
proses hidrolisis protein oleh enzim
proteotik (Tika, 2010).
Pada percobaan ini dibuat kurva titrasi
dari asam amino yang diperoleh dari hasil
hidrolisis protein dengan menggunakan
enzim protease dari tripsin. Tripsin adalah
suatu enzim proteolitik atau enzim yang
mengkatalisis hidrolisis protein. Tripsin
mengkatalisis hidrolisis ikatan amida di
bagian karboksil dari lisin atau arginin
(Fessenden, 2010). Selama hidrolisis suatu
protein, sejumlah gugus karboksil dan
R C COO -
(aq)
NH3+
gugus amino bertambah terus. Penentuan
secara kuantitatif salah stau gugus akan
dapat memberikan indikasi untuk
mengetahui derajat hidrolisis protein.
Menurut teori zwiiterion, kalau suatu asam
amino dalam larutan dititrasi dengan basa,
berarti ion hydrogen dari ammonium yang
dititrasi. Gugus ammonium dari asam
amino yang bersifat buffer pada daerah pH
tinggi atau di atas pH 11, sehingga tidak
mungkin dititrasi sampai titik akhir. Hal
yang sama juga terjadi pada gugus
karboksil yang bersifat buffer pada pH
rendah sehingga tidak mungkin juga
dititrasi dengan basa (Tika, 2010).
Untuk mengatasi hal tersebut, maka
formaldehid ditambahkan ke dalam larutan
asam amino agar bereaksi dengan gugus
amino yang tidak bermuatan sehingga
memungkinkan gugus ammonium
membuffer pada daerah pH yang lebih
rendah dan dapat dititrasi pada titik akhir
secara kuantitatif menggunakan indicator
(Tika, 2010).
Penambahan formalin ke dalam larutan
asam amino akan membentuk dimetilol.
Dengan terbentuknya dimetilol berarti
gugus amino dari protein sudah terikat dan
tidak akan mempengaruhi titik akhir titrasi
sehingga titik akhir titrasi dapat ditentukan
dengan tepat. Indikator yang digunakan
adalah fenolptalein (Tika, 2010).
Pada praktikum ini digunakan gelatin
yang merupakan produk alami yang
diperoleh dari hidrolisis parsial kolagen.
Gelatin merupakan protein yang larut dan
bersifat gelling agent (bahan pembuat gel).
Sumber bahan baku gelatin dapat berasal
dari tulang dan kulit dari sapi atau babi.
Gelatin terdiri dari glisin dengan komposisi
besar, protein dan 4-hidroksi residu.
Struktur gelatin adalah sebagai berikut:
 O O O O
H H H H2 H H H
O C N C C N C C N C C N OH
H H H2 H
N C C N C C N CH2 CH2
H C NH
CH3 O CH2 CH2
O CH2
NH C O
C O
C NH O-
NH O
NH2
C

Gambar 2. Struktur Gelatin (Sumber: Tika, 2010)

MATERI DAN METODE

Alat dan Bahan
Alat yang digunakan dalam percobaan ini
adalah gelas kimia 100 mL, labu Erlenmeyer
100mL, buret 50 mL, statif dan klem, spatula,
batang pengaduk, labu ukur 100 mL, kaca
arloji, termometer, pipet tetes dan labu ukur
25 mL. Bahan yang diperlukan dalam
percobaan ini adalah larutan glisin 1%,
NaOH 0,2 M, HCl 0,1 M, indikator PP 1%,
larutan formaldehid 40%, larutan tripsin 1%
dan aquades.
Prosedur Kerja
Penyiapan Larutan Gelatin
Sebanyak 250 mL larutan gelatin
ditambahkan 1 mL fenolftalein dan NaOH
0,2 M tetes demi tetes hingga timbul warna
merah muda. Setelah itu larutan gelatin
ditambahkan tetes demi tetes larutan HCl 0,1
mL sampai warna merah mudanya hilang.
Larutan kemudian direndam pada inkubator
air dengan suhu 38oC selama beberapa menit.
Penyiapan Larutan Tripsin
Larutan tripsin sebanyak 62,5 mL
ditambahkan dengan 1 mL larutan
fenolftalein dan tetes demi tetes larutan
NaOH 0,2 M sampai timbul warna merah
muda. Larutan tripsin yang berwarna merah
muda direaksikan dengan tetes demi tetes
larutan HCl 0,1 M sampai hilang warna
merah mudanya hilang. Larutan kemudian
diinkubasi dalam inkubator air pada suhu
38oC selama beberapa menit.
Titrasi Formal Asam Amino
Larutan tripsin dan larutan gelatin
dicampurkan dan diaduk perlahan. Setelah
tercampur merata, 10 mL campuran diambil
dan dimasukan ke dalam Erlenmeyer 100
mL. Larutan ini digunakan sebagai kontrol
atau waktu nol. Larutan kemudian
dididihkan untuk merusak enzim kemudian
didinginkan. Larutan yang sudah dingin
ditambahkan 15 mL formalin netral dan 3
tetes indikator PP, kemudian dititrasi
menggunakan NaOH 0,02 M. Langkah di
atas diulang pada interval waktu 15, 30, 45,
dan 60 menit dari waktu nol. Data yang
didapat digunakan untuk membuat kurva
titrasi.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Berdasarkan percobaan yang telah
dilakukan pada proses penyiapan larutan
gelatin dan tripsin, diperoleh hasil
pengamatan seperti yang disajikan dalam
tabel berikut.

Tabel 1. Hasil Pengamatan pada Proses Penyiapan Larutan Gelatin dan Tripsin
Larutan Warna yang larutan
Gelatin Bening kekuningan
Gelatin + PP Bening kekuningan
Gelatin + PP + NaOH Merah muda
Gelatin + PP + NaOH + HCl Bening kekuningan
Tripsin Kuning kehijauan
Tripsin + PP Kuning kehijauan
Tripsin + PP + NaOH Merah kekuningan
Tripsin + PP + NaOH + HCl Kuning kehijauan

Penambahan larutan fenolftalein (PP) gambar 3b). Campuran kemudian

berfungsi sebagai indikator yang akan
menunjukkan perubahan warna ketika pH
lingkungannya berubah. Penambahan larutan
NaOH bertujuan agar larutan bersifat sedikit
basa. setelah ditambahkan NaOH,larutan
berubah warna menjadi merah muda (lihat
ditambahkan HCl tetes demi tetes hingga
warna merah muda hilang (lihat ambar 2c).
Tujuan penambahan HCl ini adalah agar pH
menjadi 8 karena pada pH ini enzim tripsin
mampu bekerja secara optimal.

a b c

Gambar 3. (a) Larutan Gelatin bening kekuningan, (b) Gelatin +PP + NaOH berwarna merah
muda, (c) Gelatin + PP + NaOH setelah ditambah HCl berwarna bening kekuningan

Hal yang sama juga dilakukan pada
larutan tripsin. Larutan tripsin berwarna
kuning kehijauan (lihat gambar 4a). setelah
ditambahkan indikator PP dan NaOH larutan
berubah warna menjadi merah kekuningan
(lihat gambar 4b). Penambahan NaOH
bertujuan untuk membuat larutan menjadi
bersifat sedikit basa. Selanjutnya dilakukan
penambahan HCl yang menyebabkan larutan
kembali berwarna kuning kehijauan (lihat
gambar 4c).
 a b
Gambar 4. (a) larutan tripsin berwarna kuning kehijauan, (b) tripsin + indikator PP + NaOH
berwarna merah kekuningan, (c) tripsin + indikator PP + NaOH setelah ditambah HCl
berwarna kuning kehijauan.
Selanjutnya dilakukan inkubasi terhadap
larutan gelatin dan tripsin dengan inkubator air
suhu 38oC agar enzim protease dapat bekerja
secara optimal. Suhu dijaga jangan sampai
melebihi 38oC karena bisa terjadi
pembentukan gel yang sangat mempengaruhi
proses degradasi untuk menghasilkan asam
amino. Selanjutnya setelah diinkubasi, maka
kedua larutan ini dicampur. Tujuan
pencampuran ini adalah untuk mengdegradasi
larutan gelatin dengan menggunakan enzim
tripsin. Tripsin merupakan enzim proteolitik
yang hanya terdiri dari suatu rantai
polipeptida. Enzim ini akan mendegradasi
gelatin menghasilkan asam amino
penyusunnya.
10 mL larutan campuran tripsin dan
gelatin ini diambil dan dididihkan untuk
merusak enzim, kemudian didinginkan
(digunakan sebagai sampel kontrol atau waktu
c
nol). Setelah didinginkan larutan ditambahkan
15 mL formalin netral dan 3 tetes indikator PP.
Pada titrasi ini dipilih indikator PP karena
trayek pH indikator PP adalah 8,3-12,
sehingga sesuai dengan pH larutan yaitu
pH=8. Larutan kemudian dititrasi dengan
NaOH 0,02 M. Larutan ini digunakan sebagai
kontrol atau sampel waktu nol. Prosedur yang
sama diulangi dalam selang waktu 15 menit
sampai menit ke-60. Data hasil titrasi
kemudian dicatat kemudian dapat dibuat kurva
titrasinya.
Penambahan formalin netral dilakukan
agar gugus karbonil dalam formalin bereaksi
dengan asam amino yang tidak bermuatan
sehingga memungkinkan gugus amonium
bereaksi dengan NaOH dan membuffer pada
pH yang lebih rendah. Reaksi yang terjadi
secara keseluruhan dalam titrasi formal asam
amino dapat dilihat dalam gambar 5.
 H H

R C COOH R C COO-
(aq) (aq)

NH2 NH3 +

H O H

R C COO- + C R C COOH
(aq) (aq)
H H
NH3+ H N CH2OH
(aq)
O

C
H H

R C COOH

HOH2 C N CH2OH
(aq)
dimethilol
H H

R C COOH + NaOH R C COO-Na+ + H2O (l)

(aq)

HOH2 C N CH2OH (aq) HOH2C N CH2OH (aq)

Natrium dimethilol

Gambar 5. Reaksi Keseluruhan dalam Titrasi Formal Asam Amino

Volume NaOH yang dibutuhkan dalam titrasi waktu pada titrasi formal asam amino (lihat
sampel waktu ke-0, 15, 30, 45 dan 60 menit gambar 6).
disajikan dalam tabel 2. Berdasarkan data
yang terdapat pada tabel 2, dapat dibuat kurva
hubungan antara volume NaOH terhadap

Tabel 2. Data Volume NaOH yang Digunakan dalam Titrasi

Waktu (menit) Volume NaOH (mL)
0 13,0
15 16,5
30 18,0
45 21,8
60 25,7
 Gambar 6. Kurva Hubungan Volume NaOH terhadap Waktu
Berdasarkan grafik di atas, dapat
dinyatakan bahwa semakin lama larutan
dibiarkan, maka semakin banyak volume
NaOH yang digunakan untuk proses titrasi.
Hal ini terjadi karena selama proses hidrolisis
gelatin oleh tripsin menghasilkan sejumlah
asam amino yang konsentrasinya bertambah
seiring dengan bertambahnya kontak antara
larutan gelatin dengan larutan tripsin. Derajat
hidrolisis dari enzim tripsin juga dapat
dihitung berdasarkan kurva di atas, yaitu
dengan perhitungan sebagai berikut:
V NaOH
Derajat hidrolisis 
t
(25,7  13,0)
Derajat hidrolisis   0,0211
(60  0)
Jadi, derajat hidrolisis dari asam amino
adalah 0,0211
Dengan mengasumsikan 1 mL NaOH
ekivalen dengan 1,4 mg nitrogen asam amino,
maka dapat dihitung jumlah mg asam amino
pada tiap volume NaOH saat titrasi seperti
perhitungan berikut;
Pada waktu t = 0
Volume NaOH 0,02 M yang digunakan =
13,00 mL
Mol NaOH = 13,00 mL x 0,02 M = 0,26 mmol
1 mL NaOH 0,1 N ekuivalen dengan 1,4 mg
nitrogen asam amino, sehingga untuk 0,26
mmol NaOH ekuivalen dengan:
0,1 mmol 1,4 mg

0,26 mmol x mg
0,26 mmol
x 1,4 mg  3,64 mg nitrogen
0,1 mmol
asam amino
Dengan perhitungan yang sama dapat
dihitung pula miligram nitroen pada menit ke-
15, 30, 45, 60, Data mg asam amino untuk tiap
volume NaOH dapat dilihat pada tabel 3.
Berdasarkan data tabel 3, dapat dibuat
kurva hubungan antara massa nitrogen
terhadap waktu (lihat gambar 7).
 Tabel 3. Jumlah Miligram Nitrogen untuk Masing-masing Volume NaOH
Waktu (menit) Volume NaOH (mL)
0 13,0
15 16,5
30 18,0
45 21,8
60 25,7
Gambar 7. Kurva Hubungan mg Nitrogen terhadap Waktu
Berdasarkan kurva pada gambar 7, dapat
dilihat bahwa jumlah mg Nitrogen semakin
banyak seiring dengan bertambahnya waktu.
SIMPULAN
Berdasarkan uraian pembahasan di atas
dapat dibuat simpulan sebagai berikut:
1. Larutan gelatin (protein) dapat
dihidrolisis dengan menggunakan
tripsin (enzim protease) dan
menghasilkan asam amino.
2. Berdasarkan kurva pada gambar 6
dan gambar 7 diperoleh bahwa
semakin lama waktu inkubasi larutan
campura gelatin dan tripsin, maka
volume NaOH yang diperlukan
dalam titrasi dan milligram Nitrogen
yang dihasilkan akan semakin
banyak.
UCAPAN TERIMAKASIH
Ucapan terima kasih penulis sampaikan
kepada Dr. I Nyoman Tika, M.Si., sebagai
mg Nitrogen Asam Amino
3.64
4.62
5.04
6.104
7.196
dosen pengampu mata kuliah Praktikum
Biokimia, Kadek Dewi Wirmandianthy,
S.Pd.,M.Si selaku asisten dosen, dan I Dewa
Subamia selaku laboran di Jurusan
Pendidikan Kimia atas masukan dan
sarannya sehingga percobaan ini dapat
dilaksanakan dengan baik.
DAFTAR PUSTAKA
Fessenden dan Fessenden. 1994. Kimia
Organik Jilid 2. Edisi Ketiga.
Jakarta : Erlangga.
Redhana, I Wayan dan Siti Maryam.
2003. Penuntun Praktikum
Biokimia. Singaraja : IKIP
Negeri Singaraja
Tika, I Nyoman. 2007. Penuntun
Praktikum Biokimia. Singaraja:
Universitas Pendidikan Ganesha
Tika, I Nyoman. 2010. Penuntun
Praktikum Biokimia. Singaraja:
Universitas Pendidikan Ganesha
Wirahadikusuma, Muhamad. 2001.
Biokimia :Protein, Enzim, dan
Asam Nukleat. Bandung :
Penerbit ITB