Anda di halaman 1dari 18

UJI SENSITIVITAS

Uji Kepekaan Terhadap Antimikroba

Uji kepekaan terhadap antimikroba dimulai ketika pertemuan yang diprakarsai WHO
di Genewa (1977), kepedulian terhadap semakin luasnya resistensi antimikroba baik yang
berhubungan dengan infeksi manusia atau hewan. Hal ini mencetuskan
program surveilance untuk memonitor resistensi antimikroba menggunakan metode yang
sesuai. Dengan tes kepekaan terhadap antimikroba akan membantu klinisi untuk menentukan
antimikroba yang sesuai untuk mengobati infeksi. Untuk mendapatkan hasil yang valid, tes
kepekaan harus dilakukan dengan metode yang akurat dan presisi yang baik, dimana metode
tersebut langsung dapat digunakan dalam menunjang upaya pengobatan. Kriteria yang
penting dalam metode tes kepekaan adalah hubungannya dengan respon pasien terhadap
terapi antimikroba.
Dari pertemuan tersebut WHO merekomendasikan penggunaan teknik difusi Kirby-
Bauer yang telah diperkenalkan pada tahun 1976, metode tersebut sangat sesuai khususnya
untuk golongan Enterobactriaceae, tetapi dapat pula digunakan untuk semua bakteri
pathogen.
Pada prinsipnya tes kepekaan terhadap antimikroba adalah penentuan terhadap bakteri
penyebab penyakit yang kemungkinan menunjukkan resistensi terhadap suatu antimikroba
atau kemampuan suatu antimikroba untuk menghambat pertumbuhan bakteri yang tumbuh in
vitro, sehingga dapat dipilih sebagai antimikroba yang berpotensi untuk pengobatan.

Faktor lingkungan yang berpengaruh terhadap tes kepekaan


Penentuan tes laboratorium terhadap mikroorganisme, untuk hasil yang lebih akurat
harus memperhatikan faktor fisika dan kimia yang mempengaruhi baik terhadap
mikroorganisme ataupun pengaruh terhadap daya kerja antimikroba, sehingga harus
dihindari faktor-faktor lingkungan yang kemungkinan merpengaruhi,
Faktor lingkungan tersebut diantaranya:
1. PH
Beberapa antimikroba dipengaruhi oleh pH lingkungan, contohnya aktifitas antibakteri
eritromisin dan aminoglikosida berkurang apabila terjadi penurunan pH, sedangkan aktifitas
tetrasiklin akan menurun bila terjadi peningkatan pH. Aktifitas aminoglikosida yang daya
kerjanya menghambat sintesis protein bakteri melalui membran sel dengan proses oksidasi,
sehingga apabila tidak terdapat oksigen akan mengurangi aktifitas antimikroba tersebut.
2. Kation
Aktifitas aminoglikosida juga dipengaruhi oleh konsentrasi kation Ca++ dan Mg++.
Tahapan aktifitas antimikroba yang penting adalah absorpsi antimikroba ke permukaan sel
bakteri. Aminoglikosida bermuatan positif dan bekerja terutama untuk bakteri gram
negatif, misalnya membran luar Pseudomomonas aeruginosa yang bermuatan negatif
3. Tersedianya bahan gizi tertentu
Bahan gizi tertentu dapat mempengaruhi aktifitas antimikroba, misalnya bakteri
enterococcus mampu menggunakan timin dan asam folat hasil metabolisme untuk
menghindari pengaruh aktifitas sulfoamida dan trimetroprim, yang dihambat oleh jalur
metabolik asam folat.
Informasi mengenai resistensi yang kemungkinan berasal dari lingkungan digunakan
untuk membuat metoda standar yang dapat mengurangi pengaruh faktor lingkungan terhadap
bakteri uji, sehingga pemeriksaan lebih akurat.

Tujuan pengendalian faktor lingkungan


I. Hambatan pertumbuhan berkaitan dengan aktifitas antimikroba melawan bakteri uji dan
tidak dibatasi oleh bahan gizi, suhu dan kondisi lingkungan lainnya yang dapat
menghalangi pertumbuhan, sehingga dapat dipastikan hambatan pertumbuhan hanya
disebabkan oleh antimikroba yang digunakan.
II. Mengoptimalkan kondisi untuk pemeliharaan keutuhan dan aktifitas antimikroba
sehingga dapat dipastikan kegagalan menghambat pertumbuhan bakteri disebabkan oleh
keresistenan bakteri itu sendiri tapi bukan dari pengaruh lingkungan yang membuat
antimikroba inaktif.
III. Untuk mempertahankan hasil konsisten yang berulang (reproducibility dan consistency)
sehingga organisme yang sama akan memperlihatkan hasil kepekaan yang sama, terhadap
metode uji laboratorium yang digunakan
Pengujian dilakukan di bawah kondisi standar, dimana kondisi standar berpedoman
kepada Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Standar yang harus dipenuhi
yaitu: konsentrasi inokulum bakteri, media perbenihan (Muller Hinton) dengan
memperhatikan pH, konsentrasi kation, tambahan darah dan serum, kandungan timidin, suhu
inkubasi, lamanya inkubasi dan konsentrasi antimikroba.
Walaupun kondisi penting untuk pemeriksaan invitro telah distandarkan namun tidak
ada kondisi invitro yang mengambarkan kondisi yang sama dengan keadaan invivo tempat
yang sebenarnya bakteri tersebut menginfeksi. Dengan demikian ada beberapa faktor yang
memegang peranan penting dari pasien disamping hal-hal yang dapat mempengaruhi hasil
uji kepekaan yang telah diperhitungkan pada metode uji. Faktor tersebut yaitu:
a) Difusi antimikroba pada sel dan jaringan hospes
b) Protein serum pengikat antimikroba
c) Gangguan dan interaksi obat
d) Status daya tahan dan system imun pasien
e) Mengidap beberapa penyakit secara bersamaan
f) Virulensi dan patogenitas bakteri yang menginfeksi
g) Tempat infeksi dan keparahan penyakit

Dasar pemeriksaan uji kepekaan


1. Merupakan metode yang langsung mengukur aktifitas satu atau lebih
antimikroba terhadap inokulum bakteri
2. Merupakan metode yang secara langsung mendeteksi keberadaan mekanisme
resitensi spesifik pada inokulum bakteri
3. Merupakan metode khusus untuk mengukur interaksi antara mikroba dan
antimikroba

Metode-metode pengukuran aktifitas antimikroba


Kemampuan antimikroba dalam melawan bakteri dapat diukur menggunakan metode
yang biasa dilakukan yaitu :
A. Metode konvensional : dilusi (agar atau kaldu), difusi dan Etest
B. Uji kepekaan komersial

Persiapan sebelum uji dilakukan


Beberapa persiapan yang diperlukan untuk melaksanakan uji dengan metode dilusi
dan difusi yaitu meliputi persiapan inokulum dan antimikroba yang akan digunakan
Persiapan inokulum
Persiapan inokulum yang tepat penting untuk uji kepekaan untuk mendapatkan hasil
yang akurat dan konsisten. Ada dua persiapan yang harus dilakukan yaitu: biakan murni dan
pembuatan inokulum standar.
Biakan murni diperlukan karena interpretasi berdasarkan inokulum yang tercampur
tidak dapat diterima dan akan menghambat mendapatkan hasil. Biakan murni dilakukan
dengan mengambil empat atau lima koloni yang sama secara morfologi dan ditanam pada
media perbenihan cair dan dibiarkan tumbuh subur, pada umumnya memerlukan waktu
inkubasi 3 sampai 5 jam.
Bisa juga sebagai alternative 4 sampai 6 koloni berusia 16 sampai 24 jam dipilih dari
media agar dan dibuat suspensi dengan NaCl 0,85% untuk mendapatkan suspensi yang keruh.
Kemudian kekeruhan dibandingkan dengan suspensi standar Mc Farland, pada latar belakang
hitam. Standar Mc Farland dibuat dengan mencampur asam sulfat 1% dan barium klorida
1,175% untuk mendapatkan kekeruhan standar. Standar kekeruhan 0,5 Mc Farland telah
tersedia secara komersial, yang memiliki kekeruhan sebanding dengan 1,5 x 10 8 colony
forming unit(CFU)/ml.

Memilih antimikroba untuk uji kepekaan


Pemilihan antimikroba dilakukan oleh staf medis terutama dokter spesialis penyakit
infeksi dan bila perlu disertai ahli farmasi. Pemilihan berdasarkan kelompok bakteri,
hasil identifikasi bakteri (karena ada beberapa antimikroba spesifik hanya untuk bakteri
tertentu, misalnya ceftadizime spesifik untuk Pseudomonas aeruginosa), spektrum
antimikroba dan tempat asal infeksi (misalnya untuk infeksi saluran urinaria dipilih
nitofurantoin). Deretan antimikroba secara umum didasarkan pada kelompok organisme
,secara umum dibagi menjadi:
1. Enterobacteriaceae
2. Pseudomonas aeruginosa dan Acinetobacter spp
3. Staphylococcus spp
4. Enterococcus spp
5. Streptococcus spp (kecuali S. pneumoniae)
6. Streptococcus pneumonia
7. Haemophilus influenza
8. Neisseria gonorrhoeae

A. Metode konvensional
1. Metode dilusi
Metode dilusi terdiri dari dua teknik pengerjaan yaitu teknik dilusi perbenihan cair dan
teknik dilusi agar. Yang bertujuan untuk penentuan aktifitas antimikroba secara kuantitatif,
antimikroba dilarutkan kedalam media agar atau kaldu, yang kemudian ditanami bakteri
yang akan dites. Setelah diinkubasi semalam, konsentrasi terendah yang dapat menghambat
pertumbuhan bakteri di sebut dengan MIC (minimal inhibitory concentration). Nilai MIC
dapat pula dibandingkan dengan konsentrasi obat yang didapat di serum dan cairan tubuh
lainnya untuk mendapatkan perkiraan respon klinik.
a) Dilusi perbenihan cair
Dilusi perbenihan cair terdiri dari makrodilusi dan mikrodilusi. Pada prinsipnya
pengerjaannya sama hanya berbeda dalam volume. Untuk makrodilusi volume yang
digunakan lebih dari 1 ml, sedangkan mikrodilusi volume yang digunakan 0,05 ml sampai
0,1 ml. Antimikroba yang digunakan disediakan pada berbagai macam pengenceran biasanya
dalam satuan µg/ml, konsentrasi bervariasi tergantung jenis dan sifat antibiotik. (misalnya
cefotaxime untuk uji kepekaan terhadap Streptococcus pneumonia, pengenceran tidak
melebihi 2 μg/ml, sedangkan untuk Escherichia coli pengenceran dilakukan pada 16
µg/ml atau lebih).
Secara umum untuk penentuan MIC pengenceran antimikroba dilakukan penurunan
konsentrasi setengahnya misalnya mulai dari 16, 8, 4, 2, 1, 0,5, 0,25 µg/ml) konsentrasi
terendah yang menunjukkan hambatan pertumbuhan dengan jelas baik dilihat secara visual
atau alat semiotomats dan otomatis, disebut dengan konsentrasi daya hambat minimum/ MIC
(minimal inhibitory concentration).Kondisi untuk uji kepekaan teknik perbenihan cair
terdapat pada lampiran 1.
b) Dilusi agar
Pada teknik dilusi agar, antibiotik sesuai dengan pengenceran akan ditambahkan kedalam
agar, sehingga akan memerlukan perbenihan agar sesuai jumlah pengeceran ditambah satu
perbenihan agar untuk kontrol tanpa penambahan antibiotik , konsentrasi terendah antibiotik
yang mampu menghambat pertumbuhan bakteri merupakan MIC antibiotik yang di uji.
Kondisi untuk uji kepekaan teknik agar dilusi terdapat pada lampiran 2. Salah satu kelebihan
metode agar dilusi untuk penentuan MIC Neisseria gonorrhoeae yang tidak dapat tumbuh
pada teknik dilusi perbenihan cair.

Penentuan MBC dari MIC perbenihan cair


Dasar penentuan antimikroba secara invitro adalah MIC (minimum inhibition
concentration) dan MBC (minimum bactericidal concentration). MIC merupakan konsentrasi
terendah bakteri yang dapat menghambat pertumbuhan bakteri dengan hasil yang dilihat dari
pertumbuhan koloni pada agar atau kekeruhan pada pembiakan kaldu. Sedangkan MBC
adalah konsentrasi terendah antimikroba yang dapat membunuh 99,9% pada biakan selama
waktu yang ditentukan. Agar antimikroba efektif pada MIC atau MBC. Sedapat
mungkin mencapai tempat infeksi. Absorpsi obat dan distribusi antimikroba akan
mempengaruhi dosis, rute dan frekuensi pemberian antimikroba untuk mendapatkan dosis
efektif di tempat terjadinya infeksi
Penentuan konsentrasi minimum antibiotik yang dapat membunuh bakteri
/ minimum bactericidal concentration (MBC) dilakukan dengan menanam bakteri pada
perbenihan cair yang digunakan untuk MIC ke dalam agar kemudian diinkubasi semalam
pada 37⁰C. MBC adalah ketika tidak terjadi pertumbuhan lagi pada agar .
Contoh MBC:
Misalnya pada konsentrasi antibiotik 0 μg/ml,1 μg/ml dan 2 μg/ml menunjukkan
banyak pertumbuhan bakteri. Pada konsentrasi 4 μg/ml,8 μg/ml,16 μg/ml masih
menunjukkan pertumbuhan bakteri tapi jumlah koloninya semakin sedikit
Pada konsentrasi antibiotik 32 μg/ml ,64 μg/ml, pada konsentrasi 32 μg/ml tumbuh 8
koloni bakteri, sedangkan pada 64 μg/ml tidak tumbuh, sehingga MBC (minimum
bactericidal concentration) adalah 64 μg/ml.
Keuntungan dan kerugian metode dilusi:
Dengan teknik dilusi memungkinkan penentuan kualitatif dan kuantitatif dilakukan
bersama-sama.MIC dapat membantu dalam penentuan tingkat resistensi dan dapat menjadi
petunjuk penggunaan antimikroba .Kerugiannya metode ini tidak efisien karena
pengerjaannya yang rumit, memerlukan banyak alat-alat dan bahan serta memerlukan
ketelitian dalam proses pengerjaannya termasuk persiapan konsentrasi antimikroba yang
bervariasi

2. Metode difusi.
Cakram kertas, yang telah dibubuhkan sejumlah tertentu antimikroba, ditempatkan
pada media yang telah ditanami organism yang akan di uji secara merata. Tingginya
konsentrasi dari antimikroba ditentukan oleh difusi dari cakram dan pertumbuhan organism
uji dihambat penyebarannya sepanjang difusi antimikroba (terbenuk zona jernih disekitar
cakram), sehingga bakteri tersebut merupakan bakteri yang sensitif terhadap antimikroba.
Ada hubungan persamaan yang hampir linear (berbanding lurus) antara log MIC, seperti yang
diukur oleh metode dilusi dan diameter zona daya hambat pada metode difusi.
Hasil dari tes kepekaan, mikroorganisme diklasifikasikan ke dalam dua atau lebih
kategori. Sistim yang sederhana menentukan dua kategori yaitu sensitif dan resisten.
Meskipun klasifikasi tersebut memberikan banyak keuntungan untuk kepentingan statistik
dan epidemiologi, bagi klinisi merupakan ukuran yang terlalu kasar untuk digunakan. Dengan
demikian hasil dengan 3 klasifikasi yang biasa digunakan, (sensitif, intermediate, dan
resisten) seperti pada metode Kirby-Bauer. Terapi antimikroba idealnya berdasarkan
penentuan bakteri penyebab dan antimikroba sesuai yang sensitif terhadap bakteri tersebut.
Pengobatan secara empiris biasanya dimulai sebelum ada hasil laboratorium
mikrobiologi, ketika pengobatan harus dilakukan sebelum penyakit menjadi bertambah parah
. efektifitas antimikroba bervariasi tergantung lokasi infeksi, kemampuan antimikroba
mencapai sumber infeksi dan kemampuan bakteri untuk menahan atau menginaktifasi
antimikroba. Beberapa antimikroba dapat bertindak sebagai bakterisidal (benar-benar
membunuh bakteri) sedangkan yang lain bertindak sebagai bakteriostatik (mencegah bakteri
berkembang biak), dengan demikian sistem imun hospes mempengaruhi kepekaan terhadap
bakteri tersebut..
Di laboratorium klinik, uji kepekaan lebih banyak digunakan metode cakram difusi.
Pada metode ini inokulum bakteri ditanam secara merata pada permukaan agar.
Cakram antimikroba diletakkan pada permukaan agar dan dibiarkan berdifusi ke dalam
media sekitarnya. Hasilnya dilihat zona hambat antimikroba terhadap pertumbuhan bakteri.
Ukuran zona jernih tergantung kepada kecepatan difusi antimikroba, derajat sensitifitas
mikroorganisme dan kecepatan pertumbuhan bakteri. Zona hambat cakram antimikroba pada
metode difusi berbanding terbalik dengan MIC. Semakin luas zona hambat, maka semakin
kecil konsentrasi daya hambat minimum MIC. Untuk derajat kategori bakteri dibandingkan
terhadap diameter zona hambat yang berbeda-beda setiap antimikroba, sehingga dapat
ditentukan kategori resisten, intermediate atau sensitif terhadap antimikroba uji.
Tabel.1 Standar Diameter zona interpretasi dan perkiraan kaitannya MIC untuk penentuan kategori serta
interpretasi hasil
Diameter zona (millimeter tedekat) Perkiraan kaitan dengan MIC
Antimikroba untuk masing-masing kategori (mikro gm/ml) untuk:
(jumlah tiap cakram)
Dan organisme R I MS S R S
Ampicillin (10 µg)

Enterobacteriaceae <11 12-13 >14 >32 <8

beta-
Staphylococcus spp. <28 >29 <0.25
Lactamase
Haemophilus spp. <19 >20 >4 <2
Enterococci <16 >17 >16
Other streptococci <21 22-29 >30 >4 <0.12
Chloramphenicol
<12 13-17 >18 >25 <12.5
(30 µg)
Erythromycin
<13 14-17 >18 >8 <2
(15 µg)
Asam nalikdisat
<13 14-18 >19 >32 <12
(30 µg)
Streptomycin (10µg) <11 12-14 >15
Tetracycline (30 µg) <14 15-18 >19 >16 <4
Trimethoprim (5 µg) <10 11-15 >16 >16 <4
.
ANTIBIOTIK
Antibiotik adalah segolongan senyawa, baik alami maupun sintetik, yang dihasilkan
oleh mikroorganisme bakteri ataupun jamur. Pada dasarnya tujuan utama penggunaan
antibiotik untuk meniadakan infeksi, namun semakin luasnya penggunaan antibiotik sekarang
ini justru semakin meluas pula timbulnya infeksi baru akibat penggunaan antibiotik yang
tidak rasional.
Penggolongan Antibiotik berdasarkan mekanisme kerjanya :
 Inhibitor sintesis dinding sel bakteri, mencakup golongan Penicillin, Polypeptide dan
Cephalosporin
 Inhibitor transkripsi dan replikasi, mencakup golongan Quinolone,
 Inhibitor sintesis protein, mencakup banyak jenis antibiotik, terutama dari golongan
Macrolide, Aminoglycoside, dan Tetracycline
 Inhibitor fungsi membran sel, misalnya ionomycin, valinomycin;
 Inhibitor fungsi sel lainnya, seperti golongan sulfa atau sulfonamida,
 Antimetabolit, misalnya azaserine.
Penggolongan Antibiotik berdasarkan struktur kimia :
 Aminoglikosida
Diantaranya amikasin, dibekasin, gentamisin, kanamisin, neomisin, netilmisin,
paromomisin, sisomisin, streptomisin, tobramisin.
 Beta-Laktam
Diantaranya golongan karbapenem (ertapenem, imipenem, meropenem), golongan
sefalosporin (sefaleksin, sefazolin, sefuroksim, sefadroksil, seftazidim), golongan beta-laktam
monosiklik, dan golongan penisilin (penisilin, amoksisilin).
 Glikopeptida
Diantaranya vankomisin, teikoplanin, ramoplanin dan dekaplanin.
 Polipeptida
Diantaranya golongan makrolida (eritromisin, azitromisin, klaritromisin,
roksitromisin), golongan ketolida (telitromisin), golongan tetrasiklin (doksisiklin,
oksitetrasiklin, klortetrasiklin).
 Polimiksin
Diantaranya polimiksin dan kolistin.
 Kinolon (fluorokinolon)
Diantaranya asam nalidiksat, siprofloksasin, ofloksasin, norfloksasin, levofloksasin,
dan trovafloksasin.
 Streptogramin
Diantaranya pristinamycin, virginiamycin, mikamycin, dan kinupristin-dalfopristin.
 Oksazolidinon
Diantaranya linezolid dan AZD2563.
 Sulfonamida
Diantaranya kotrimoksazol dan trimetoprim.
 Antibiotika lain yang penting, seperti kloramfenikol, klindamisin dan asam fusidat.
Penggolongan Antibiotik berdasarkan daya kerjanya :
Bakterisid
Antibiotika yang bakterisid secara aktif membasmi kuman. Termasuk dalam golongan
ini adalah penisilin, sefalosporin, aminoglikosida (dosis besar), kotrimoksazol , polipeptida,
rifampisin, isoniazid dll.
Bakteriostatik
Antibiotika bakteriostatik bekerja dengan mencegah atau menghambat pertumbuhan
kuman, tidak membunuhnya, sehingga pembasmian kuman sangat tergantung pada daya
tahan tubuh. Termasuk dalam golongan ini adalah sulfonamida, tetrasiklin, kloramfenikol,
eritromisin, trimetropim, linkomisin, makrolida, klindamisin, asam paraaminosalisilat, dll.
Antibiotik Spektrum Luas

Pada penggunaan antibiotik spektrum luas, tumpang tindih antara bakteriostatik dan
bakterisidal menjadi tidak jelas. Pada konsentrasi tinggi, obat-obat golongan bakteriostatik dapat
memiliki efek bakterisidal pada mikroba yang sesuai. Sebagai contohnya:

a. Antibiotik golongan makrolid adalah golongan bakteriostatik, tetapi eritromisin, azitromisin


dan klaritomisin menunjukkan kerja bakterisidal pada in vitro terhadap Streptococcus
pyogenes dan Streptococcus pneumonia
b. Kloramfenikol memiliki efek bakterisidal terhadap Streptococcus pneumonia, tetapi memiliki
efek bakteriostatik pada Streptococcus aureus dan Streptococcus grup B
c. Klindamisin dapat memiliki efek bakterisidal tergantung mikroorganisme penyebab dan
lingkungan
d. Linezolid memiliki efek bakteriostatik pada pengobatan Staphylococcus dan Enterococcus,
namun memilik efek bakterisidal terhadap Streptococcus

Sebaliknya, antibiotik bakterisidal spektrum luas juga memiliki efek bakteriostatik. Antibiotik
bakterisidal dalam konsentrasi rendah biasanya memiliki efek bakteriostatik, misalnya Quinupristin-
dalfopristin memiliki efek bakterisidal terhadap Staphylococcus dan Streptococcus namun memiliki
efek bakteriostatik terhadap Enterococcus faecium.

Pembagian antibiotik menjadi kelompok bakteriostatik dan bakterisidal merupakan


pembagian berdasarkan temuan laboratorium. Definisi dan batasan ini tidak dapat digunakan dalam
kondisi klinis. Pada dasarnya, untuk penggunaan klinis, kerja antibiotik tidak dapat dibatasi pada
kedua kelompok itu. Penggunaan antibiotik golongan bakterisidal dosis rendah dapat menunjukkan
efek bakteriostatik. Sebaliknya, dalam keadaan klinis, penggunaan bakteriostatik dosis tinggi dapat
menunjukkan efek matinya mikroorganisme seperti pada golongan bakteriosidal
Faktor yang lebih penting pada keberhasilan terapi pasien infeksi adalah agen penyebab
infeksi, spektrum, dosis dan waktu pemberian antibiotik, lokasi infeksi dan faktor sistem imun pejamu

Tidak ada perbedaan signifikan antara penggunaan antibiotik golongan bakterisidal dan bakteriostatik
dinilai dari keberhasilan terapi dan angka kematian. Antibiotik golongan bakteriostatik tidak lebih
inferior dibanding antibiotik golongan bakterisidal, serta tidak menyebabkan tingkat kekambuhan
penyakit yang lebih tinggi.

Penggolongan antibiotik berdasarkan spektrum kerjanya :


1. Spektrum luas (aktivitas luas) :
Antibiotik yang bersifat aktif bekerja terhadap banyak jenis mikroba yaitu bakteri gram
positif dan gram negative. Contoh antibiotik dalam kelompok ini adalah sulfonamid,
ampisilin, sefalosforin, kloramfenikol, tetrasiklin, dan rifampisin.
2. Spektrum sempit (aktivitas sempit) :
Antibiotik yang bersifat aktif bekerja hanya terhadap beberapa jenis mikroba saja, bakteri
gram positif atau gram negative saja. Contohnya eritromisin, klindamisin, kanamisin, hanya
bekerja terhadap mikroba gram-positif. Sedang streptomisin, gentamisin, hanya bekerja
terhadap kuman gram-negatif.
1. Metode Kirby Bauer (Disk)

Cara Kirby-Bauer merupakan suatu metode uji sensitivitas bakteri yangdilakukan dengan
membuat suspensi bakteri pada media Brain Heart Infusion(BHI) cair dari koloni
pertumbuhan kuman 24 jam, selanjutnya disuspensikandalam 0,5 mL BHI cair (diinkubasi 4-
8 jam pada suhu 37

HasiL inkubasibakteri diencerkan sampai mencapai standar konsentrasi kuman 108


CFU/mL.Suspensi bakteri diuji sensitivitas dengan meratakan suspensi bakteritersebut pada
permukaan media agar. Disk antibiotik diletakkan di atas mediatersebut dan kemudian
diinkubasi pada suhu 37

 Cara Kerja

Pengujian aktivitas antibakteri dilakukan dengan metode Kirby-Baueryang dikenal


dengan sebutan metode cakram kertas:1.

 Tiap-tiap cakram kertas kosong sebelumnya dipanaskan dalam oven dengansuhu


70°C selama 15 menit, kemudian kertas cakram dicelupkan ke dalamlarutan uji.2.
 Cakram yang telah berisi supernatan, kemudian didiamkan selama 15 menitsebelum
diletakkan pada media uji.3.
 Kemudian secara aseptik, setelah kertas cakram menyerap supernatantersebut,
masing-masing diletakkan pada permukaan medium yang telahberisi mikroba uji.
 Jumlah cakram kertas yang diletakkan tersebut kira-kira dalam satu cawanPetri berisi
6-7 buah, dan masing-masing jarak antara cakram diatur supayatidak terlalu dekat.
 Sebagai kontrol positif digunakan cakram Ampisilin 10 μg dan untuk kontrol
 negatif digunakan cakram kosong steril.
 Pengujian dilakukan dengan tiga ulangan.
 Setelah inkubasi pada suhu 37°C selama 18-24 jam, dilakukan pengukurandiameter
zona hambat, yaitu zona bening yang terbentuk di sekitar cakram,dengan
menggunakan penggaris milimeter
 Uji kepekaan Metode agar difusi Kirby-Bauer

Bahan yang diperlukan :

 Agar Muller Hinton


 Cakram antibiotik
 Inokulum Standar Mc farland 0,5

Cara kerja:

1) Disiapkan agar Muller Hinton kondisikan pada suhu ruangan dan permukaan agar
kering
2) Persiapkan inokulum 0,5 Mc Farland (dibuat baru dari 4-6 koloni dalam 2 ml NaCl
fisiologis, digunakan tidak lebih dari 15 menit dan supaya homogen bisa dibantu
dengan vortex)
3) Penanaman pada agar Muller Hinton
4) Celupkan swab steril ke dalam inokulum bakteri , angkat swab kemudian di atas
permukaan suspensi inokulum pada sisi tabung putar swab dengan sedikit ditekan
agar tidak berlebih
5) Goreskan swab pada agar Muller Hinton dengan memutar agar sekitar 60 derajat 2
sampai 3
6) Putarkan swab pada pinggiran agar untuk mengambil kelebihan suspensi bakteri pada
sekeliling cawan petri
7) Tempatkan cakram antibiotik pada permukaan agar yang telah ditanami
bakteri dengan memperhatikan jarak penyimpanan cakram. Dapat dilakukan
menggunakan pinset steril atau disk feeder

 Uji Antibakterial dengan Metode Kirby Bauer


1) Biakan bakteri pada media Nutrient Broth diswab merata pada permukaanmedia
Mueller Hinton Agar (MHA), dibiarkan 5 menit.2.
2) Jumlah bakteri yang sesuai dengan standar Mc Farland 3 (±9x108/ml).3.
3) Kertas cakram kosong yang telah direndam ekstrak etanol sampel danrebusan sampel,
kemudian diletakkan pada cawan petri steril selama 5 menitsampai tidak ada cairan
yang menetes.4.
4) Kemudian kertas cakram diletakkan pada permukaan media MHA ditekansedikit agar
melekat.5.
5) Sebagai kontrol positif digunakan kertas cakram antibiotik ciprofloksasin 5μg.
6) Kemudian media MHA diinkubasi pada temperatur 37°C selama 24 jam.Diukur luas
zona hambat yang terbentuk dengan menggunakan jangka sorong(caliver ).

Kelebihan dan Kekurangan Metode Defusi Cakram


o Kelebihan Metode Defusi Cakram adalah mudah dilakukan, tidak
perlumemerlukan peralatan khusus dan relative murah.
o Kekurangan Metode Defusi Cakram adalah ukuran zona bening yangterbentuk
tergantung oleh kondisi inkubasi, inoculum, predifusi, danpreinkubasi serta
ketebalan medium.
Kendala Penelitian

Kendala penelitian dari cakram disk adalah cakram disk harusdirendam dahulu di dalam
cawan petri yang berisi ekstrak daun sirih dan pelarutetanol, lalu cakram diletakkan di atas
agar MHA.Cara meletakkan antibiotic juga bisa menjadi kendala dalam penelitian.Menekan
antibiotic terlalu dalam ke agar membuat zona hambat tidak terlihat danantibiotic menjadi
rusak.Serta lama inkubasi juga mempengaruhi zona hambat, jika inkubasiterlalu lama
membuat zona hambat menyempit.

2. Media hidup

Media hidup umumnya dipakai dalam laboratorium virologi untuk pembiakan berbagai
virus, sedangkan dalam bakteriologi hanya beberapa jenis kuman tertentu saja dan terutama
hewan percobaan. Contoh media hidup antara lain: hewan percobaan (termasuk manusia),
telur berembrio, biakan jaringan, dan sel-sel biakan bakteri tertentu untuk bakteriofaga.

 Media mati

Berdasarkan konsistensinya

 Media padat, terbagi media agar miring, agar deep, misalnya: agar buylon, agar endo,
agar ss, dan sebagainya.
 Media setengah padat: agar buylon setengah padat (buylon=kaldu).
 Media cair : air buylon, air pepton, deret gula-gula.
 Media padat diperoleh dengan menambahkan agar. Agar berasal dari ganggang
digunakan sebagai bahan pemadat karena tidak diuraikan oleh mikroba, dan membeku
pada suhu di atas 45o C. Media setengah padat digunakan untuk melihat gerak kuman
secara mikroskopik.

Standar Turbiditas McFarland


METODE PERHITUNGAN BAKTERI STANDARD McFarland

Jumlah mikrobia pada suatu bahan dapat ditentukan dengan bermacam-macam cara,
tergantung pada bahan dan jenis mikrobianya. Ada 2 cara perhitungan jumlah mikrobia yaitu
perhitungan secara langsung (direct method) dan secara tidak langsung (indirect method).
Perhitungan jumlah mikrobia secara langsung dipakai untuk menunjukkan jumlah
mikrobia keseluruhan baik yang mati maupun yang hidup. Ada beberapa cara perhitungan
antara lain: menggunakan counting chamber (haemocytometer); menggunakan cara
pengecatan dan pengamatan; serta menggunakan filter membran. Sedangkan perhitungan
jumlah mikroba secara tidak langsung dipakai untuk menentukan jumlah mikroba yang hidup
atau yang mati atau hanya untuk menentukan jumlah yang hidup saja tergantung cara ayang
digunakan. Cara yang paling sering digunakan dalam perhitungan secara tidak langsung
adalah berdasakan jumlah koloni (plate count). Pada perhitungan dengan cara ini diperlukan
beberapa syarat yang harus dipenuhi antara lain:

Jumlah koloni tiap petridish antara 30-300 koloni, jika memang tidak ada yang
memenuhi syarat, dipilih yang jumlahnya mendekati 300.

Tidak ada koloni yang menutup lebih besar dari setengah luas petridish, koloni
tersebut dikenal sebagai spreader.

Perbandingan jumlah bakteri dan hasil pengenceran yang berturut-turut antara


pengenceran yang lebih besar dengan pengenceran sebelumnya jika sama atau lebih kecil dari
2 hasilnya dirata-rata; tetapi jika lebih besar dari 2 yang diapakai jumlah mikrobia dari hasil
pengenceran sebelumnya.

Jika dengan ulangan setelah memenuhi syarat hasilnya dirata-rata. Penghitungan jumlah sel
terdapat 6 macam, yaitu :

 Hitungan mikroskopik
 Hitungan cawan (TPC)
 MPN (Most Probable Number)
 Hitungan McFarland
 Hitungan spektrometry
 Hitungan haemocytometer

Standard McFarland merupakan suatu bentuk skala yang memiliki ukuran dari nomor
satu hingga sepuluh, skala ini menunjukkan konsentrasi bakteri per mili liter. Standard ini
dibuat untuk memperkirakan konsentrasi bakteri Gram negatif (Whitman and MacNair,
2004). Standard McFarland adalah penyetaraan konsentrasi mikroba dengan menggunakan
larutan BaCl21% dan H2SO4 1%. Standar kekeruhan McFarland ini dimaksudkan untuk
menggantikan perhitungan bakteri satu per satu dan untuk memperkirakan kepadatan sel yang
akan digunakan pada prosedur pengujian antimikroba.
Standard McFarland dapat digunakan untuk menentukanperkiraan konsentrasi sel
pada suspensi atau larutan. Hasil perkiraan konsentrasinya dalam satuan CFU/mL, dan
standar ini digunakan untuk mengukur konsentrasi bakteri Gram negatif seperti E. coli.
Tetapi penggunaannya menjadi kurang akurat bila digunakan pada jenis bakteri lain yang
berbeda ukuran dan berat, demikian juga bila digunakan pada jamur dan ragi. Perlu dilakukan
kalibrasi dan validasi lagi agar diperoleh hasil yang benar.
Pada umumnya standard McFarland ditempatkan pada tabung dengan label nomor 1 hingga
10 yang diisi dengan larutan garam Barium. Setiap tabung diperkirakan kepadatan bakteri
dengan membandingkan nomor skala McFarland. Jadi, tabung nomor 7 menunjukkan
kepadatan bakteri pada konsentrasi 2,1 x 109/ml. Untuk menunjukkan perkiraan populasi
bakteri, kepadatannya dapat dibandingkan secara visual menggunakan standard McFarland.
Jika kepadatannya antara skala nomor tujuh dan delapan, maka kepadatan bakteri per mililiter
antara 2,1 dan 2,4 milyar/ml.
Keuntungan dari penggunaan standar McFarland adalah tidak dibutuhkannya waktu
inkubasi yang cukup untuk memperoleh jumlah kepadatan bakteri yang diinginkan.
Sedangkan kerugiannya, akan terjadi perbedaan pandangan untuk menilai tingkat kekeruhan
dari sel bakteri.
Oleh karena itu, untuk menilai kekeruhannya dapat digunakan spektrofotometer
dengan panjang gelombang 600 nm (setara dengan panjang gelombang E.coli). Standar Mc
Farland meliputi satu set tabung dengan konsentrasi bertingkat dari Barium Sulfat. Kepadatan
bakteri yang dihitung dari 101 hingga 1010. Meskipun secara umum sudah banyak yang
menjual larutan standar Mc Farland dari sumber yang lain (Latex), namun secara tradisional
larutan standar Mc Farland menggunakan standar Barium Sulfat.

Standar McFarland secara umum berlabel 0,5–10 danberisilarutangaram Barium.


Standar McFarland dapat digunakan untuk mengetahui konsentrasi sel dalam suatu suspensi
secara visual. Skala McFarland di disain untuk memperkirakan konsentrasi bakteri Gram
negatif seperti E.coli. Kekurangan dari standar McFarland yaitu hasil perkiraan menjadi tidak
akurat dengan adanya organisme lain seperti khamir dan kapang.
Berikut ini cara membuat larutan standar Mac Farland dengan menggunakan standar
Barium Sulfat:
1. Buat larutan 1.175% (b/v) Barium klorida (BaCl2)
2. Buat larutan 1% (b/v) Asam sulfat (H2SO4)
3. Campurkan kedua larutan ini berdasarkan rasio, dengan pemberian H2SO4 terlebih
dahulu
4. Tutup tabung dengan rapat dan simpan pada suhu ruang di tempat gelap.
Larutan ini akan stabil paling tidak untuk 6 bulan. Penggunaannya yaitu kocok
tabung beberapa kali atau menggunakan vortex untuk mensuspensi ulang endapan barium
sulfat. Perbandingan terbaik antara bakteri dan standar Mac Farland dilakukan menggunakan
kertas dengan latar belakang garis horizontal hitam putih.
Alat dan bahan:
 1% BaCl2 Bunsen
 Aquades Jarumose
 1% H2SO4 12 Tabungreaksi
 Raktabung Larutan PBS
 Pipetukur Media kulturcair
 Sentrifuge Isolat

Prosedur Kerja :
A. Pembuatan standar McFarland
Disiapkan 11 tabung reaksi pada rak tabung dan dilabeli sesuai dengan skala
McFarland (lihat pada Tabel 1.).
Setiap tabung diisi dengan menggunakan larutan 1% BaCl2dan 1% H2SO4 sesuai standar
McFarland.
B. Pembuatan Kultur Bakteri
1. Disiapkan satu tabung yang berisi 10 ml media kultur cair.
2. Bahan isolate diambil menggunakan jarum ose, kemudian ditanam pada media dan
diinkubasi selama 24 jam.
3. Disentrifuge pada kecepatan 1500 rpm selama 3 menit. Super natan dibuang.
4. Endapan ditambah dengan larutan PBS sampai volumenya sama dengan volume awal
sebelum supernatant dibuang.
C. Pengamatan
Pengamatan dilakukan dengan membandingkan antara turbiditas kultur bakteri
dengan standard McFarland 0,5-10. Pilihlah standar McFarland mana yang memiliki
turbiditas sama dengan turbiditas bakteri dan lihat hasilnya pada table skala McFarland.
Misalnya, apa bila turbiditas bakteri sama dengan standard McFarland no. 2, artinya
kepadatan bakteri tersebut 600 x 106/ml.

Skala Mc Farland 1.175% BaCl2 (ml) 1% H2SO4 (ml)


0.5 0.05 9.95
1 0.1 9.9
2 0.2 9.8
3 0.3 9.7
4 0.4 9.6
5 0.5 9.5
6 0.6 9.4
7 0.7 9.3
8 0.8 9.2
9 0.9 9.1
10 1.0 9.0

Jumlah Bakteri Dalam Skala McFarland


SkalaMcFarland Bakteri(x106/ml)
0,5 <300
1 300
2 600
3 900
4 1,200
5 1,500
6 1,800
7 2,100
8 2,400
9 2,700
10 3,000

Metode Difusi Cakram


Cara yang mudah untuk menetapkan kerentanan organisme terhadap antibiotik adalah
dengan menginokulasi pelat agar dengan biakan dan membiarkan antibiotik terdifusi ke
media agar. Cakram yang telah mengandung antibiotik diletakkan di permukaan pelat agar
yang mengandung organisme yang diuji. Pada jarak tertentu pada masing-masing
cakram,antibiotik terdifusi sampai titik antibiotik tersebut tidak lagi menghambat
pertumbuhan mikroba.Efektivitas antibiotik ditunjukkan oleh zona hambatan. Zona hambatan
terlihat sebagai area jernih atau bersih mengelilingi cakram tempat zat dengan aktivitas
antimikroba terdifusi. Diameter zona dapat diukur dengan penggaris dan hasil dari
eksperimen ini merupakan satu antibiogram. Ukuran zona hambatan dapat dipengaruhi oleh
kepadatan media biakan, kecepatan difusi antibiotik,konsentrasi antibiotik pada cakram
filter,sensitivitas organisme terhadap antibiotik, dan interaksi antibiotik terhadap media.suatu
zat yang mempunyai efek samping signifikan tidak boleh digunakan (Harmita dkk, 2008).
Pada praktikum ini cakram antibiotik yang dipakai yaitu cakram chloramphenicol (30 µg),
cakram ciprofloxacine (5 µg) dan cakram tetrasiklin (30 µg).