TUGAS MAKALAH

ANALISIS SEDIAAN OBAT DENGAN METODE KCKT

Disusun Oleh Kelompok 3 :

La Ode Muh. Alfiqra

Sri Handayani
Wa ode fitra saripati
Anissa putri dwi yanti
Monica citra defanti
Ahmad rizal
Nova destika ramadhani
Nur intan
Zelty wardina
Suriadin

PROGRAM STUDI S1 FARMASI

STIKES MANDALA WALUYA KENDARI
2019
 KATA PENGANTAR

Segala puji kita panjatkan kehadirat Tuhan Yang Maha Esa yang telah
memberikan rahmat dan hidayah-Nya sehingga kami dapat menyelesaikan
makalah ini, dan kami buat dengan waktu yang telah di tentukan.
Semoga makalah ini dapat bermanfaat bagi kita semua dan dengan adanya
penyusunan makalah seperti ini, pembaca dapat belajar dengan baik dan benar
mengenai Analisis sediaan obat dengan metode KCKT.
Penulis mengucapkan terimah kasih kepada pihak-pihak yang telah
memberi sumbangsi kepada kami dalam penyelesaian makalah ini. Dan tentunya
penulis juga menyadari, bahwa masih terdapat banyak kesalahan dan kekurangan
pada makalah ini. Hal ini Karena keterbatasan kemampuan dari penulis. Oleh
karena itu, penulis senantiasa menanti kritik dan saran yang bersifat membangun
dari semua pihak guna penyempurnaan makalah ini.
Semoga dengan adanya makalah ini kita dapat belajar bersama demi
kemajuan kita dan kemajuan ilmu pengetahuan.
Amien.
 DAFTAR ISI
KATA PENGANTAR
DAFTAR ISI
BAB I PENDAHULUAN
I.1 Latar Belakang
I.2 Tujuan
BAB II PEMBAHASAN
II.1 Pengertian KCKT
II.2 Pembagian KCKT
II.3 Instrumen KCKT
II.4 Prinsip kerja KCKT
II.5 Manfaat penggunaan KCKT
II.6 Kelebihan dan kekurangan KCKT
II.7 Jurnal tentang suatu sediaan yang berkaitan dengan KCKT
BAB III PENUTUP
A. Kesimpulan
JURNAL
DAFTAR PUSTAKA
 BAB I
PENDAHULUAN
I.1 Latar Belakang
Kromatografi adalah istilah umum untuk berbagai cara pemisahan berdasarkan
partisi cuplikan antara fasa yang bergerak, dapat berupa gas atau zat cair, dan fasa
diam, dapat berupa zat cair atau zat padat. Kita biasanya menganggap Tswett
sebagai penemu kromatografi, yang pada tahun 1903 menguraikan karyanya
mengenai pemakaian kolom kapur untuk memisahkan pigmen dalam daun. Istilah
‘kromatografi’ dipakai oleh Tswett untuk menggambarkan daerah berwarna yang
bergerak ke bagian bawah kolom
Kromatografi merupakan suatu cara pemisahan unsur-unsur yang akan
dipisahkan terdistribusikan antara dua fasa, satu dari fasa-fasa ini membentuk
suatu lapisan stasioner dengan luas permukaan yang besar dan yang lainnya
merupakan cairan yang merembes lewat atau melalui fase yang stasioner. Fasa
stasioner mugkin suatu zat padat atau suatu cairan, dan fasa yang bergerak
mungkin suatu cairan atau suatu gas. Maka semua jenis kromatografi yang
dikenal, terbagi menjadi empat golongan: cair-padat, gas-padat, cair-cair, dan gas-
cair.
Pembahasan teknik kromatografi modern, baru lengkap bila disebut
kromatografi cairan kinerja tinggi (HPLC). Kromatografi cairan kolom
klasik merupakan prosedur pemisahan yang sudah mapan dalam mana fase cair
yang mobil mengalir lambat-lambat lewat kolom karena gravitasi. Umumnya
metode itu dicirikan oleh efisiensi kolom yang rendah dan waktu pemisahan yang
lama. Namun sejak kira-kira tahun 1969, perhatian dalam teknik kolom cairan
hidup kembali dengan sangat menyolok karena dikembangkannya sistem tekanan
tinggi oleh Kirchland dan Huber, yang bekerja pada tekanan sampai 2,07 x 107
Nm-2 (3000 p.s.i). Dalam metode ini digunakan kolom berdiameter kecil (1-3 mm)
dan eluen dipompakan ke dalamnya dengan laju alir yang tinggi (sekitar 1-5
cm3m-1). Pemisahan dengan metode ini dilakukan jauh lebih cepat (sekitar 100
kali lebih cepat) daripada dengan kromatografi cairan yang biasa.
II.2 Rumusan Masalah
1. Jelaskan pengertian KCKT ?
2. Jelaskan pembagian KCKT?
3. Jelaskan instrumen KCKT?
4. Jelaskan prinsip kerja KCKT?
5. Jelaskan manfaat penggunaan KCKT?
6. Jelaskan kelebihan dan kekurangan KCKT?
7. Jelaskan jurnal tentang suatu sediaan yang berkaitan dengan KCKT?
 BAB II
PEMBAHASAN

II.1 PENGERTIAN
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) atau High Performance Liquid
Chromatography (HPLC) merupakan salah satu metode fisikokimia berdasarkan
pada teknik kromatografi di mana fase geraknya berupa cairan dan fase diam
dapat dalam bentuk cair atau padat.
Metode ini sangat bermanfaat di bidang farmasi untuk menganalisis secara
simultan beberapa analit dalam martiks sederhana maupun kompleks
Pada akhir 1960-an, semakin banyak usaha untuk pengembangan
kromatografi cair sebagai suatu teknik untuk mengimbangi kromatografi gas.
KCKT adalah kromatografi cair kolom modern, yang dasarnya merupakan
pengembangan dari kromatografi kolom menjadi suatu sistem pemisahan yang
cepat dan efisien.
Peningkatan kecepatan dan efisiensi pemisahannya terkait dengan
peningkatan performa kolomnya yang menggunakan kolom dengan ukuran
dimensi dan partikel yang jauh lebih kecil dari kolom yang dipakai pada
kromatografi kolom, sehingga agar fase gerak dapat mengalir pada kolom, fase
gerak dipompa dengan tekanan tinggi. Di samping itu, kinerja tingginya dalam
analisis didukung dengan adanya berbagai sistem deteksi dengan kepekaan tinggi
yang dapat diintegrasikan dengan sistem kromatografinya.
KCKT dapat dipandang sebagai pelengkap Kromatografi gas (KG),
keduanya dapat digunakan untuk menghasilkan efek pemisahan yang sama
baiknya. Bila derivatisasi diperlukan dalam KG, namun pada KCKT zat-zat yang
tidak diderivatisasi dapat dianalisis. Untuk zat-zat yang labil pada pemanasan atau
tidak menguap, KCKT adalah pilihan utama. Namun demikian bukan berarti
KCKT menggantikan KG, tetapi akan memainkan peranan lebih besar dalam
analisis.
KCKT menawarkan beberapa keuntungan dibanding dengan metode
kromatografi lainnya, antara lain :
a. Cepat :: waktu analisis umumnya kurang dari 1 jam. Banyak analisis yang
dapat diselesaikan sekitar 15-30 menit. Untuk analisis
yang uncomplicated waktu analisis kurang dari 5 menit bisa dicapai.
b. Resolusi tinggi :: berbeda dengan KG, interaksi selektif dapat terjadi pada
KCKT karena pengaruh yang besar dari fase diam dan fase geraknya.
c. Sensitivitas detektor :: detektor absorbsi UV yang biasa digunakan dalam
KCKT dapat mendeteksi kadar dalam jumlah nanogram (10-9 gram) dari
bermacam-macam zat. Detektor-detektor fluoresensi dan elektrokimia dapat
mendeteksi jumlah sampai picogram (10-12 gram).
d. kolom dapat digunakan kembali :: berbeda dengan kolom kromatografi
klasik, kolom KCKT dapat digunakan kembali. Banyak analisis yang bisa
dilakukan dengan kolom yang sama sehingga satu kolom dapat digunakan
berulang kali untuk berbagai jenis sampel.
e. Ideal untuk zat termolabil dan volatilitas rendah :: zat-zat yang tidak bisa
dianalisis dengan KG karena terurai oleh suhu tinggi atau volatilitasnya
rendah dan dapat dianalisis secara KCKT.
f. Mekanisme pemisahan lebih variatif :: banyaknya pilihan fase gerak dan fase
diam yang digunakan serta besarnya interaksi analit terhadap fase diam dan
fase gerak memungkinkan terjadinya pemisahan dengan berbagai mekanisme.
g. Mudah rekoveri sampel :: umumnya detektor yang digunakan dalam KCKT
tidak menyebabkan kerusakan pada komponen sampel yang diperiksa,
sehingga komponen sampel tersebut dapat dengan mudah dikumpulkan
setelah melewati detektor.
Namun, jika dibandingkan dengan kromatografi lapis tipis kinerja tinggi,
KCKT memiliki beberapa kelemahan, yaitu :
1. Tidak dapat menganalisis lebih dari satu jenis sampel sekaligus
2. Kromatogram tidak dapat disimpan sebagai dokumen otentik
 Kromatografi cair kinerja tinggi merupakan suatu metode pemisahan
canggih dalam analisis farmasi yang dapat digunakan sebagai uji identitas, uji
kemurnian dan penetapan kadar. Titik beratnya adalah untuk analisis senyawa-
senyawa yang tidak mudah menguap dan tidak stabil pada suhu tinggi, yang tidak
bisa dianalisis dengan metode KG. Banyak senyawa yang dapat dianalisis dengan
KCKT mulai dari senyawa ion anorganik sampai senyawa organik makromolekul.
Untuk analisis dan pemisahan obat/bahan obat campuran rasemis optis aktif
dikembangkan suatu fase pemisahan kiral yang mampu menetukan rasemis dan
isomer aktif.
Walaupun disadari biaya yang dibutuhkan untuk analisis dengan KCKT
sangat mahal, namun metode ini tetap dipilih untuk digunakan menganalisis 277
obat / bahan obat karena hasil analisis yang memiliki akurasi dan presisi yang
tinggi dalam waktu analisis yang cepat.
Secara umum KCKT digunakan dalam kondisi-kondisi berikut:
1. Pemisahan berbagai senyawa organik maupun anorganik, ataupun spesimen
biologis
2. Analisis ketidakmurnian (impurities)
3. Analisis senyawa-senyawa yang tak mudah menguap (non-volatil)
4. Penentuan molekul-molekul netral, ionik maupun zwitter ion
5. Isolasi dan pemurnian senyawa
6. Pemisahan senyawa-senyawa dengan struktur kimia yang mirip
7. Pemisahan senyawa-senyawa dalam jumlah kecil (trace elements)

B. Jenis- Jenis HPLC

Pemisahan dengan HPLC dapat dilakukan dengan fase normal (jika fase
diamnya lebih polar dibanding dengan fase geraknya) atau fase terbalik (jika fase
diamnya kurang non polar dibanding dengan fase geraknya). Berdasarkan pada
kedua pemisahan ini, sering kali HPLC dikelompokkan menjadi HPLC fase
normal dan HPLC fase terbalik. Selain klasifikasi di atas, HPLC juga dapat
dikelompokkan berdasarkan pada sifat fase diam dan atau berdasarkan pada
mekanisme sorpsi solut, dengan jenis-jenis HPLC sebagai berikut:
1. Kromatografi Adsorbsi
Prinsip kromatografi adsorpsi telah diketahui sebagaimana dalam
kromatografi kolom dan kromatografi lapis tipis. Pemisahan kromatografi
adsorbsi biasanya menggunakan fase normal dengan menggunakan fase diam
silika gel dan alumina, meskipun demikian sekitar 90% kromatografi ini memakai
silika sebagai fase diamnya. Pada silika dan alumina terdapat gugus hidroksi yang
akan berinteraksi dengan solut. Gugus silanol pada silika mempunyai reaktifitas
yang berbeda, karenanya solut dapat terikat secara kuat sehingga dapat
menyebabkan puncak yang berekor.
2. Kromatografi fase terikat (Kromatografi Partisi)
Kebanyakan fase diam kromatografi ini adalah silika yang dimodifikasi
secara kimiawi atau fase terikat. Sejauh ini yang digunakan untuk memodifikasi
silika adalah hidrokarbon-hidrokarbon non-polar seperti dengan oktadesilsilana,
oktasilana, atau dengan fenil. Fase diam yang paling populer digunakan adalah
oktadesilsilan (ODS atau C18) dan kebanyakan pemisahannya adalah fase
terbalik.
Sebagai fase gerak adalah campuran metanol atau asetonitril dengan air
atau dengan larutan bufer. Untuk solut yang bersifat asam lemah atau basa lemah,
peranan pH sangat krusial karena kalau pH fase gerak tidak diatur maka solut
akan mengalami ionisasi atau protonasi. Terbentuknya spesies yang terionisasi ini
menyebabkan ikatannya dengan fase diam menjadi lebih lemah dibanding jika
solut dalam bentuk spesies yang tidak terionisasi karenanya spesies yang
mengalami ionisasi akan terelusi lebih cepat.
3. Kromatografi penukar ion
HPLC penukar ion menggunakan fase diam yang dapat menukar kation
atau anion dengan suatu fase gerak. Ada banyak penukar ion yang beredar di
pasaran, meskipun demikian yang paling luas penggunaannya adalah polistiren
resin. Kebanyakan pemisahan kromatografi ion dilakukan dengan menggunakan
media air karena sifat ionisasinya. Dalam beberapa hal digunakan pelarut
campuran misalnya air-alkohol dan juga pelarut organik. Kromatografi penukar
ion dengan fase gerak air, retensi puncak dipengaruhi oleh kadar garam total atau
 kekuatan ionik serta oleh pH fase gerak. Kenaikan kadar garam dalam fase gerak
menurunkan retensi solut. Hal ini disebabkan oleh penurunan kemampuan ion
sampel bersaing dengan ion fase gerak untuk gugus penukar ion pada resin.
4. Kromatografi Pasangan ion
Kromatografi pasangan ion juga dapat digunakan untuk pemisahan
sampel-sampel ionik dan mengatasi masalah-masalah yang melekat pada metode
penukaran ion. Sampel ionik ditutup dengan ion yang mempunyai muatan yang
berlawanan.
5. Kromatografi Eksklusi Ukuran
Kromatografi ini disebut juga dengan kromatografi permiasi gel dan dapat
digunakan untuk memisahkan atau menganalisis senyawa dengan berat molekul >
2000 dalton. Fase diam yang digunakan dapat berupa silika atau polimer yang
bersifat porus sehingga solut dapat melewati porus (lewat diantara partikel), atau
berdifusi lewat fase diam. Molekul solut yang mempunyai BM yang jauh lebih
besar, akan terelusi terlebih dahulu, kemudian molekul-molekul yang ukuran
medium, dan terakhir adalah molekul yang jauh lebih kecil. Hal ini disebabkan
solut dengan BM yang besar tidak melewati porus, akan tetapi lewat diantara
partikel fase diam. Dengan demikian, dalam pemisahan dengan eksklusi ukuran
ini tidak terjadi interaksi kimia antara solut dan fase diam seperti tipe
kromatografi yang lain.
6. Kromatografi Afinitas
Dalam kasus ini, pemisahan terjadi karena interaksi-interaksi biokimiawi
yang sangat spesifik. Fase diam mengandung gugus-gugus molekul yang hanya
dapat menyerap sampel jika ada kondisi-kondisi yang terkait dengan muatan dan
sterik tertentu pada sampel yang sesuai (sebagaimana dalam interaksi antara
antigen dan antibodi). Kromatografi jenis ini dapat digunakan untuk mengisolasi
protein (enzim) dari campuran yang sangat kompleks.
C. Instrument HPLC
Instrumentasi HPLC pada dasarnya terdiri atas: wadah fase
gerak (Reservoir) , pompa, alat untuk memasukkan sampel (tempat injeksi),
kolom, detektor, wadah penampung buangan fase gerak, dan suatu komputer atau
integrator atau perekam. Diagram skematik sistem kromatografi cair dapat dilihat
pada gambar di bawah ini :

1 . Wadah fase gerak (Reservoir)

Wadah fase gerak harus bersih dan lembam (inert). Wadah pelarut kosong
ataupun labu laboratorium dapat digunakan sebagai wadah fase gerak. Wadah ini
biasanya dapat menampung fase gerak antara 1 sampai 2 liter pelarut. Fase gerak
sebelum digunakan harus dilakukan deggasing (penghilangan gas) yang ada pada
fase gerak. Sebab adanya gas dalam fase gerak akan mengganggu detektor
sehingga akan mengacaukan hasil analisis. Fase gerak biasanya terdiri atas
campuran pelarut yang dapat bercampur yang secara keseluruhan berperan dalam
daya elusi dan resolusi. Daya elusi dan resolusi ini ditentukan oleh polaritas
keseluruhan pelarut, polaritas fase diam, dan sifat komponen-komponen sampel.
Untuk fase normal (fase diam lebih polar daripada fase gerak), kemampuan elusi
meningkat dengan meningkatnya polaritas pelarut. Sementara untuk fase terbalik
(fase diam kurang polar daripada fase gerak), kemampuan elusi menurun dengan
meningkatnya polaritas pelarut.

FASE GERAK
 Fase gerak dalam HPLC adalah berupa zat cair dan disebut juga eluen atau
pelarut. Selain berfungsi sebagai pembawa komponen-komponen campuran
campuran menuju detector, fase gerak dapat berinteraksi dengan solut-solut. Oleh
karena itu, fase gerak dalam HPLC merupakan salah satu faktor penentu
keberhasilan proses pemisahan.
Persyaratan fase gerak HPLC:
1. Zat cair harus bertindak sebagai pelarut yang baik untuk cuplikan yang akan
dianalisis.
2. Zat cair harus murni sekali untuk menghindarkan masuknya kotoran yang
dapat mengganggu interpretasi kromatografi.
3. Zat air harus jernih sekali untuk menghindarkan penyumbatan pada kolom.
4. Zat cair harus mudah diperoleh, murah, tidak mudah terbakar, dan tidak
beracun.
5. Zat air tidak kental. Umumnya kekentalan tidak melebihi 0,5 cP (centi Poise).
6. Sesuai dengan detector.

Jenis HPLC berdasarkan kepolaran fase diam dan fase gerak:

a. HPLC fase normal: HPLC dengan kombinasi antara fase diam polar dan
fase gerak non-polar. Fase diam yang digunakan seperti silica, alumina, atau
trietilenaglikol yang dilapiskan pada partikel silica. Sedangkan fase gerak
yang digunakan adalah heksana atau i-propileter.
b. HPLC fase terbalik: HPLC dengan kombinasi antara fase diam non-polar dan
fase gerak polar. Fase gerak yang digunakan seperti air, methanol, atau
asetinitril.
c. Fase gerak yang baik memberikan factor kapasitas k’ pada rentang yang
sesuai. Untuk cuplikan dengan 2-3 komponen, sebaiknya menggunakan
fase gerak yang memberikan k’ antara 2-5
2. Pompa
Pompa yang cocok digunakan untuk HPLC adalah pompa yang mempunyai
syarat sebagaimana syarat wadah pelarut yakni: pompa harus inert terhadap fase
gerak. Bahan yang umum dipakai untuk pompa adalah gelas, baja tahan karat,
Teflon, dan batu nilam. Pompa yang digunakan sebaiknya mampu memberikan
tekanan sampai 5000 psi dan mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan
alir 3 mL/menit. Untuk tujuan preparatif, pompa yang digunakan harus mampu
mengalirkan fase gerak dengan kecepatan 20 mL/menit.
Tujuan penggunaan pompa atau sistem penghantaran fase gerak adalah untuk
menjamin proses penghantaran fase gerak berlangsung secara tepat, reprodusibel,
konstan, dan bebas dari gangguan. Ada 2 jenis pompa dalam HPLC yaitu: pompa
dengan tekanan konstan, dan pompa dengan aliran fase gerak yang konstan. Tipe
pompa dengan aliran fase gerak yang konstan sejauh ini lebih umum
dibandingkan dengan tipe pompa dengan tekanan konstan.
Tiga jenis pompa yang digunakan dalam HPLC:
a. Pompa reciprocating
Pompa ini terdiri dari ruangan kecil tempat pelarut yang dipompa dengan cara
gerakan piston mundur-maju yang dijalankan oleh motor. Piston berupa gelas
dan berkontak langsung dengan pelarut. Ketika piston mundur maka bola gelas
bawah terangkat dan pelarut masuk, sebaliknya ketika piston maju maka bola
bawah menutup saluran pelarut dan pelarut yang telah berada di ruang pompa
didorong masuk ke dalam kolom.
b. Pompa displacement
Pompa ini menyerupai syringe (alat suntik) terdiri dari tabung yang dilengkapi
pendorong yang digerakkan oleh motor. Pompa ini juga menghasilkan aliran
yang cenderung tidak bergantung pada tekanan balik kolom dan viskositas
pelarut.
c. Pompa pneumatic
Dalam pompa ini pelarut didorong oleh gas bertekanan tinggi. Pompa jenis ini
murah dan bebas pulsa. Akan tetapi mempunya keterbatasan kapasitas dan
tekanan yang dihasilkan (<2000 psi) serta kecepatan alir bergantung pada
viskositas pelarut dan takanan balik kolom.
3. Tempat Injeksi
Sampel yang akan dimasukkan ke bagian ujung kolom, harus dengan
disturbansi yang minimum dari material kolom. Sampel yang akan dipisahkan
dimasukkan ke dalam kolom secara otomatis atau manual melalui injeksi. Volume
injeksi sangat tepat karena mempunyai sampel loop dengan variabel volume
(misalnya 20 – 500 μL).
4. Kolom
Ada 2 jenis kolom pada HPLC yaitu kolom konvensional dan kolom
mikrobor. Kolom merupakan bagian HPLC yang mana terdapat fase diam untuk
berlangsungnya proses pemisahan solut/analit.
FASE DIAM
Kebanyakan fase diam pada HPLC berupa silika yang dimodifikasi secara
kimiawi, silika yang tidak dimodifikasi, atau polimer-polimer stiren dan divinil
benzen. Permukaan silika adalah polar dan sedikit asam karena adanya residu
gugus silanol (Si-OH). Silika dapat dimodifikasi secara kimiawi dengan
menggunakan reagen-reagen seperti klorosilan. Reagen-reagen ini akan bereaksi
dengan gugus silanol dan menggantinya dengan gugus-gugus fungsional yang
lain.
Oktadesil silika (ODS atau C18) merupakan fase diam yang paling banyak
digunakan karena mampu memisahkan senyawa-senyawa dengan kepolaran yang
rendah, sedang, maupun tinggi. Oktil atau rantai alkil yang lebih pendek lagi lebih
sesuai untuk solut yang polar. Silika-silika aminopropil dan sianopropil (nitril)
lebih cocok sebagai pengganti silika yang tidak dimodifikasi. Silika yang tidak
dimodifikasi akan memberikan waktu retensi yang bervariasi disebabkan karena
adanya kandungan air yang digunakan.
5. Detektor
Detektor pada HPLC dikelompokkan menjadi 2 golongan yaitu: detektor
universal (yang mampu mendeteksi zat secara umum, tidak bersifat spesifik, dan
tidak bersifat selektif) seperti detektor indeks bias dan detektor spektrometri
massa; dan golongan detektor yang spesifik yang hanya akan mendeteksi analit
 secara spesifik dan selektif, seperti detektor UV-Vis, detektor fluoresensi, dan
elektrokimia.
Idealnya, suatu detektor harus mempunyai karakteristik sebagai berikut:
a. Mempunyai respon terhadap solut yang cepat dan reprodusibel;
b. Mempunyai sensitifitas yang tinggi, yakni mampu mendeteksi solut pada
kadar yang sangat kecil;stabil dalam pengopersiannya;
c. Mempunyai sel volume yang kecil sehingga mampu meminimalkan pelebaran
pita;Signal yang dihasilkan berbanding lurus dengan konsentrasi solut pada
kisaran yang luas (kisaran dinamis linier); Tidak peka terhadap perubahan
suhu dan kecepatan alir fase gerak.
D. Prinsip Kerja HPLC
Adapun prinsip kerja dari KCKT adalah suatu tekhnik yang mana solut
atau zat terlarut terpisah perbedaan kecepatan elusi, dikarenakan solut-solut ini
melewati suatu kolom kromatografi. Pemisahan solut-solut ini diatur oleh
distribusi solut dalam fase gerak dan fase diam
Kerja HPLC pada prinsipnya adalah pemisahan analit-analit berdasarkan
kepolarannya, alatnya terdiri dari kolom (sebagai fasa diam) dan larutan tertentu
sebagai fasa geraknya. Yang paling membedakan HPLC dengan kromatografi
lainnya adalah pada HPLC digunakan tekanan tinggi untuk mendorong fasa gerak.
Campuran analit akan terpisah berdasarkan kepolarannya, dan kecepatannya untuk
sampai ke detektor (waktu retensinya) akan berbeda, hal ini akan teramati pada
spektrum yang puncak-puncaknya terpisah.
Urutan skala polaritas : golongan fluorocarbon < golongan hidrokarbon <
senyawa terhalogenasi < golongan eter < golongan ester < golongan keton <
golongan alkohol < golongan asam.
HPLC dapat menganalisa secara kualitatif dan kuantitatif. Pada proses
kualitatif cara yang paling umum untuk mengidentifikasi adalah dengan melihat
Retention time (RT). Peak yang mempunyai RT yang sama dengan standard
umumnya adalah sebagai peak milik analat. Selain melihat RT hal lain yang perlu
dilihat adalah spektrum 3D dari signal kromatogram. Zat yang sama akan
mempunyai spektrum 3D yang juga sama. Sehingga jika spektrum 3D antara dua
 zat berbeda, maka kedua zat tersebut juga dipastikan adalah zat yang berlainan,
meskipun memiliki RT yang sama.
Kemudian melalui analisa kuantitatif dapat diketahui kadar komponen
yang dianalisis di dalam sampel. Yang berperan dalam proses separasi pada
system HPLC adalah kolom. Ada kolom yang digunakan untuk beberapa jenis
analisa, misalnya kolom C18 yang dapat digunakan untuk analisa carotenoid,
protein, lovastatin, dan sebagainya. Namun ada juga kolom yang khusus dibuat
untuk tujuan analisa tertentu, seperti kolom Zorbax carbohydrat (Agilent) yang
khusus digunakan untuk analisa karbohidrat (mono-, di-, polysakarida).
Keberhasilan proses separasi sangat dipengaruhi oleh pemilihan jenis kolom dan
juga fasa mobil.
Setelah komponen dalam sample berhasil dipisahkan, tahap selanjutnya
adalah proses identifikasi. Hasil analisa HPLC diperoleh dalam bentuk signal
kromatogram. Dalam kromatogram akan terdapat peak-peak yang
menggambarkan banyaknya jenis komponen dalam sample.
Sample yang mengandung banyak komponen didalamnya akan mempunyai
kromatogram dengan banyak peak. Bahkan tak jarang antar peak saling
bertumpuk (overlap). Hal ini akan menyulitkan dalam identifikasi dan perhitungan
konsentrasi. Oleh karena itu biasanya untuk sample jenis ini dilakukan tahapan
preparasi sample yang lebih rumit agar sample yang siap diinjeksikan ke HPLC
sudah cukup bersih dari impuritis. Sample farmasi biasanya jauh lebih mudah
karena sedikit mengandung komponen selain zat aktif. Sample ini umumnya
hanya melalui proses pelarutan saja.
E. Kelebihan Dan Kekurangan Metode Analisis Dengan HPLC
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (HPLC) atau High Pressure Liquid
Chromatography (HPLC) merupakan salah satu metode kimia dan fisikokimia.
HPLC termasuk metode analisis terbaru yaitu suatu teknik kromatografi dengan
fasa gerak cairan dan fasa diam cairan atau padat. Banyak kelebihan metode ini
jika dibandingkan dengan metode lainnya.
Kelebihan itu antara lain:

1. Mampu memisahkan molekul- molekul dari suatu campuran

2. Mudah melaksanakannya
3. Kecepatan analisis dan kepekaan yang tinggi
4. Dapat dihindari terjadinya dekomposisi / kerusakan bahan yang dianalisis ü
Resolusi yang baik
5. Dapat digunakan bermacam- macam detektor
6. Kolom dapat digunakan kembali
7. Mudah melakukan "sample recovery". Mudah untuk mendapatkan kembali
cuplikan, karena detector pada HPLC tidak merusak komponen zat yang
dianalisis.
8. Dapat menganalisis senyawa organik yang terurai (labil) pada suhu tinggi
karena HPLC dilakukan pada suhu kamar.
9. Dapat menganalisis cuplikan yang berasal dari senyawa-senyawa anorganik.
10. Dapat menganalisis cuplikan yang memiliki berat molekul tinggi atau titik
didihnya sangat tinggi seperti polimer
11. Dapat memisahkan zat-zat yang tidak mudah menguap ataupun tak tahan
panas
12. Banyak pilihan fasa geraknya Cepat: Waktu analisis umumnya kurang dari 1
jam. Banyak analisis yang dapat diselesaikari sekitar 15-30 menit. Untuk
analisis yang tidak rumit (uncomplicated), waktu analisi kurang dari 5 menit
bisa dicapai
13. Resolusi : Berbeda dengan KG, Kromatografi Cair mempunyai dua rasa
dimana interaksi selektif dapat terjadi. Pada KG, gas yang mengalir sedikit
berinteraksi dengan zat padat; pemisahan terutama dicapai hanya dengan rasa
diam.
14. Kemampuan zat padat berinteraksi secara selektif dengan rasa diam dan rasa
gerak pada HPLC memberikan parameter tambahan untuk mencapai
pemisahan yang diinginkan.
 15. Sensitivitas detektor : Detektor absorbsi UV yang biasa digunakan dalam
HPLC dapat mendeteksi kadar dalam jumlah nanogram (10-9 gram) dari
bermacam-macam zat.
16. Detektor- detektor Fluoresensi dan Elektrokimia dapat mendeteksi jumlah
sampai picogram (10-12 gram). Detektor-detektor seperti Spektrofotometer
Massa, Indeks Refraksi, Radiometri, dll, dapat juga digunakan dalam HPLC
17. Kolom yang dapat digunakan kembali : Berbeda dengan kolom kromatografi
klasik, kolom HPLC dapat digunakan kembali (reusable) . Banyak analisis
yang bisa dilakukan dengan kolom yang sama sebelum dari jenis sampel yang
diinjeksi, kebersihan dari solven dan jenis solven yang digunakan
18. Ideal untuk zat bermolekul besar dan berionik : zat – zat yang tidak bisa
dianalisis dengan KG karena volatilitas rendah , biasanya diderivatisasi untuk
menganalisis psesies ionik. HPLC dengan tipe eksklusi dan penukar ion ideal
sekali untuk mengalissis zat – zat tersebut.
19. Mudah rekoveri sampel : Umumnya setektor yang digunakan dalam HPLC
tidak menyebabkan destruktif (kerusakan) pada komponen sampel yang
diperiksa, oleh karena itu komponen sampel tersebut dapat dengan mudah
dikumpulkan setelah melewati detector.
20. Solvennya dapat dihilangkan dengan menguapkan ksecuali untuk
kromatografi penukar ion memerlukan prosedur khusus.

Sedangkan kekurangannya adalah:

a. Larutan harus dicari fase diamnya terlebih dahulu

b. Hanya bisa digunakan untuk asam organic
c. Harus mengetahui kombinasi yang optimum antara pelarut, analit, dan
gradient elusi
d. Harganya mahal sehingga penggunaannya dalam lingkup penelitian yang
terbatas
 BAB III
PENUTUP
A. Kesimpulan
a. Komponen utama dari HPLC yaitu, pompa, injector, elusi gradient, kolom,
detector, pengolahan data.
b. Prinsip dasar HPLC (High Performance Liquid Chromatografi) adalah
pemisahan senyawa-senyawa berdasarkan kepolaran, dimana terdapat fase
mobile (gerak) dan fase stasioner (diam). HPLC sering digunakan antara lain
untuk menetapkan kadar senyawa aktif pada obat, produk hasil samping
proses sintesis, atau produk- produk degradasi dalam sediaan farmasi.
Contohnya adalah menganalisis parasetamol dan kafein dalam suatu
campuran.
c. HPLC sebagai suatu metode pemisahan memiliki beberapa keuntungan yaitu
menghasilkan pemisahan yang sangat cepat, dapat memisahkan zat-zat yang
tidak mudah menguap ataupun tak tahan panas, banyak pilihan fasa geraknya,
mudah untuk mendapatkan kembali cuplikan, karena detector pada KCKT
tidak merusak komponen zat yang dianalisis, dan dapat dirangkai dengan
instrumen lain untuk meningkatkan efisiensi pemisahan. Sedangkan
kekurangannya adalah larutan harus dicari fase diamnya terlebih dahulu,
hanya bisa digunakan untuk asam organic, harus mengetahui kombinasi yang
optimum antara pelarut, analit, dan gradient elusi, harganya mahal sehingga
penggunaannya dalam lingkup penelitian yang terbatas
 PENETAPAN KADAR KLORAMFENIKOL DALAM TETES MATA PADA
SEDIAAN GENERIK DAN MERK DENGAN METODE KROMATOGRAFI CAIR
KINERJA TINGGI

Febriyanti Diah Puspita Sari*, Pri Iswati Utami*

Fakultas Farmasi Universitas Muhammadiyah Purwokerto, Jl. Raya Dukuhwaluh,

PO Box 202, Purwokerto 53182

ABSTRAK

Telah dilakukan penetapan kadar kloramfenikol dalam tetes mata pada sediaan
generik dan merk menggunakan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) fase terbalik
dengan detektor ultraviolet pada panjang gelombang 280 nm. Fase diam yang digunakan
adalah kolom Shimpack ODS CLC C18, fase gerak metanol:air (40:60) dengan kecepatan
alir 1 mL/menit. Penentuan linearitas dengan kurva baku menunjukkan hubungan yang
linier antara luas puncak dan konsentrasi baku kloramfenikol dengan konsentrasi 10-30
µg/mL (r=0,990). Persamaan regresi yang diperoleh adalah y=1,6429x-5,5758. Nilai limit
of detection (LOD) sebesar 5,2 µg/mL dan nilai limit of quantitation (LOQ) sebesar 17,3
µg/mL. Uji presisi memberikan hasil nilai koefisien variasi sebesar 5,988%. Hasil
penetapan kadar kloramfenikol dalam tetes mata pada sediaan generik adalah 117,6% dan
dalam tetes mata bermerek sebesar 111,29%. Berdasarkan pengujian, sampel tetes mata
generik dan bermerek memenuhi persyaratan yang tertera pada Farmakope Indonesia
edisi IV.

PENDAHULUAN
Kloramfenikol merupakan suatu antibiotika berspektrum luas yang aktif
terhadap mikroorganisme. Kloramfenikol dijumpai dalam bentuk sediaan kapsul,
tetes mata dan tetes telinga baik produk generik maupun bermerek.
Obat generik merupakan obat yang menjadi program pemerintah untuk
meningkatkan keterjangkauan pelayanan kesehatan oleh masyarakat khususnya
dalam hal ini adalah daya beli terhadap obat. Dengan tidak adanya promosi, maka
harga obat generik lebih murah jika dibanding harga obat bermerek. Namun
demikian, sebagian pihak menyangsikan khasiat obat generik.
Oleh karena itu dalam penelitian ini dilakukan penetapan kadar
kloramfenikol dalam tetes mata produk generik dan produk bermerek dengan
menggunakan metode KCKT. Berdasarkan hasil penetapan kadar kloramfenikol
dalam dua produk ini diharapkan dapat membuktikan bahwa kloramfenikol
produk generik sebanding mutunya dengan produk bermerek, sehingga
masyarakat tidak perlu ragu memilih produk generik.

METODE PENELITIAN
BAHAN DAN ALAT
Bahan yang digunakan adalah baku kloramfenikol, tetes mata
kloramfenikol generik dan bermerek, aquabidestilata, metanol pro KCKT. Alat
yang digunakan adalah seperangkat alat KCKT (Shimadzu LC- 10); ultrasonic
batch (Bronson 1510); pompa vakum; vakum filter 0,45 µm; microsiringe 100 µl;
kolom shim-pack C- 18; detektor UV 280 nm; alat-alat gelas yang dipakai dalam
laboratorium Kimia Analisis, neraca analitik (Shimadzu AY 220).

CARA KERJA
Pembuatan Berbagai Larutan

Fase gerak dibuat dengan mencampurkan metanol dan air dengan

perbandingan 40 : 60 (v/v). Larutan stok kloramfenikol baku: kloramfenikol
ditimbang sesuai perhitungan kadar, kemudian dilarutkan dalam sejumlah tertentu
fase gerak yang telah dibuat untuk mendapatkan konsentrasi 100 µg/mL.
Pembuatan larutan untuk baku kloramfenikol : dari larutan stok dipipet 1,0; 1,5;
2,0; 2,5; dan 3,0 mL masing-masing dimasukkan ke dalam labu takar 10 mL lalu
gerak sehingga diperoleh konsentrasi 10; 15; 20; 25; dan 30 µg/mL.

Penentuan Kondisi Analisis

Optimum Kondisi analisis optimum dibuat berdasarkan percobaan yang
telah dilakukan, yaitu: Detektor : UV 280 nm, Fase gerak:
metanol:air (40:60) v/v, Laju alir : 1 mL/menit Volume injeksi : 20 µL.
Validasi Metode Analisis
Pembuatan kurva baku: larutan kloramfenikol baku dengan konsentrasi
10,0; 15,0; 20,0; 25,0; dan 30,0 µg/mL masing-masing disuntikkan ke alat KCKT
sesuai dengan kondisi yang telah ditetapkan. Luas puncak kloramfenikol dicatat
untuk tiap konsentrasi dan dibuat kurva hubungan antara konsentrasi
kloramfenikol dan luas area. Penentuan batas deteksi dan batas kuantitasi: Batas
deteksi (limit of detection / LOD) dan batas kuantitasi (limit of quantitation /
LOQ) metode penetapan kadar kloramfenikol dengan metode KCKT dihitung
secara statistik melalui garis linear dari kurva baku.
Penentuan selektivitas: selektivitas dilihat dari kromatogram. Pada puncak
kloramfenikol terpisah dan tidak ada gangguan dari puncak zat lain yang mungkin
ada dalam sampel.
HASIL DAN PEMBAHASAN

Kondisi KCKT yang digunakan pada analisis kloramfenikol dalam

sediaan tetes mata adalah dengan menggunakan sistem fase terbalik. Fase diam
yang digunakan adalah kolom C18 yang relatif kurang polar dibandingkan
dengan fase gerak metanol:air (40:60 v/v) yang lebih polar. Detektor yang
digunakan adalah detektor UV pada panjang gelombang 280 nm mengingat
kloramfenikol memiliki gugus kromofor pada strukturnya sehingga dapat
dideteksi dengan detektor UV.
Analisis kualitatif kloramfenikol dilakukan untuk mengidentifikasi
adanya kloramfenikol dalam sediaan tetes mata yang dianalisis. Analisis
kuliatitatif ini dilakukan dengan membandingkan waktu retensi puncak
kloramfenikol baku dengan puncak yang yang muncul pada injeksi larutan
sampel sediaan tetes mata baik generik maupun bermerk. Waktu retensi adalah
selang waktu yang dibutuhkan oleh linarut (solut) mulai saat injeksi sampai
keluar dari kolom dan sinyalnya ditangkap oleh detektor (Mulya & Suharman,
1995). Waktu retensi puncak kloramfenikol untuk baku, sampel generik dan
sampel bermerek berturut-turut adalah 6,575; 6,475; dan 6,483 menit.
KESIMPULAN
Metode analisis kloramfenikol dengan metode KCKT fase terbalik ini
memenuhi syarat yang diharapkan untuk parameter linearitas, selektivitas, LOD,
LOQ, dan presisi namun masih memiliki akurasi yang kurang memenuhi syarat
yang telah ditetapkan. Hasil penetapan kadar kloramfenikol dalam sediaan generik
 DAFTAR PUSTAKA

Ahmad, M., dan Suherman 1995. Analisis Instrumental. Airlangga University

Press. Surabaya.

Ahmad, M., dan Suherman. 1991. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi. Airlangga
University Press. Surabaya.

Bahti. 1998. Teknik Pemisahan Kimia dan Fisika. Universitas Padjajaran.

Bandung.

Bassett, J., R.C. Denney, G.H. Jeffery, dan J. Mendham, 1994, Kimia Analisis
Kuantitatif Anorganik, Penerbit Buku Kedokteran EGC, Jakarta.

Day, R.A dan Underwood, A.L., 2002, Analisis Kimia Kuantitatif, Erlangga,
Jakarta.

Febriyanti dan Pri Iswati Utami. 2009. Penetapan Kadar Kloramfenikol Dalam
Tetes Mata Pada Sediaan Generik Dan Merk Dengan Metode
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi. Fakultas Farmasi Universitas
Muhammadiyah Purwokerto. ISSN 1693-3591 Vol.06 No. 02
Khopkar, S.M., 2008, Konsep Dasar Kimia Analitik, UI Press, Jakarta.

Putra,Effendy D. L., 2004. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Dalam Bidang

Farmasi. Jurusan Farmasi Fakultas Dan Ilmu Pengetahuan Alam
Universitas Sumatera Utara :3

Sudjadi, 1986. Metode Pemisahan. Kanisius. Yogyakarta