Diagnosis Peritonitis Bakteri Spontan dan Pendekatan Hibridisasi In Situ

untuk Mendeteksi Patogen ident ‘yang Tidak Dikenal

Pengantar

Peritonitis bakteri spontan (PBS) adalah komplikasi yang sering dan

parah pada pasien dengan sirosis dan asites. PBS adalah infeksi bakteri yang
terjadi tanpa adanya sumber infeksi intra-abdominal yang jelas dan dapat
dioperasi, seperti perforasi atau radang organ intra-abdominal [1-4]. Meskipun
mekanisme yang tepat (s) yang mendasari pengembangan PBS belum diklarifikasi
sepenuhnya, translokasi bakteri (TB) diyakini menjadi faktor penyebab yang
paling penting. BT ringan ke kelenjar getah bening mesenterika adalah peristiwa
fisiologis yang didokumentasikan; namun, hanya beberapa bakteri usus, termasuk
Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, dan Enterobacteriaceae lainnya, yang
mampu mentranslokasi secara efisien dari lumen usus ke kelenjar getah bening
mesenterika [5, 6]. Karena spesies bakteri dengan kapasitas untuk TB juga
merupakan patogen utama PBS, TB terkait penyakit yang tidak fisiologis
dianggap secara signifikan terkait dengan perkembangan PBS. Selain itu,
beberapa kondisi yang sering dicatat pada pasien sirosis, termasuk perubahan flora
usus, peningkatan permeabilitas usus, dan sistem kekebalan tubuh yang
dikompromikan, telah dilaporkan terlibat dalam TB terkait penyakit dan onset
PBS selanjutnya. [6].
Prevalensi PBS pada pasien yang dirawat di rumah sakit sirosis dengan
asites berkisar antara 10% hingga 30% [1, 2, 7]. Meskipun angka kematian
awalnya dilaporkan melebihi 90%, prognosis telah membaik dengan diagnosis
dan pengobatan dini. [8]
Diagnosis PBS ditegakkan berdasarkan kultur bakteri cairan asites
positif dan deteksi jumlah neutrofil polymorphonuclear neutrophil (PMN) yang
didapat dalam asites (> 250 / mm3) tanpa sumber infeksi yang dapat diobati
dengan operasi intra-abdominal yang dapat diobati.[1, 9].
 Meskipun mengidentifikasi patogen (s) memainkan peran utama dalam
pengelolaan penyakit menular, dibutuhkan beberapa hari untuk mengidentifikasi
bakteri biasa. Selain itu, kultur cairan asites negatif pada sekitar 10-60% pasien
dengan manifestasi klinis PBS [3, 9, 10]. Oleh karena itu, PBS biasanya
didiagnosis hanya berdasarkan peningkatan jumlah PMN (> 250 / mm3) dalam
cairan asites dalam kasus-kasus di mana tidak ada sumber bakteri yang jelas
menyebar ke asites, terlepas dari apakah kultur cairan asites positif [6, 11–13].
Makalahnya meninjau diagnosis SBP, dengan fokus pada metode novel
in situ hybridization (ISH) untuk mendeteksi DNA bakteri dalam asites pasien
PBS.

Standar Pendekatan Mendiagnosis PBS

1. Parasentesis diagnostik. Parasentesis sangat penting, karena jumlah PMN

dalam cairan asites memainkan peran penting dalam mendapatkan diagnosis
PBS. Parasentesis diagnostik harus dilakukan pada semua pasien yang datang
dengan (1) Tanda atau gejala yang sesuai (nyeri dan / atau nyeri tekan pada
palpasi, demam, dan kedinginan); (2) Gangguan dari fungsi hati atau ginjal;
(3) Ensefalopati hati yang tidak dapat dijelaskan; (4) Perdarahan
gastrointestinal [6, 9, 11-13]. Namun, tanda dan gejala klinis kadang-kadang
tidak ada pada pasien dengan PBS. [11-16]. Meskipun semua pasien sirosis
dengan asites berisiko PBS, prevalensi PBS di antara pasien rawat inap (10%)
lebih tinggi daripada yang diamati pada pasien rawat jalan (1,5-3,5%) [14, 15].
Oleh karena itu direkomendasikan bahwa paracentesis diagnostik dilakukan
pada semua pasien sirosis dengan asites yang memerlukan perawatan di rumah
sakit, tanpa memperhatikan apakah mereka menunjukkan gejala klinis PBS [1,
6, 9, 11-13].
2. Analisis Sel Cairan Asites. Meskipun menggunakan metode sensitif (metode
kultur botol; silakan merujuk ke bagian Kultur Cairan Asap), kultur asites
sering menunjukkan hasil negatif, bahkan pada pasien dengan peningkatan
jumlah PMN asites dan gejala klinis yang menunjukkan PBS [3, 9 , 10, 18].
 Oleh karena itu, diagnosis PBS dikonfirmasi berdasarkan jumlah PMN dalam
asites> 250 sel / mm3 tanpa adanya sumber infeksi intra-abdominal dan dapat
diobati dengan pembedahan. Nilai batas 250 sel PMN / mm3 memiliki
sensitivitas terbesar, sedangkan 500 sel PMN / mm3 menunjukkan spesifisitas
terbesar. [19-21]. Namun, nilai cutoff paling sensitif harus digunakan untuk
diagnosis, karena penting untuk tidak melewatkan kasus PBS. Dokter harus
mengurangi satu PMN untuk setiap 250 sel darah merah pada pasien dengan
asites hemoragik dengan jumlah sel darah merah cairan> 10.000 / mm3
(karena efek dari keganasan bersamaan atau keran traumatis) untuk
menyesuaikan keberadaan darah di asites [9, 11-13].
Jumlah PMN dalam cairan asites dapat ditentukan menurut metode
hematologi baik menggunakan mikroskop cahaya dan manual penghitungan
ruang atau counter cell otomatis [22-24]. Cairan asites disentrifugasi untuk
menghitung manual jumlah sel asites, setelah smear sel dikumpulkan diwarnai
dengan Giemsa dan jumlah sel total dan diferensial ditentukan dengan
menggunakan mikroskop cahaya [1, 4, 25]. Mikroskopis metode penghitungan
sel memerlukan beberapa jam dan membawa risiko di antar dan / atau
intraobserver perbedaan. Di sisi lain, counter cell otomatis memberikan hasil
direproduksi dalam beberapa menit; Namun, temuan kontra Coulter dari
jumlah neutrofil telah terbukti tidak akurat untuk tingkat yang relatif rendah
neutrofil dalam cairan asites. Karena itu, metode PMN penghitungan manual
konvensional disukai [1, 6]. Namun, penelitian terbaru menunjukkan bahwa
jumlah sel otomatis memilikisensitivitas yang cukup untuk mendiagnosis SBP
[22], sehingga menunjukkan bahwa metode sederhana ini dapat digunakan di
tempat penghitungan manual tradisional.

3. Kultur Cairan Asites. .metode kultur bakteri konvensional, seperti

laboratorium analisis cairan dikumpulkan dalam jarum suntik atau tabung,
efektif mendeteksi bakteri dalam waktu kurang dari 50% dari sampel asites
dengan jumlah tinggi PMN (>250 / mm3). Oleh karena itu, dianjurkan untuk
menyuntik cairan asites ke dalam botol kultur darah di samping tempat tidur
 pasien untuk meningkatkan sensitivitas kultur bakteri [10, 26-29]. Tingkat
budaya positif dari ascites SBP adalah sekitar 80%, yaitu, antara 72% dan
90% dari kasus dinilai menggunakan metode kultur-botol [9, 11]. Namun,
beberapa studi terbaru telah melaporkan tingkat budaya-positif lebih rendah
untuk ascites SBP, mulai dari sekitar 40% sampai 60% [3, 30-32]. Dalam
addi-tion, bahkan dengan metode kultur-botol sensitif, hasil positif bagi
budaya asites diperkirakan sekitar 40-70%, menurut berbagai pedoman baru-
baru ini [6, 11-13]. Karena pasien dengan jumlah PMN meningkat dalam
cairan asites (>250 sel / mm3) Dan budaya negatif menunjukkan presentasi
klinis mirip dengan bakteriologis conf irmed SBP [1, 33], pasien ini
dikategorikan sebagai memiliki “SBP budaya negatif” dan harus diperlakukan
dengan cara yang sama seperti mereka dengan SBP budaya-positif.

4. Diferensiasi dari Peritonitis Bakteri Sekunder. Perbedaan SBP dari peritonitis

sekunder akibat perforasi atau radang organ intra-abdomen secara klinis
sangat penting. Peritonitis bakteri sekunder harus dicurigai pada pasien
dengan tanda-tanda yang relevan perut atau gejala, beberapa organisme dalam
budaya asites, dan jumlah yang sangat tinggi PMN dan / atau konsentrasi
protein tinggi dalam asites, serta mereka yang menampilkan respon yang tidak
memadai terhadap terapi [25 ]. Namun, secara akurat mendiagnosis peritonitis
sekunder berdasarkan kriteria ini umumnya memakan waktu lama, dan pasien
dengan peritonitis sekunder berlubang memerlukan perawatan bedah secara
tepat waktu [34]. Oleh karena itu, per-membentuk CT abdomen untuk
mendeteksi perforasi dianjurkan pada pasien dengan dugaan peritonitis bakteri
sekunder [6, 9, 11-13].
Berbagai parameter yang tersedia pada saat paracentesis telah diusulkan
untuk membantu dalam mendeteksi dengan cepat peritonitis sekunder. Parameter
dalam cairan asites pada pasien dengan peritonitis sekunder, seperti yang
diusulkan oleh Runyon dan Hoefs [35], adalah sebagai berikut: (1) sebuah PMN
ditinggikan menghitung dalam cairan asites (>250 / mm3: Biasanya ribuan) dan
(2) setidaknya dua dari berikut: tingkat protein total >1 g / dL, tingkat
dehidrogenase serum laktat di atas batas normal, dan tingkat glukosa<50 mg / dL.
Selain itu, kedua tingkat alkali fosfatase dari>240 U / l dan tingkat antigen
Carcinoembryonic dari >5 ng / mL dalam cairan asites telah dilaporkan
menunjukkan kinerja diagnostik yang baik untuk mendeteksi usus perforasi ke
dalam cairan asites, dengan sensitivitas 92% dan spesifisitas 88% [30]. Namun,
tidak mudah untuk membedakan SBP dari peritonitis sekunder hanya didasarkan
pada parameter biokimia sampel asites, dan CT abdomen sangat penting dalam
pengaturan klinis [6, 11-13, 34, 35].

Metode diagnostik potensial untuk PBS

1. Leukosit Esterase Reagen Strips (lers).Dibutuhkan beberapa jam untuk

mendapatkan hasil hitungan sel cairan asites. Oleh karena itu, penggunaan
leukosit reagen strip (lers) telah diusulkan sebagai metode cepat dan murah
untuk mendiagnosis SBP. strip reagen ini, yang awalnya dikembangkan untuk
mendiagnosis infeksi saluran kemih, mendeteksi leukosit berdasarkan
aktivitas esterase mereka sesuai dengan metode kolorimetri [36]. Namun,,
calon studi multicenter besar baru-baru ini menunjukkan bahwa Multistix 8
SG memiliki tingkat rendah akurasi diagnostik untuk mendiagnosa SBP,
dengan negatif palsu tingkat tinggi (55%) [14]. Selain itu, review sistemik dari
19 penelitian beberapa strip (termasuk Multistix, aution, Combur, Nephur, dan
UriScan) menunjukkan bahwa lers ini memiliki keduanya sensitivitas rendah
dan risiko tinggi negatif palsu hasil [36]. Menurut sebuah tinjauan terbaru dari
26 studi mengenai validitas lers untuk SBP diagnosis [37], lers menampilkan
sensitivitas rendah untuk mendiagnosis SBP, dengan variabilitas Interstudy
yang signifikan antara merek lers. Namun, lers telah secara konsisten
menunjukkan tinggi nilai prediksi negatif (>95% di sebagian besar studi) dan
karenanya dapat digunakan sebagai alat skrining awal untuk mendiagnosa
SBP. Namun, utilitas lers untuk mendiagnosis SBP belum dikonfirmasi.
 Sebagian besar strip di atas dikembangkan untuk digunakan dalam urin dengan
ambang >50 sel PMN / mm3; Namun, kinerja diagnostik dari tes strip reagen
dikalibrasi untuk cairan asites dengan cutoff dari 250 PMN sel / mm3baru-baru ini
dilaporkan [38]. Penelitian tersebut menunjukkan hasil yang sangat baik, dengan
sensitivitas 100% dan nilai prediksi negatif 100%. Meskipun kesimpulan ini
belum dikonfirmasi dalam uji coba multicenter besar, metode ini dapat
memberikan alat diagnostik baru dan berguna untuk mendeteksi PBS.

2. Pengukuran Protein Berasal Leukosit. Tingkat protein, seperti granulosit

elastase [39] dan laktoferin [40], dirilis oleh PMN aktif meningkat pada pasien
dengan PBS. Laktoferin menunjukkan sensitivitas terkenal (95,5%) dan
spesifisitas (97%) untuk mendiagnosis PBS, dengan nilai cutoff dari 242 ng /
mL [40]. Namun demikian, kinerja diagnostik parameter ini harus dievaluasi
lebih lanjut dalam penelitian lain dengan jumlah yang lebih besar dari pasien
karena jumlah kecil kasus SBP dalam penelitian itu. Selain protein yang
dijelaskan di atas, tingkat beberapa sitokin inflamasi dan kemokin dalam
cairan asites yang dilaporkan terkait dengan keparahan PBS [41, 42]. Namun,
potensi biomarker diagnostik yang dihasilkan oleh reaksi host terhadap
rangsangan inflamasi dan gagal untuk memberikan bukti langsung dari infeksi
bakteri di ascites PBS.
3. Deteksi Bakteri DNA Menggunakan Polymerase Chain Reaction (PCR).
kultur bakteri memerlukan beberapa hari untuk mendapatkan hasil. Oleh
karena itu, deteksi DNA bakteri dan sequenc-ing semakin banyak digunakan
untuk mendiagnosa berbagai penyakit infeksi [43-45]. Beberapa metode
berbasis PCR untuk mendeteksi DNA bakteri juga telah diterapkan pada
diagnosis mikrobiologis SBP [46-49]. Namun, metode ini telah menerima
beberapa kritik utama mengenai deteksi DNA bakteri. Pertama, studi-studi
sebelumnya terdaftarsejumlah pasien, dan laporan terbaru termasuk sejumlah
besar pasien menunjukkan hasil yang buruk untuk diagnosis. Selain itu,
penelitian sebelumnya telah mengungkapkan keprihatinan serius mengenai
kontaminasi DNA bakteri dalam sistem PCR [50-53]. Tersedia secara
 komersial Taq-polimerase mungkin terkontaminasi dengan DNA bakteri [50,
51]. Selain itu, reagen yang digunakan untuk prosedur ekstraksi DNA
membawa risiko mengekspos sampel klinis untuk DNA bakteri eksogen [52,
53]. Meskipun PCR adalah metode yang sangat sensitif untuk mendeteksi
DNA, metode berbasis PCR menampilkan temuan discrepant dan
kontroversial sehubungan dengan kinerja diagnostik dalam mendeteksi
penyebab patogen (s) pada pasien SBP dengan ascites [46-49], mungkin, atau
setidaknya di bagian, karena masalah yang dijelaskan di atas. Oleh karena itu,
tidak ada metode berbasis PCR definitif untuk memberikan diagnosis SBP
yang akurat telah ditetapkan.

4. Pendekatan Novel untuk Mendeteksi DNA bakteri pada PBS

Asites Menggunakan In Situ Hibridisasi

Sebuah strategi baru menggunakan metode ISH untuk mendeteksi DNA genom
bakteri phagocytized di neutrofil dan makrofag baru-baru ini dikembangkan untuk
mengidentifikasi bakteri penyebab dalam kasus-kasus sepsis [54-56]. Utilitas
metode ISH ini untuk mendeteksi DNA genom bakteri phagocytized dalam
leukosit pasien dengan sepsis telah ditunjukkan, memberikan bukti keberadaan
infeksi bakteri dalam kasus tersebut. Khususnya, metode ISH hampir empat kali
lebih sensitif dibandingkan kultur darah dalam mendeteksi bakteri penyebab
sepsis [55]. Selain itu, hasil tes ISH dapat diperoleh dalam satu hari, sedangkan
dibutuhkan beberapa hari, setidaknya, untuk mendapatkan hasil kultur.
Berdasarkan deteksi cepat dan sensitif dari DNA bakteri yang disediakan oleh
metode ISH,

Konsep metode ISH untuk mendeteksi DNA bakteri pada pasien SBP dengan
ascites ditunjukkan pada Gambar 1. Selain jumlah rendah bakteri hadir dalam
cairan asites dari PBS pasien, fagositosis dan pencernaan bakteri oleh leukosit
dapat mengurangi jumlah dari prolifera-tive, ditangguhkan bakteri dalam cairan
asites, sehingga membuatnya sulit untuk mengidentifikasi patogen menggunakan
metode standar. Fagositosis dianggap bertanggung jawab untuk tingkat rendah
bakteri penyebab terdeteksi [17]. Oleh karena itu, kami berusaha untuk
mendeteksi DNA bakteri tertelan menggunakan metode ISH. Karena semua
bakteri memiliki 23S RNA ribosom gen, probe DNA baru untuk gen ini
dihasilkan untuk mendeteksi DNA genom bakteri penyebab.

Beberapa fragmen cDNA sesuai dengan gen 23S rRNA dari berbagai bakteri yang
diperoleh dengan menggunakan PCR. Karena kita tidak menemukan penyelidikan
cDNA tunggal mampu mendeteksi semua jenis bakteri universal, kami dicampur
fragmen cDNA jamak untuk membuat koktail penyelidikan baru. koktail ini
mampu mendeteksi DNA genom dari semua 59 strain bakteri diperiksa, termasuk
spesies terkemuka akuntansi untuk SBP (Tabel 1). Probe baru ditunjuk “bakteri
global (GB)probe,”dan utilitas untuk mendeteksi DNA bakteri phagocytized di
ascites SBP dievaluasi. Garis besar metode ISH untuk menilai leukosit dalam
cairan asites ditunjukkan pada Gambar 2. Mengambang leukosit dalam ascites
dikumpulkan melalui sentrifugasi dan siap untuk tes ISH. DNA bakteri
intraseluler terdeteksi sebagai (coklat ungu) positif sinyal leukosit dalam sampel
PBS.
Gambar 2. Representasi skematis metode hibridisasi in situ (ISH) yang digunakan
untuk menilai sampel asites. Leukosit yang mengambang dalam cairan asites
dikumpulkan melalui sentrifugasi dan digunakan untuk tes ISH. Probe berlabel
DIG- (digoxigenin-) digunakan untuk hibridisasi, dan sinyal positif terdeteksi
dengan NBT (nitro-biru tetrazolium klorida) dan BCIP (5-bromo-4-chloro-3 -
indolyphosphate p-toluidine salt). Sinyal positif (ungu kecoklatan) diamati pada
leukosit dengan DNA bakteri intraseluler (panah)

Tes ISH menunjukkan hasil positif dalam 10 dari 11 SBP ascites sampel,
sedangkan hasil negatif yang diperoleh dalam semua sisa 40 sampel ascites non-
SBP. Penemuan-penemuan ini menunjukkan bahwa tes ISH hasil sensitivitas
tinggi (91%) dan spesifisitas (100%) untuk mendeteksi DNA bakteri phagocytized
di leukosit ascites pasien SBP. Yang penting, tes ISH menunjukkan temuan positif
dalam tujuh kasus dengan hasil kultur negatif, sehingga menunjukkan bahwa
metode ISH dapat digunakan untuk mengidentifikasi infeksi bakteri yang tidak
terdeteksi dengan menggunakan metode kultur bakteri [17]. Selanjutnya, hasil tes
ISH diperoleh dalam satu hari, konsisten dengan yang diamati untuk sampel darah
septik. Oleh karena itu, metode ISH baru didirikan ini mengakibatkan cepat dan
sensitifdeteksi DNA bakteri di ascites PBS, sehingga menyiratkan utilitas untuk
menyediakan awal dan bukti langsung dari infeksi bakteri. Meskipun uji klinis
tambahan skala besar diperlukan untuk mengevaluasi metode ISH secara detail,
tes baru ini mungkin menawarkan sebuah novel dan efektif pendekatan untuk
pengelolaan PBS.

Marga Jenis
Eggerthella lenta
diphtheriae
pseudodiphteriti
Corynebacterium cum
jeikeium
Propionibacterium acnes
Micrococcus luteus
fermentum
Lactobacillus
acidophilus
Basil cereus
aureus
Staphylococcus
epidermidis
faecalis
Enterococcus faecium
avium
pneumoniae
sanguinis
Streptococcus pyogenes
agalactiae
salivarius
Clostridium perfringens
Peptoniphilus asaccharolyticus
fragilis
Bacteroides
ovatus
Porphyromonas asaccharolytica
nucleatum
Fusobacterium
necrophorum
Brevundimonas diminuta
Burkholderia cepacia
Achromobacter xylosoxidans
aeruginosa
Pseudomonas fluorescens
putida
Acinetobacter calcoaceticus
Escherichia coli
cloacae
sakazakii
Enterobacter
aerogenes
gergoviae
pneumoniae
Klebsiella aerogenes
oxytoca
Raoultella terrigena
Haemophilus influenzae
marcescens
Serratia
liquefaciens
Citrobacter koseri
Hafnia alvei

Tabel 1: Lanjutan.

Marga Jenis
Edwardsiella tarda
vulgaris
Proteus
mirabilis
rettgeri
alcalifacien
Providencia s
stuartii
Morganella morganii
Salmonella enterica
agglomera
Pantoea ns
Kluyvera intermedia
Raoultella planticola
Stenotrophom maltophili
onas a
Kesimpulan

Diagnosis dan pengobatan yang cepat memainkan peran kunci dalam

tatalaksana PBS secara umum, penyakit menular terkait sirosis yang berpotensi
fatal didiagnosis hanya berdasarkan peningkatan jumlah PMN dalam cairan asites,
dan identifikasi patogen penyebab kadang-kadang tidak dipertimbangkan.
Meskipun tidak ada metode yang ideal untuk mendeteksi bakteri penyebab telah
ditetapkan, uji ISH baru kami dapat digunakan untuk memberikan bukti awal dan
langsung infeksi bakteri pada pasien SBP dengan asites. Temuan saat ini karena
itu memberi titik baru pada manajemen SBP

Singkatan

PBS: peritonitis bakteri spontan

TB: translokasi bakteri

PMN: neutrofil polimorfonuklear
ISH: in situ hibridisasi
PCR: polymerase chain reaction.