TUGAS

SITOHISTOTEKNOLOGI

(rinkasan dari hal 493-503)

Nama : laelatuz zohrah

Nim : B1810430

Prodi : DIII Teknologi Laboratorium Medik

POLITEKNIK

MEDICA FARMA HUSADA

MATARAM
 Mikroskop electron transmisi
 Keuntungan mendasar dari transmisi electron microscopy (TEM) dibandingkan scopy mikro
cahaya konvensional adalah bahwa mikroskop elektron memiliki resolusi sekitar 1000 kali lebih
baik dari pada lingkup mikro cahaya. Dengan daya penyelesaian yang lebih besar ini, mikroskop
elektron tran misi dapat mengungkapkan substruktur atau ultrastruktur sel-sel individual.
 Prinsip dasar yang mendasari TEM adalah bahwa elektron melewati bagian untuk memberikan
gambar spesimen. Namun, berkas elektron hanya mampu menembus sekitar 100nm, sehingga,
untuk mendapatkan gambar berkualitas tinggi dan mengoptimalkan resolusi instrumen, perlu
untuk memotong jaringan hingga ketebalan sekitar 80nm.
 Bagian pada tingkat ini membutuhkan jaringan untuk tertanam dalam bahan yang sangat kaku.
Jelas media penyisipan lilin yang digunakan dalam mikroskop cahaya tidak cocok. Dalam TEM
temp, resin penyisipan sintetis digunakan yang mampu menahan vakum dalam kolom
mikroskop elektron dan panas yang dihasilkan ketika elektron melewati bagian tersebut.
Meskipun media hidrofilik tersedia, dalam kebanyakan keadaan, resin epoksi hidrofobik lebih
disukai

A. Penanganan spesimen

Untuk menjaga ultrastruktur sel, sangat penting bahwa sampel diperbaiki sesegera mungkin setelah
biopsi diambil. Indikator seluler paling sensitif dari perubahan autolitik / degeneratif adalah mitokondria
dan retikulum endoplasma, yang keduanya dapat menunjukkan tanda-tanda pembengkakan (refleksi
ketidakseimbangan osmotik) hanya beberapa menit setelah sel dipisahkan dari suplai darah,Pendekatan
standar adalah untuk merendam specimen dalam fiksatif (lebih disukai pra-pendinginan hingga 4 °
C).segera setelah pengumpulan. Setelah di fiksasi spesimen dipotong menjadi sampel yang lebih kecil
menggunakan pisau bedah atau pisau cukur. Pada titik ini jaringan harus diorientasikan dan dibedah
untuk mengoptimalkan paparan fitur diagnostik kritis selama pemotongan dan penyaringan. Diseksi juga
harus memfasilitasi pene fiksasi fiksatif dan pemrosesan reagen. blok jaringan akhir mungkin dalam
bentuk lembaran tipis atau kubus kecil (~ 1mm3), meskipun risiko kesalahan kesalahan meningkat ketika
ukuran sampel menurun. Secara umum, volume fiksatif harus setidaknya 10 kali volume jaringan.
Penting juga untuk memastikan bahwa jaringan tetap sepenuhnya disatukan dalam fiksatif - potongan
kecil dapat melekat.bagian dalam tutup wadah biopsi; ini akan diperbaiki dengan buruk bahkan jika
mereka telah terkena uap fiksatif. Mengaduk botol dengan lembut pada rotator mekanis akan
membantu mengatasi masalah ini dan meningkatkan fiksasi.

Pentingnya menggunakan sampel kecil tidak bisa terlalu ditekankan. Penggunaan fiksatif dingin
membantu meminimalkan perubahan postmortem tetapi fiksasi dapat terhambat sebagai akibatnya.
Selain itu, tingkat pen pena sebagian besar fiksatif TEM cukup lambat, meningkatkan risiko
pembentukan artefak. Juga harus dicatat bahwa fiksatif dan reagen pemrosesan menembus jaringan
yang berbeda pada tingkat yang berbeda, dan beberapa jaringan (seperti hati) sangat buruk. Biopsi hati
dengan jarum mungkin perlu dipotong secara longitudinal untuk memastikan fiksasi yang adekuat. Jika
keterlambatan fiksasi tidak dapat dihindari, kerusakan dapat diminimalkan dengan memegang jaringan
(hanya untuk waktu singkat) dalam salin normal dingin. Namun, jaringan tidak boleh dibekukan kapan
saja.

1.Fiksasi

Fiksatif yang digunakan dalam TEM umumnya terdiri dari zat pengikat dalam buffer (untuk
mempertahankan pH) dan, jika perlu, dengan berbagai aditif untuk mengontrol osmolaritas dan
komposisi ionik. Faktor-faktor lain yang mempengaruhi fiksasi termasuk konsentrasi dan suhu fiksatif,
dan lamanya fiksasi. Protokol standar melibatkan fiksasi primer dengan aldehida (biasanya
glutaraldehida) untuk menstabilkan protein, diikuti oleh fiksasi sekunder dalam osmium tetroksida
untuk mempertahankan lipid (Hayat 1981).

 Konsentrasi fiksatif

Glutaraldehyde efektif pada konsentrasi antara 1,5% dan 4%, dengan 2,5% paling sederhana untuk
dibuat dari 25% larutan stok yang tersedia secara komersial. Osmium tetroxide biasanya digunakan pada
konsentrasi 1% atau 2%.

 Suhu

Fiksasi pada suhu kamar meningkatkan laju penetrasi (terutama fiksatif aldehida) dan mengurangi waktu
yang diperlukan untuk fiksasi meskipun juga meningkatkan risiko perubahan autolitik. Osmium tetroxide
umumnya digunakan pada suhu kamar.

 Durasi fiksasi

Waktu yang diperlukan untuk fiksasi optimal tergantung pada berbagai faktor, termasuk jenis jaringan,
ukuran sampel, dan jenis fiksatif dan sistem penyangga yang digunakan. Dalam sebagian besar keadaan,
perendaman 0,5-1,0 mm blok jaringan dalam 2,5% fiksatif glutaraldehid selama 2-6 jam sudah cukup.
Direkomendasikan bahwa punch biopsi kulit yang diambil untuk arteriopati dominan autos otak serebral
dengan infark subkortikal dan skrining leukukoensefalopati (CADASIL) harus diperbaiki dalam semalam
(untuk memastikan pelestarian yang memadai), terutama jika dibiarkan utuh (yaitu, tidak dibedah) dan
dikirim ke laboratorium yang jauh untuk proses dan penyaringan. Fiksasi sekunder dalam 1% osmium
tetroksida selama 60-90 menit biasanya efektif; diperlukan waktu yang lebih lama jika osmium tetroxide
adalah fiksatif utama. Penggunaan iradiasi gelombang mikro dapat mempercepat waktu fiksasi dalam
fiksatif aldehida hingga 5-10 detik (Leong 1994), setelah itu sampel dapat disimpan dalam buffer atau
diproses segera.

Buffer

Fiksatif biasanya disangga dalam kisaran pH 7,2-7,6 (Robinson & Gray 1996). Idealnya komposisi
osmolaritas dan ionik dari buffer harus meniru jaringan yang diperbaiki. Dalam praktik umum ini bukan
persyaratan utama tetapi, jika diperlukan, 300-330 mOsm (osmolaritas yang setara dengan plasma atau
sedikit hipertonik) cocok untuk sebagian besar keadaan. Molekul-molekul non-ionik seperti glukosa,
sukrosa atau dekstran digunakan untuk mengatur tonisitas karena ini tidak akan mempengaruhi
konstitusi ion buffer. Penambahan berbagai garam, khususnya kalsium dan magnesium, diperkirakan
meningkatkan pelestarian jaringan, mungkin dengan menstabilkan membran (Hayat 1981). Ini tidak
mungkin memiliki pengaruh besar dalam aplikasi diagnostik rutin.

Cuci penyangga dan pewarnaan

Setelah fiksasi primer pada glutaraldehyde, jaringan dapat diobati dengan beberapa cara. Bahan yang
harus disimpan dapat dibilas sebentar (dalam buffer yang kompatibel dengan kendaraan fiksatif),
kemudian disimpan dalam buffer segar. Jaringan yang akan diproses segera harus dicuci dalam buffer
sebelum pasca-fiksasi dalam osmium tetroxide, kemudian dicuci lagi dalam buffer atau air untuk
menghilangkan kelebihan osmium. Ini penting karena osmium tetroksida dan alkohol bereaksi
membentuk endapan hitam. Langkah opsional pada titik ini adalah merendam jaringan setelah fiksasi
dalam 2% larutan uranil asetat. Prosedur pewarnaan en bloc ini menambah kontras bagian akhir dan
meningkatkan

2.Dehidrasi

Senyawa penyisipan yang paling umum digunakan dalam TEM adalah resin epoksi. Ini benar-benar
bersih dengan air, sehingga membutuhkan spesimen untuk didehidrasi.Dehidrasi dilakukan dengan
melewatkan spesimen melalui peningkatan konsentrasi pelarut organik. Adalah perlu untuk
menggunakan seri bertingkat untuk mencegah kerusakan yang akan terjadi dengan perubahan ekstrim
dalam konsentrasi pelarut, tetapi juga penting untuk menjaga waktu dehidrasi sesingkat mungkin untuk
meminimalkan risiko penggalian konstituen seluler. Dehidran yang paling sering digunakan adalah
aseton dan etanol. Aseton harus dihindari jika pewarnaan en bloc dengan uranil asetat telah dilakukan
untuk mencegah pengendapan garam uranium. Etanol mengatasi kesulitan ini tetapi membutuhkan
penggunaan propilena oksida (1,2-epoksipropana) sebagai pelarut transisi untuk memfasilitasi infiltrasi
resin. Sisa dehidran dapat menyebabkan blok lunak atau tambal sulam.

Etanol 'absolut' yang tersedia secara komersial juga tidak mengandung sedikit air. Ini akan sangat
membatasi infiltrasi dan polimerisasi resin dan perlu untuk menyelesaikan dehidrasi dalam etanol
anhidrat (yang dapat diperoleh secara komersial atau dibuat dengan menggunakan saringan molekuler
yang sesuai). Propylene oxide sangat mudah menguap, mudah terbakar dan dapat membentuk
peroksida yang mudah meledak; itu harus disimpan pada suhu kamar di fasilitas pelarut yang mudah
terbakar.

3.Menanamkan(embedding )

Praktik standar setelah dehidrasi dan, jika perlu, perawatan dengan pelarut transisi, adalah untuk
menyusup ke sampel jaringan dengan resin cair. Ini biasanya membutuhkan pengenalan resin secara
bertahap, dimulai dengan campuran 50: 50 pelarut transisi (propilena oksida) dan resin diikuti oleh 25:
75.transisi campuran resin pelarut, kemudian, akhirnya, resin murni. Satu jam di setiap langkah infiltrasi
pendahuluan biasanya memadai, meskipun lebih disukai untuk meninggalkan sampel dalam resin murni
selama 24 jam. Agitasi lembut menggunakan rotator miring kecepatan rendah selama langkah-langkah
ini direkomendasikan, karena kegagalan untuk menyusup sepenuhnya jaringan akan menyebabkan
kesulitan pemotongan besar.

Setelah diinfiltrasi, sampel jaringan ditempatkan dalam cetakan yang sesuai yang diisi dengan resin dan
dibiarkan berpolimerisasi menggunakan panas. Strip kertas yang memuat kode identifikasi jaringan yang
ditulis dengan pensil atau cetak laser juga disertakan. Berbagai cetakan berbentuk dan ukuran tersedia.
Kapsul yang terbuat dari polietilena direkomendasikan karena tidak bereaksi dengan resin, seperti
halnya cetakan yang ditanam rata yang terbuat dari karet silikon. Blok terpolimerisasi dapat dengan
mudah dihilangkan dari yang terakhir dengan menekuk cetakan, yang kemudian dapat digunakan
kembali. Kapsul polietilen dapat dipotong dari blok menggunakan pisau cukur atau pisau bedah atau
blok dapat diekstrusi dari kapsul menggunakan tang atau tang besar.

 Resin epoksi

Resin epoksi telah menjadi media penyisipan pilihan dalam TEM sejak diperkenalkan pada pertengahan
1950-an (Glauert etal. 1956). Resin ini mengandung gugus kimia khas di mana oksigen dan dua atom
karbon berikatan membentuk cincin beranggota tiga (‘epoksida’). Hubungan silang antara kelompok-
kelompok ini menciptakan polimer tiga dimensi dengan kekuatan mekanik yang besar. Proses
polimerisasi menghasilkan penyusutan yang sangat sedikit (biasanya kurang dari 2%) dan, setelah
selesai, bersifat permanen. Serta sifat mereka dari polimerisasi seragam dan penyusutan rendah, resin
epoksi juga menjaga jaringan ultrastruktur, stabil dalam berkas elektron, bagian mudah dan mudah
tersedia.

Resin epoksi biasanya terdiri dari empat bahan: resin monomerik, pengeras, akselerator, dan plasticizer.
Meskipun produsen memberikan saran tentang proporsi yang sesuai, kekerasan dan fleksibilitas blok
dan waktu polimerisasi dapat dimanipulasi dengan memvariasikan jumlah

 Prosedur untuk sampel jaringan lain

komponen individual. Ini adalah proporsi dari setiap komponen yang penting karenanya resin dapat
dibuat berdasarkan volume atau berat. Pendekatan paling sederhana adalah menimbang komponen-
komponen ke dalam kertas atau cangkir plastik yang rusak; karena resin yang tidak digunakan dapat
dipolimerisasi dan dibuang dalam wadah. Pencampuran komponen yang seksama sangat penting
disiapkan, resin paling baik dikirim melalui jarum suntik plastik atau pipet non-reaktif.

 Resin akrilik

Resin akrilik (metakrilat) berasal dari asam akrilat met [CH2 = C • (CH3) COOH] dan asam akrilat [CH2 =
CH • COOH] dan merupakan media sintetis asli yang dikembangkan untuk digunakan dalam TEM. Resin
akrilik dapat dengan cepat menyusup ke jaringan yang rusak dan kering pada suhu kamar. Namun,
ditandai, penyusutan variabel komponen jaringan adalah umum karena polimerisasi yang tidak dapat
diandalkan dan resin akrilik relatif tidak stabil dalam berkas elektron. Akrilik yang tersedia saat ini
sekarang dipolimerisasi menggunakan proses cross-linking, dengan demikian mengatasi kerugian
sebelumnya. Monomer akrilik memiliki viskositas rendah, dan kedua bentuk hidrofilik dan hidrofobik
dapat diperoleh. Resin akrilik bereaksi dengan polimerisasi radikal bebas, yang dapat dimulai
menggunakan cahaya, panas atau akselerator kimia (katalis) pada suhu kamar.

Resin akrilik komersial utama adalah LR White dan LR Gold dan seri Lowicryl (K4M, K11M, HM20, dan
HM23). Masing-masing dapat digunakan untuk dehidrasi suhu rendah dan embedding untuk
mengurangi kerusakan panas dari ionisasi dan ekstraksi polimer eksotermik dengan pelarut dan
komponen resin (Acetarin etal. 1986; Newman dan Hobot 1987, 1993). Karakteristik ini membuat
beberapa bentuk resin akrilik ideal untuk pelabelan emas immuno elektron (Stirling 1994) dan studi
enzim sitokemi.

 Jadwal pemrosesan jaringan

Pemrosesan jaringan manual paling baik dilakukan dengan menjaga sampel jaringan dalam botol yang
sama keluar, dan menggunakan pipet halus untuk mengubah solusi. Saat memproses beberapa sampel,
berhati-hatilah agar tidak mencemari-silang spesimen - gunakan pipet terpisah. Semua vial harus dilabeli
dengan jelas dan labelnya harus 'solvent-proof'. Adalah menguntungkan untuk menggerakkan spesimen
jaringan sepanjang siklus pemrosesan untuk meningkatkan permeasi reagen. Protokol untuk
pemrosesan rutin sampel jaringan padat diberikan pada Tabel 22.1.

 Prosedur untuk sampel jaringan lain

Sel yang dikultur

Kultur sel dapat difiksasi in situ, kemudian dipisahkan dari substrat, disentrifugasi menjadi pelet dan
diperlakukan sebagai jaringan padat. Atau, sel-sel dapat dipanen ke dalam tabung centrifuge, dipelet
ringan, diresuspensi dalam fiksatif dan sekali lagi dipelet dengan sentrifugasi lembut. Setelah fiksasi,
tabung dibalik untuk mengeluarkan pelet, yang kemudian dipotong menjadi kubus untuk diproses lebih
lanjut. Akhirnya kultur sel dapat diperbaiki dan diproses sambil melekat pada substra tum, setelah itu
kapsul embedding terbalik ditekan ke lapisan sel. Setelah dipolimerisasi, blok dapat dipisahkan dengan
paksa atau setelah didinginkan dalam nitrogen cair (lihat teknik 'Pop-off', di bawah).

4.Pewarnaan(staining)

Tujuan pewarnaan bagian dalam TEM adalah untuk meningkatkan kapasitas elemen struktural yang
dipilih untuk menyebarkan elektron dan dengan demikian memberikan kontras spesimen. Ini dicapai
dengan memperkenalkan atom logam berat yang mengendap pada komponen jaringan. Perlu dicatat
bahwa kontras gambar juga dapat dimanipulasi dengan mengubah ukuran bukaan lensa objektif.
Dengan demikian, kontras gambar adalah fungsi interaksi antara percepatan tegangan, ukuran bukaan
lensa objektif, ketebalan bagian dan pewarnaan yang digunakan.

Jaringan diwarnai pada beberapa titik selama persiapan preparasi (Glauert & Lewis 1998; Hayat 2000):
Selama fiksasi sekunder (karena osmium diendapkan dalam membran).Ketika uranyl asetat digunakan
selama pencucian pasca-fiksasi.Dengan pewarnaan bagian dengan garam timbal dan uranium (dikenal
sebagai pewarnaan en-section).
Metode standar untuk pewarnaan bagian adalah dengan mengapungkan kisi-kisi, bagian-sisi-ke bawah,
pada tetes larutan pewarnaan untuk waktu yang diperlukan. Atau, kisi-kisi dapat sepenuhnya tenggelam
dalam solusi. Prosedur ini dilakukan pada permukaan yang bersih (seperti cawan Petri) untuk
meminimalkan kontaminasi. Biasanya, bagian diwarnai dalam uranyl asetat diikuti oleh timbal sitrat
(Reynolds 1963). Setelah setiap langkah pewarnaan, kisi dicuci di bawah aliran air suling yang lembut
atau dengan mencelupkannya ke dalam air suling. Akhirnya, kisi-kisi dikeringkan menggunakan kertas
saring bebas serat bersih. Jika tingkat kontras yang dicapai tidak mencukupi, metode pewarnaan timah
ganda dapat digunakan (Daddow 1983).

 Garam uranil

Uranyl acetate adalah garam uranium yang biasanya digunakan dalam TEM meskipun uranyl nitrate dan
magnesium uranyl acetate juga efektif. Ion uranyl bergabung dalam jumlah besar dengan gugus fosfat
dalam asam nukleat serta gugus fosfat dan karboksil pada permukaan sel (Hayat 2000). Larutan encer
antara 2% dan 5%, diterapkan pada bagian ini, akan memberikan kontras yang memuaskan tetapi
pewarnaan yang lebih intens dapat dicapai dalam waktu yang lebih singkat dengan menggunakan
larutan etanol (atau metanol) jenuh (~ 7%). Asetat uranil adalah radioaktif dan sangat beracun; efeknya
bersifat kumulatif dan tindakan pencegahan yang tepat harus diikuti.

 Garam timbal

Noda timbal meningkatkan kontras berbagai komponen jaringan. Noda timbal harus disiapkan dan
digunakan dengan hati-hati karena ion timbal berpotensi bereaksi dengan karbon dioksida atmosfer,
membentuk endapan yang baik dari karbonat timbal. Deposito muncul sebagai kontaminan padat-
elektron pada bagian yang tidak dapat dihilangkan dengan mudah. Metode persiapan Reynolds, yang
umum digunakan, mengatasi masalah ini dengan mengkelat dan dengan demikian melindungi ion timbal
dari paparan karbon dioksida