Abstrak

Monoclonal antibody (MAb)-based ELISA was developed to detect leptospiral antigens from
the plasma of febrile patients. The MAb reacts specifically with pa-thogenic leptospires and
the assay possesses excellent diagnostic test parameters compared to PCR, indicating that this
new ELISA is useful for the early diagnosis of leptospirosis with low operational cost.

Abstrak
Antibodi monoklonal (MAb)-berbasis ELISA dikembangkan untuk mendeteksi antigen
leptospiral dari plasma pasien dengan keluhan demam. MAb bereaksi secara khusus dengan
leptospira patogen dan pemeriksaan ini memiliki parameter uji diagnostik yang sangat baik
dibandingkan dengan PCR, hal ini menunjukkan bahwa metode ELISA baru ini berguna untuk
diagnosis awal leptospirosis dengan biaya operasional yang rendah.

Leptospirosis is considered the most widely spread bacterial zoonotic disease among humans
and animals, which is caused by patho-genic spirochetes of the genus Leptospira. Transmission
of pathogenic Leptospira spp. occurs through skin abrasions or mucous membranes (Hauk et
al., 2008; Chen et al., 2013) and it is considered as an occupational disease among those who
have significant exposure to urine and bodily fluids of infected animals (Victoriano et al.,
2009). The disease is an endemic and one of the notifiable diseases in Sri Lanka, which results
in high morbidity and considerable mortality in high prevalence regions (Gamage et al., 2012).
Majority of the reported cases are based on surveillance case definition (Surveillance Case
Definitions for Notifiable Diseases in Sri Lanka, 2011), which is purely based on clinical
symptoms and epidemiological factors. However, non specific clinical symptoms in
leptospirosis frequently lead to a misdiagnosis as dengue fever, hantavirus infection, scrub
typhus or malaria (Gamage et al., 2012). Consequently, confirmation of leptospirosis remains
a challenge.

Leptospirosis merupakan penyakit zoonosis yang penularannya terjadi antara manusia dan
hewan, yang disebabkan oleh bakteri spirochaetal patogen dari genus Leptospira. Transmisi
pathogen dari Leptospira spp. ini terjadi melalui lecet kulit atau selaput lendir (Hauk et al.,
2008; Chen et al., 2013) penyakit ini termasuk dalam penyakit okupasional yang mengenai
orang yang terpapar urin dan cairan tubuh dari hewan yang terinfeksi secara
significant.(Victoriano et al., 2009). Penyakit ini bersifat endemik dan merupakan salah satu
penyakit yang diwaspadai di Sri Lanka, yang menghasilkan tingkat morbiditas yang tinggi dan
mortalitas yang cukup besar di daerah dengan angka prevalensi tinggi (Gamage et al., 2012).
Sebagian besar kasus yang dilaporkan berdasarkan Surveilance Definisi Kasus untuk
Pengawasan Penyakit (Surveillance Case Definitions for Notifiable Diseases in Sri Lanka,
2011), adalah murni didasarkan pada gejala klinis dan faktor epidemiologi. Namun, gejala-
gejala klinis yang muncul secara umum pada leptospirosis mirip dengan gelala klinis penyakit
lainnya seperti demam berdarah, hantavirus infeksi, tipus scrub atau malaria sehingga bias
menyebabkan kesalahan diagnosis (Gamage et al., 2012). Sehingga, konfirmasi diagnosis
leptospirosis menjadi tantangan.

Leptospiral DNA detection in blood by PCR is preferable for early diagnosis of leptospirosis
(Nizamuddin et al., 2006;). However, PCR is not an economical diagnostic tool for many
resource-limited countries where leptospirosis is endemic. Therefore, current studies have
focused on developing a diagnostic test for antigen detection in clinical samples. It is expected
that antigen detection tests would be faster, cost effective, and suitable for diagnosis in the
acute stage without high-tech equipment.

Deteksi Leptospiral DNA dalam darah oleh PCR lebih dianjurkan untuk penegakan diagnosis
dini leptospirosis (Nizamuddin et al., 2006;). Namun, PCR bukanlah alat diagnostik yang
ekonomis bagi banyak negara sumber daya terbatas dimana leptospirosis merupakan penyakit
endemik di negara itu. Oleh karena itu, studi saat ini berfokus pada pengembangan tes untuk
mendeteksi antigen dalam sampel. Diharapkan bahwa tes deteksi antigen ini akan menjadi lebih
cepat, hemat dan cocok untuk diagnosis pada tahap akut tanpa peralatan berteknologi tinggi.

For this, monoclonal antibody (MAb)-based ELISA has been developed to detect pathogenic
leptospires in urine (Widiyanti et al., 2013). However, leptospires are excreted in urine more
in late acute phase and the sensitivity of antigen detection in urine may be low in early acute
phase. Thus, detection of leptospiral antigen in patient blood would be the best rapid method
to confirm acute leptospirosis, and we attempted to develop a MAb-based ELISA to detect
leptospiral antigens from plasma samples of clinically suspected leptospirosis patients.

Untuk ini, antibodi monoklonal (MAb)-berbasis ELISA telah dikembangkan untuk mendeteksi
leptospira pathogen dalam urin (Widiyanti et al., 2013). Namun, leptospira yang diekskresikan
dalam urin lebih banyak terdapat pada akhir fase akut dan sensitivitas deteksi antigen dalam
urin mungkin rendah di awal fase akut. Dengan demikian, Deteksi antigen leptospiral darah
pasien merupakan metode yang cepat terbaik untuk mengkonfirmasi leptospirosis akut, dan
kami berusaha untuk mengembangkan MAb berbasis ELISA untuk mendeteksi antigen
leptospiral dari sampel plasma pasien yang secara klinis dicurigai leptospirosis .

A MAb clone MD14 for Lip32 (Shiokawa et al., 2016) were used for antigen capture ELISA.
For the evaluation of reactivity of MD14 to leptospiral antigens, ninety-six-well plates (3590,
Corning Inc. Life Sciences, Lowell, MA, U.S.A.) were coated with 50 ul of MAb at a
concentration of 1 μg/μl and incubated at 4 °C overnight. After over-night incubation, plates
were washed six times with Dulbecco's phos-phate buffered saline (PBS) containing 0.05%
Tween 20 (PBS-T).

Klon MAb MD14 untuk Lip32 (Shiokawa et al., 2016) digunakan untuk menangkap antigen
ELISA. Sebagai penialian reaktivitas MD14 untuk antigen leptospiral, 99 well plate (3590,
Corning Inc Life Sciences, Lowell, MA, Amerika Serikat) dilapisi dengan 50 ul MAb pada
konsentrasi 1 μg/μl dan diinkubasi pada 4 ° C dalam semalam. Setelah diinkubasi semalam,
well-plate tersebut dicuci 6x dengan Dulbecco's phosphate buffered saline (PBS) yang
mengandung 0,05% Tween 20 (PBS-T).

The plates were blocked with PBS containing 3% bovine serum albumin (Sigma-Aldrich,
USA) at 37 °C for 1 h. After washing the plates, 50 μl of the leptospiral suspension (5 × 107
cells in PBS, heat-inactivated at 56 °C for 10 min) was added to each well. Four pathogenic
leptospires, L. interrogans serovar Hebdomadis strain OP84, L. interrogans serovar Bataviae
strain Viet16, L. borgpetersenii serovar Javanica strain R35 (isolated in Sri Lanka), L.
interrogans serovar Manilae strain UP-MMC-NIID, and a non-pathogenic L. biflexa serovar
Patoc strain Patoc I were used.

Plate diblokir dengan PBS yang mengandung 3% albumin serum sapi (Sigma Aldrich, USA)
pada 37 ° C untuk selama 1 jam. Setelah dicuci, 50 μl suspensi leptospiral (5 × 107 sel di PBS,
heat-inactivated pada suhu 56 ° C selama 10 menit) ditambahkan ke tiap well-plate. Empat
leptospira patogen, L. interrogans serovar Hebdomadis strain OP84, L. interrogans serovar
Bataviae strain Viet16, L. borgpetersenii serovar Javanica strain R35 (terisolasi di Sri Lanka),
L. interrogans serovar Manilae strain UP-MMC-NIID, dan leptospira non-patogenik L. biflexa
serovar Patoc strain Patoc I digunakan.
After incubation for 1 h at 37 °C, the plates were washed with PBS-T as described above.
Hyper-immune rabbit serum against L. interrogans serovar Copenhageni diluted at 1:500 with
PBS-T and horseradish peroxidase (HRP)-labeled anti-rabbit antibody (SeraCare Life
Sciences, USA) diluted at 1:5000 with PBS-T were added and incubated for 1 h at 25 °C
followed by six times washes with PBS-T.

Setelah diinkubasi selama 1 jam pada suhu 37°C, well-plate dicuci dengan PBS-T seperti
dijelaskan di atas. Serum kelinci Hyper-imun dari L. interrogans serovar Copenhageni
diencerkan pada 1: 500 dengan PBS-T dan horseradish peroxidase (HRP) anti antibody kelinci
(SeraCare Life Sciences, USA) diencerkan pada 1:5000 dengan PBS-T ditambahkan dan di
inkubasi selama 24 jam pada suhu 25° C diikuti oleh enam kali pencucian dengan PBS-T.

Thereafter, color development reaction was executed with 100 μl of 0.17% o-

phenylenediamine dihydrochloride (OPD) (Sigma-Aldrich, USA) in 30% H2O 2 substrate
solution for 10 mins at 25 °C. After 10 mins, the reaction was stopped by adding 30 μl of 10%
sulfuric acid. The absorbance of samples was measured at 492/650 nm by using a microplate
spectrophotometer. As shown in Fig. 1, OD values from pathogenic leptospires were
significantly higher than that from a non-pathogenic strain (p < .05), demonstrating that this
MAb reacts specifically with pathogenic leptospires.

Kemudian, warna pengembangan reaksi dieksekusi dengan 100 μl 0,17% o-phenylenediamine

dihydrochloride (Sigma Aldrich, USA) dalam 30% H2O2 substrat solusi untuk 10 menit di
25°C. Setelah 10 menit, reaksi dihentikan dengan menambahkan 30 μl 10% asam sulfat.
Absorbansi sampel diukur dengan menggunakan spectrophotometer microplate dengan
panjang gelombang 492/650 nm. Seperti ditunjukkan dalam gambar 1, nilai-nilai OD dari
leptospira patogen secara signifikan lebih tinggi daripada strain non-patogenik (p <.05), hal
inimenunjukkan bahwa MAb bereaksi secara khusus dengan leptospira patogen.

Next, MAb-based ELISA was applied to detect antigen / whole cell from patients' plasma
samples. One hundred fifty-four frozen plasma samples from leptospirosis-suspected patients
were obtained from Department of Microbiology, Faculty of Medicine, University of
Peradeniya, Sri Lanka, employed for the detection of pathogenic leptospiral DNA using flaB-
nested PCR (Koizumi et al., 2008) and the MAb-based ELISA. For MAb-based ELISA, one
ml of plasma samples were centrifuged at 13,000 ×g for 20 min. The resulting pellet was re-
sus-pended in 100 μl of PBS and heated at 56 °C for 10 mins, of which 50 μl was used for
antigen detection ELISA. First, the cut-off value of the assay was determined as 0.64 by using
randomly selected 50 serum samples from flaB-nested PCR-negative patients according to the
following equation;

Berikutnya, MAb berbasis ELISA diterapkan untuk mendeteksi antigen / seluruh sel dari
sampel plasma pasienl. Seratus lima puluh empat sampel plasma beku dari pasien yang
dicurigai terkena leptospirosis diperoleh dari Departemen Mikrobiologi, Fakultas Kedokteran,
Universitas Peradeniya, Sri Lanka, digunakan untuk mendeteksi DNA leptospira patogen
menggunakan flaB nested PCR (Koizumi et al., 2008) dan ELISA berbasis MAb. Untuk ELISA
berbasis MAb, 1ml sampel plasma yang disentrifugasi dengan kecepatan 13.000 xg selama 20
menit. Pelet yang dihasilkan diresuspensi dengan 100 μl PBS dan dipanaskan pada 56 ° C
selama 10 menit, yang 50 μl digunakan untuk mendeteksi antigen ELISA. Pertama, nilai cut-
off dari pemeriksaan ditentukan sebesar 0,64 dengan menggunakan 50 sampel serum dari hasil
sampel negative pasien yang diperiksa dengan flaB menurut persamaan berikut :

Cut off value = Average OD value of PCR negative samples + 2 standard deviations

Of 154 leptospirosis-suspected patients majority (80.5%) were male. Half of the suspected
patients were forty years old or above. Among 154 leptospirosis-suspected patients, 13 (8.4%)
patients were positive by flaB-nested PCR and 11 (7.14%) were positive by MAb-based ELISA
(Table 1). Ten out of 13 (76.9%) flaB-nested PCR positive patients were male and 9 patients
were found in the early stage of the illness (fever days 3–7). Of 13 flaB-nested PCR positive,
three (23.1%) were female patients and two were found to be in the later stage of the illness
(fever days 5–6). Moreover, majority (61.52%) of the positive patients were forty years of age
or above.

Mayoritas pasien dicurigai leptospirosis 154 (80,5%) berjenis kelamin laki-laki. Setengah dari
pasien dicurigai berusia empat puluh tahun atau lebih. Dari 154 pasien yang dicurigai
leptospirosis, terdapat 13 (8.4%) pasien yang positif dengan pemeriksaan flaB-nested PCR dan
11 (7.14%) yang positif dengan pemeriksaan ELISA berbasis MAb (Tabel 1). Sepuluh dari 13
(76,9%) flaB nested PCR positif pasien adalah laki-laki dan 9 pasien ditemukan pada tahap
awal penyakit (demam hari 3-7). Dari 13 pasien dengan flaB-nested PCR positif, 3 (23,1%)
diantaranya adalah wanita dan 2 diantaranya ada dalam tahap akhir penyakit (demam hari 5-
6). Selain itu, mayoritas (61.52%) pasien positif berusia 40 tahun atau lebih.

Diagnostic test evaluation revealed this new assay's sensitivity as 84.62% (95% CI: 54.55% ~
98.08%), specificity as 100% (95% CI: 97.42% ~ 100%), positive predictive value as 100%
and negative predictive value as 98.60% (95% CI: 95.17–99.84%).

Evaluasi tes diagnostik menunjukan bahwa sensitivitas pemeriksaan ini sebesar 84,62% (95%
CI: 54.55% ~ 98.08%), dengan spesifitas sebesar 100% (95% CI: 97.42% ~ 100%), nilai
prediktif positif sebesar 100% dan negatif nilai prediktif sebesar 98.60% (95% CI: 95.17 –
99.84%).

These results clearly indicate that this new assay is comparable to the nested PCR and is
suitable for the detection of pathogenic leptospires in human plasma in the early phase of
infection. To the best of our knowledge, detection of leptospiral antigens in the plasma of
suspected leptospirosis patients using immunological techniques has not been widely studied.

Hasil ini dengan jelas menunjukkan bahwa pemeriksaan cara baru ini sebanding dengan
pemeriksaan nested-PCR dan sangat cocok untuk mendeteksi leptospira patogen dalam plasma
manusia pada tahap awal infeksi. Sepanjang pengetahuan kami, deteksi antigen leptospiral
dalam plasma dari pasien yang dicurigai leptospirosis dengan menggunakan teknik imunologi
belum banyak dipelajari.

One study from Thailand reported the successful detection of leptospiral antigens in plasma
from experimentally infected animals using a sandwich dot-ELISA using polyclonal and
monoclonal antibodies (Sharma et al., 2008). However, the sensitivity of this assay may be
dependent on the combination of serovar/serogroup of Leptos-pira strains infected and
secondary antisera: serovar Bataviae exhibited lower OD value than the cut-off value (Fig. 1).

Satu studi dari Thailand melaporkan berhasil mendeteksi antigen leptospiral dalam plasma dari
hewan eksperimental yang terinfeksi dengan menggunakan sandwich dot-ELISA
menggunakan antibody poliklonal dan monoklonal (Sharma et al., 2008). Namun, sensitivitas
tes ini mungkin tergantung pada kombinasi serovar/serogroup strain Leptospira terinfeksi dan
antisera sekunder: serovar Bataviae menunjukan nilai OD yang lebih rendah dari nilai cut-off
(Fig. 1).

The said drawback may address using genus-specific monoclonal secondary antibody in future
enhancement of the assay. Furthermore, two negative values were given by ELISA who was
already positive by flaB-nested PCR. This could be due to the higher sensitivity of PCR as a
result of DNA amplification. Therefore, signal amplification method of ELISA also needs to
be improved.

Kekurangannya mungkin menggunakan genus antibodi monoklonal sekunder khusus untuk

pemeriksaan masa yang akan datang. Selain itu, dua nilai negatif yang ditunjukkan oleh ELISA
sejalan dengan hasil pemeriksaan flaB nested PCR. Hal ini bisa disebabkan oleh kepekaan lebih
tinggi yang dimiliki oleh PCR sebagai hasi dari amplifikasi DNA. Oleh karena itu, metode
amplifikasi sinyal ELISA juga perlu ditingkatkan.

In conclusion, the outcomes of the diagnostic test evaluation results indicate that, the detection
of leptospiral antigen in the plasma of febrile patients was achieved by a MAb-based direct
ELISA, which offers lower cost than molecular tests. Furthermore, in Sri Lanka all general and
teaching hospitals (70% of total governmental hospitals) are equipped with ELISA reader in
biomedical laboratories. Thus, this assay can be considered as an important diagnostic
approach which can be directly adopted to the national health care network but further need to
be verified using larger sample size in multiple locations either nationally or internationally.

Kesimpulannya, hasil dari evaluasi tes diagnostik menunjukkan bahwa deteksi antigen
leptospiral dalam plasma pasien dengan demam diperoleh dengan ELISA berbasis MAb l, yang
menawarkan biaya yang lebih rendah daripada tes molekuler. Selain itu, di Sri Lanka semua
Rumah Sakit Umum dan Rumah Sakit Pendidikan (70% total rumah sakit swasta) dilengkapi
dengan ELISA reader di laboratorium biomedis. Dengan demikian, tes ini dapat dianggap
sebagai pendekatan diagnostik yang penting yang dapat diadopsi secara langsung ke jaringan
perawatan kesehatan nasional, tetapi lebih lanjut perlu diverifikasi menggunakan ukuran
sampel yang lebih besar di beberapa lokasi baik tingkat nasional maupun internasional
Funding information
This study was funded by grant RG/AF2013/37/M awarded by University of Peradeniya, Sri
Lanka. Source of funding had no in-volvement in the study design or preparation of the article.
Conflict of interest
None.
Acknowledgment
We acknowledge Dr. Nobuo Koizumi attached to the National Institute of Infectious Diseases,
Japan for providing antiserum (serovar Copenhageni) and his valuable comments on the
manuscript, and the staff of the Department of Microbiology, Faculty of Medicine, University
of Peradeniya in Sri Lanka.

Pendanaan informasi studi ini didanai oleh hibah RG/AF2013/37/M diberikan oleh Universitas
Peradeniya, Sri Lanka. Sumber dana telah ada di-volvement dalam rancangan penelitian atau
persiapan artikel. Konflik kepentingan tidak ada. Pengakuan kita mengakui Dr Nobuo Koizumi
terpasang ke Institut Nasional penyakit menular, Jepang untuk menyediakan antiserum
(serovar Copenhageni) dan berharga komentar pada naskah, dan staf Departemen
mikrobiologi, Fakultas Kedokteran, Universitas Peradeniya di Sri Lanka.