BAB III

METODE PENELITIAN
1. Jenis Penelitian
Jenis penelitian ini menggunakan metode eksperimen. Eksperimen merupakan
penelitian yang dimaksudkan untuk mengetahui ada tidaknya akibat dari “sesuatu”
yang dikenakan pada objek yang diselidiki. Dengan kata lain penelitian eksperimen
mencoba meneliti ada tidaknya hubungan sebab akibat (MacLin, 2002). Penelitian
eksperimen dapat dikatakan sebagai metode penelitian yang digunakan untuk mencari
pengaruh perlakuan tertentu terhadap yang lain dalam kondisi yang terkendalikan
(Sugiono, 2010).

2. Alat dan Bahan

A. Alat
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini diantaranya:
1) Cawan Petri
2) Autoklaf
3) Magnetic stirrer
4) Lup inokulasi
5) Spektrofotometer Shimadzu UV-visible 1800
6) SEM Coater Sputter E-1010
7) Jarum Suntik PVDF
8) Rotary Shaker

B. Bahan
Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini diantaranya:

1) CNP
2) Natrium tripolifosfat
3) Aquades
4) Kalium Bromida
5) Luria Bertani Broth
6) Potato Dextrose Agar
7) Jamur fitopatogenik (C. gelosporidies, P. capsici, S. sclerotium, F.
oxysporum, dan G. fujikori)
3. Prosedur Penelitian
Penelitian ini terdiri dari beberapa tahapan atau prosedur penelitian, diantaranya:
a. Persiapan Nanopartikel Chitosan
CNP disiapkan berdasarkan gelasi ionik kitosan (Mw ≈ 190–370 kDa,
deasetilasi pada derajat ≥ 75%) dengan anion natrium tripolifosfat (TPP). CS
dilarutkan pada level 0,1% (w / v) dalam 1% (v / v) asam asetat diikuti dengan
pengadukan semalaman dengan menggunakan magnetic stirrer pada kecepatan
200 rpm dan disaring melalui filter jarum suntik PVDF (ukuran pori 0,22
μm). TPP dilarutkan pada level 0,25% (b / v) dalam suling steril air dan disaring
melalui filter jarum suntik membran PVDF (ukuran pori 0,22 μm). Cross-linking
kitosan dengan TPP pada volume yang sama dilakukan setetes demi setetes di
bawah magnetic stirrer dengan kecepatan 700 rpm. Campuran yang dihasilkan
disentrifugasi selama 10 menit pada 10.000 rpm, dan pelet disuspensikan kembali
dalam air aquades steril diikuti dengan ultra-sonication pada rasio pulsa 28%
selama 100 detik pada 4 ◦ C. Dilakukan ultrasonication sebanyak tiga kali
pengulangan, dan nanoformulasi diendapkan dalam bentuk beku dan kering lalu
disimpan dalam desiccator untuk analisis lebih lanjut.

b. Karakterisasi Partikel Nano

1. Pengukuran Menggunakan UV-Vis dan Dynamic Light Scattering (DLS)
Spektrum UV yang terlihat dianalisis menggunakan spektrofotometer
Shimadzu UV-visible 1800 untuk mengkonfirmasi adanya pembentukan
nanopartikel. Dynamic Light scattering (DLS) digunakan untuk pengukuran
ukuran partikel rata-rata, dan indeks polidispersitas (PDI) pada Zetasizer
partikel berperforma tinggi HPPS-5001 (Malvern, Inggris). Setiap sampel
dianalisis sebanyak tiga kali pada suhu 25oC dengan sudut hamburan 90 ◦ C.
Air murni digunakan sebagai media pendispersi. Hasilnya diberikan sebagai
rata-rata ukuran partikel diperoleh dari analisis tiga kali percobaan yang
berbeda.
2. Analisis Fourier Transform Infrared (FTIR)
Untuk mengkonfirmasi sintesis nanopartikel, analisis Fourier
transform infrared (FTIR) dilakukan. Untuk FTIR, masing-masing sampel
disiapkan dalam kalium bromida (KBr) sebagai pelet di bawah rasio sampel
 1:99ke KBr, dan dianalisis oleh ABB FTLA 2000-100 (ABB Co., Quebec,
Kanada) pada batas resolusi16 cm −1 .

3. Pengamatan Scanning Electron Microscopy (SEM)

Scanning electron microscope (SEM) digunakan untuk mempelajari
morfologi permukaan NP. Sampel dikeringkan dengan pengeringan titik kritis
(CPD, Emitech) dan dipasang pada potongan aluminiumdan kemudian dilapisi
dengan emas menggunakan model Coater Sputter E-1010 (Emitech).
Sampelnya diperiksa menggunakan pemindaian mikroskop elektron model
S 2700 (Hitachi Ltd, Tokyo, Jepang) dengan15 kV tegangan percepatan.

c. Strain Bakteri
1. Strain Bakteri dan Kondisi Pertumbuhan
Untuk mendapatkan aktivitas antibakteri CS dan CNP, satu strain X.
campestris pv. vesikatoria (KACC1154) dan tiga strain E. carotovora subsp.
carotovora (KACC 113114, 113154, dan 133061) yang masing-masing
menyebabkan penyakit bercak daun dan kebusukan pada Solanum
lycopersicum. Strain bakteri dikultur pada media agar nutrisi pada suhu 30o C.
Setelah 48 jam inkubasi, masing-masing suspensi bakteri disiapkan dalam
kaldu Luria – Bertani (LB).
2. Aktivitas Antibakteri
Aktivitas penghambatan CS dan CNP terhadap bakteri Xanthomonas
dan Erwinia yang merupakan bakteri pathogen pada tanaman dievaluasi
dengan mengukur kepadatan optik (OD) 600 nm. Strain Xanthomonas dan
Erwinia ditanam di agar nutrien dan diinkubasi pada suhu 28o C. Koloni yang
representatif diambil danditempatkan dalam plus-LB (pepton 10 g, bubuk
ekstrak ragi 5 g, NaCl 5 g, air suling hingga 1000 mL, glukosa 1 g, pH 7,2)
dan diinkubasi semalaman di rotary shaker pada kecepatan 180 rpm, 30o C.
Konsentrasi berbeda (0,5, 1,0, dan 5,0 mg / mL, (b / v)) dari CS dan CNP
ditambahkan ke suspensi kultur bakteri dan kemudian campuran dan
diinkubasi pada suhu 30o C pada rotary shaker dengan kecepatan 180 rpm
selama 48 jam sementara volume yang sama dari aquades steril ditambahkan
ke kontrol. Absorbansi sampel diukur pada panjang gelombang 600 nm.
d. Strain Jamur
1. Strain Jamur dan Kondisi Pertumbuhan
Sifat antijamur CS dan CNP terhadap jamur fitopatogenik yaitu C.
gelosporidies, P. capsici, S. sclerotium, F. oxysporum, dan G. fujikori
dianalisis pada berbagai konsentrasi CS dan CNP mulai dari 0,1 hingga 5,0 mg
/ mL. Media Potato dextrose agar (PDA) disiapkan dan dituangkan dalam
cawan petri dengan persentase CS dan CNP yang disebutkan di atas, secara
terpisah.
2. Aktivitas Antijamur
Uji antijamur dari CS dilakukan untuk menentukan pertumbuhan radial
jamur. Untuk penentuan pertumbuhan radial, larutan CS dan CNP steril
ditambahkan ke PDA pada konsentrasi 0,1, 0,5, 1,0, 3,0, dan 5,0 mg / mL, (b /
v). Agar miselia dari perifer yang masih tumbuh aktif dan sudah berumur 7
hari diambil dari kultur patogen dengan ujung ukuran seragam (diameter, 5,0
mm) dan diinokulasi di tengah plate yang berisikan CS dan CNP yang
berbeda. Semua cawan Petri diinkubasi pada suhu 28oC selama 10 hari, dan
pengamatan pertumbuhan miselia radial diamati ketika pertumbuhan pada
cawan petri sudah penuh. Cawan berisi S. sclerotiorum diinkubasi selama 5
hari, karena pertumbuhannya yang cepat. Semua treatment terdiri dari tiga kali
ulangan. Plate yang diinokulasi dibandingkan dengan kontrol (tanpa CS dan
CNP) untuk menghitung persentase tingkat penghambatan miselia patogen.
Persentase hambatan pertumbuhan dihitung relatif terhadap kontrol
menggunakan rumus berikut:
% Tingkat penghambatan = (Mc - Mt) Mc × 100
di mana Mc adalah pertumbuhan miselia dalam kontrol, Mt adalah
pertumbuhan miselia yang diberi treatment.

e. Analisis Data
Semua percobaan dilakukan sebanyak tiga kali percobaan dan hasilnya dirata-
ratakan dan disusun dalam bentuk tabel sebagai standar deviasi (SD). Data
dianalisis dengan analisis varians (ANOVA). Dilakukan uji-t dan jika nilai
probabilitas p <0,05 dianggap signifikan.