DETERMINATION OF NIFEDIPIN IN HUMAN PLASMA AND ITS USE IN

BIOEQUIVALENCE STUDY

Disusun untuk memenuhi salah satu tugas mata kuliah praktikum Biofarmasetika

Dosen Pengampu : Ayu Shabrina., M. Farm

Disusun Oleh :
Kelas A Golongan 2
Herlina Andriani (165010061)

LABORATORIUM KIMIA FARMASI

FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS WAHID HASYIM
SEMARANG
2018
A. Latar Belakang
Nifedipin merupakan obat golongan calcium channel blocker (CCB) yang
digunakan untuk pengobatan antihipertensi dan angina. Bioavailabilitasnya sangat rendah
dan secara termal tidak stabil. Karena sifat farmakkinetik dan karakteristik dari nifedipin
tidak begitu baik maka untuk menentukan kadar nifedipin didalam plasma menjadi sulit.
Metode untuk menentukan kadar nifedipin yang pernah dilakukan yaitu : kromatografi gas,
metode voltametri, HPLC, deteksi elektro kimia, dan LC-MS-MS tetapi belum pernah ada
yang melakukan LC-MS.
B. Tujuan Penelitian
1. Mengetahui dan mempelajari evaluasi bioequivalen
2. Mengetahui dan mempelajari metode validasi LC/MS yang belum pernah dilakukan
C. Alat dan Bahan
Alat
1. Kromatografi cair 10ADvp
2. Spektrometri massa 2010EV instrumen quadrupole tunggal
3. Komputer dilengkapi LC – MS Solution 3.0
Bahan
1. Nifedipin (kemurnian > 99%)
2. Dimethoxanate (kemurnian 99%)
3. Metanol
4. Air suling
5. Pelarut n-heksana-diklorometana (3: 2), eter-nheksana asetat (3: 2) dan dietil eter
6. Agen alkalis (NaOH 1M)
7. Fase gerak : methanol-H2O (66:34 v/v)
8. Fase diam : kolom C18
D. Cara Kerja
1. Optimasi Ekstraksi
Ekstraksi cair-cair diambil untuk isolasi nifedipin dari plasma. Pelarut n-heksana-
diklorometana, eter-nheksana asetat dan dietil eter setelah dicek ada signifikan dalam
efisien ekstraksi. Dietil eter yang sudah digunakan akan diuapkan sampai kering. Agen
alkalis (NaOH) dievaluasi seberapa banyak adanya zat endogen
2. Persiapan standar dan kualitas kalibrasi sampel control
Larutan stok nifedipin (10µg/ml) dan larutan standar dimethoxanate 100µg/ml)
kedalam methanol disiapkan. Keduanya disimpan dalam ruang gelap dan dalam botol
gelap pada suhu 20◦C
Seri konsentrasi nifedipin (1000, 750, 500, 250, 100, 20, 10 ng/ml) dalam methanol
disiapkan. Semua larutan nifedipine dari berbagai konsetrasi disimpan suhu 4◦C
terlindung dari cahaya selama 2 minggu.
Sampel standar kalibrasi yang baru disiapkan dalam 1ml plasma kosong dengan
penambahan 100µL larutan nifedipin kalibrasi dan 100µL standar internal yang
digunakan untuk menghasilkan serangkaian standar sebagai kurva kalibrasi dengan
konsentrasi masing-masing 1, 2, 10, 25, 50 dan 100 ng/ml nifedipine dan 2 ng/ml
standar internal. Qualitas control sampel disiapkan dengan konsentrasi rendah
(2ng/ml), sedang (25ng/ml) dan tinggi (75ng/ml) dengan cara yang sama seperti sampel
plasma untuk kalibrasi.
3. Penyiapan sampel
Sampel darah dikumpulkan dalam tabung yang mengandung heparin. Sentrifugasi pada
3000g selama 10 menit, plasma yang terpisah dikumpulkan dan disimpan dalam
keadaan terang pada suhu −20◦C. Sebelum analisis, sampel plasma dicairkan pada
18◦C.
100µl larutan standar internal ditambahkan untuk 1 ml sampel plasma, tetapi tidak
untuk sampel plasma kosong. Sampel kemudian dinetralkan dengan penambahan
100µl dari 1M Larutan NaOH, dan ekstraksi cair-cair menggunakan
4 ml dietil eter sebagai pelarut ekstraksi. Setelah itu, divortex
selama 2 menit, supernatan 10ml dipindahkan ke tabung sentrifugasi lainnya
dan diuapkan sampai kering di bawah aliran nitrogen 32◦C. Residu dilarutkan dalam
100µl metanol, kemudian divortex selama 1 menit, dipindahkan ke 0,2ml tabung
ependrof dan disentrifugasi pada 12.000g selama 5 menit, volume 20µl disuntikkan ke
kolom. Semua percobaan dilakukan di bawah lampu merah lemah.
4. Metode Validasi LC/MS
Setelah pemisahan dengan LC, nifedipine dan dimethoxanate pertama kali diuji coba
secara langsung dalam spektrometri massa menggunakan ionisasi APCI. Spektrometer
 massa diatur untuk menghasilkan dan memilih ion pseudomolekul terprotonasi [M +
H] + (pada m/z 347,0 untuk nifedipine, m/z 359,15 untuk dimethoxanate) sebagai ion
target (m/z) sebagai kuantifikasi dalam mode SIM.
Pengujian spesifisitas dievaluasi dengan membandingkan sampel plasma kosong dari
enam sukarelawan sehat dan tidak mengambil sampel plasma nifedipine dan sampel
plasma kosong yang dibubuhi nifedipine dan dimethoxanate. Prosedur efisiensi
ekstraksi diamati pada konsentrasi rendah (2ng/ml), sedang (25ng/ml) dan tinggi
(75ng/ml). Pemulihan dihitung dengan membandingkan luas puncak masing-masing
kromatogram dari sampel yang diekstraksi relatif terhadap standar yang tidak diproses
mengandung jumlah yang setara dari senyawa dalam metanol. Stabilitas nifedipine
dalam sampel plasma diselidiki melalui tiga siklus freeze-thaw menggunakan sampel
Qualitas Control. Stabilitas analit dalam plasma dan sampel diselidiki pada suhu dan
waktu yang berbeda. Selama studi stabilitas, dua kurva kalibrasi standar disiapkan pada
setiap batch analitis.
5. Studi Bioequivalen
Penelitian ini terbuka, acak, dua kelompok dengan waktu 8 hari. Periode pertama,
relawan dari grup A menerima dosis 20mg tunggal tablet nifedipin dari DiSha,
sementara relawan dari grup B menerima dosis 20mg tunggal tablet nifedipine dari
GuoFeng. Selama periode kedua, diulangi langkah pertama secara terbalik. Tablet
diberikan dipagi hari, dengan 250ml air. Relawan menerima makan siang dan makan
malam, masing-masing 4 dan 10 jam setelah obatdiberikan. Relawan tidak minum
alcohol, kopi atau minuman yang mengandung xanthine lainnya selama penelitian.
Selanjutnya, mereka tidak minum obat lain, 2 minggu sebelum penelitian.
Sampel darah dikumpulkan pada waktu 0 sebelum diberikan obat dan pada wakttu 0,5
, 1, 1,5 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 8 , 10 , 12 , 15 , 24 , 36 jam setelah dosis. Sampel disentrifugasi
dan plasma disimpan pada -20◦C.
E. Hasil Penelitian
1. Metode Validasi Bio-Analisis
Gambar 1.Spektrum massa nifedipine dan dimethoxanate menggambarkan ion puncak: (a)
Nifedipine m/z 347.0 dan (b) dimethoxanate m/z 359.15 masing-masing sebagai ion
molekul nifedipin dan dimethoxanate yang terprotonasi. Hal ini menunjukkan spektrum
massa mengalami pemindaian nifedipine dan dimethoxanate. Typical total ions
chromatograms (TICs) dari plasma kosong, plasma kosong yang diberi nifedipine
(25ng/ml) dan dimethoxanate (2µg/ml), dan sampel plasma diperoleh 4 jam setelah dosis
oral tunggal 20 mg tablet nifedipine dari sukarelawan yang sehat.
2. Evaluasi Bioequivalensi
Gambar 2. Representatif TICs dari plasma kosong (a) plasma yang diberi dimethoxanate
2µg/ml dan nifedipin 25ng/ml. (b) sampel plasma 4 jam setelah dosis oral tunggal 20mg
tablet nifedipine lepas lambat (uji preparat). (c) puncak 1 dimethoxanate; puncak 2
nifedipin

Gambar 3. Rata-rata (±S.D.) konsentrasi-waktu plasma nifedipine setelah pemberian oral

tunggal tablet nifedipine 20 mg berkelanjutan-rilis dari dua perusahaan ke 20 subjek
sukarelawan pria sehat.
Gambar 4. Profil konsentrasi-waktu plasma setelah dosis oral tunggal 20mg uji produk referensi
(a) atau (b) untuk 20 subjek pria sehat.
F. Pembahasan
Metode analitik yang dikembangkan untuk kuantifikasi nifedipine dalam sampel
plasma menunjukkan spesifisitas, sensitivitas, linieritas, presisi, dan akurasi yang bagus
 pada seluruh rentang konsentrasi plasma yang signifikan secara klinis dan dapat dicapai
secara terapi, memungkinkan penggunaannya dalam uji bioekivalensi.
Metode analitik menunjukkan beberapa keunggulan dibandingkan metode lain
yang pernah dipublikasi. Metode yang diusulkan oleh Dai dkk. (2001) tidak cocok untuk
analisis nifedipine karena kondisi termal tidak stabil.
Ekstraksi cair-cair menggunakan dietil eter sebagai ekstraksi pelarut lebih
ekonomis Ekstraksi cair-cair menggunakan campuran pelarut n-hexane dan diklorometana
atau dari eter asetat dan n-heksana, tetapi butuh waktu lebih banyak untuk menguapkan
supernatan hingga kering, yang berisiko untuk nifedipine karena kondisi termal tidak stabil.
Selain itu, metode HPLC yang dikembangkan oleh penulis jurnal membutuhkan 15 menit
untuk setiap analisis kromatografi. Tetapi metode dalam jurnal membutuhkan paling
banyak 8 menit.
Analisis varians mengungkapkan tidak adanya jangka waktu dan efek produk tetapi
keberadaan efek kelompok menunjukkan hamparan profil konsentrasi-waktu plasma
individu setelah dosis oral tunggal 20mg atau uji produk referensi untuk dua puluh subjek
pria sehat. Perbedaan individu yang menonjol ditampilkan, yang menunjukkan bahwa
tablet nifedipine rilis berkelanjutan harus diberikan dengan resep dokter.
Data ditunjukkan oleh Dai dkk. (2001) mengungkapkan pemberian tablet oral dosis
tunggal (30mg), hasil yang didapatkan Cmax, AUC0-∞ dan Tmax adalah 39,38 ± 17,09
ng/ml, 722,59 ± 622,88 ng jam/ml dan 7,00 ± 5,26 jam, penelitian pada jurnal karena
adanya perbedaan dosis. Perbedaan tersebut dapat disebabkan oleh produsen yang berbeda,
berbagai mekanisme pelepasan obat atau eksipien, dan subjek yang berbeda.
Menurut jurnal penelitian, kekuatan uji statistik adalah 95,4% untuk Cmax ; 104,2%
AUC0-t ; 103,3% AUC0–∞ ; dan kepercayaan 90% ; rasio Cmax (86,6-105,2%) ; AUC0–t
(97,8-110,9%) ; AUC0–∞ (96,5-110,4%) ; produk uji dan referensi berada dalam interval
(80,0–125,0% AUC, dan 70–143% Cmax), diusulkan oleh SFDA (2005) ). Hal ini dapat
disimpulkan bahwa uji persiapan tablet nifedipine dari DiSha (Weihai, Cina), dan
persiapan referensi tablet nifedipine dari GuoFeng (Qingdao, China), bersifat bioekivalen
dan, dengan demikian dapat digunakan secara bergantian, tetapi perlu dengan saran dokter
untuk efek kelompok.
G. Kekurangan Penelitian dan Saran
Penulis tidak melakukan uji pada wanita sehat
Bahasa pada jurnal terlalu rumit