BAB III

METODE PENELITIAN

A. Waktu dan Tempat

a. Waktu
- Sterilisasi alat 6 September 2019
- Penimbangan bahan dan Pembuatan media pengencer 13 September
2019
- Koleksi semen , pengenceran dan pengamatan 20-21 September
2019
b. Tempat
- Sterilisasi alat, penimbangan bahan dan pembuatan media pengencer
Lab. Mikrobiologi Biologi Unesa
- Koleksi semen, pengenceran perlakuan A1, dan pengamatan
Teaching Farm FKH Unair, Gresik
- Perlakuan A1 dan pengamatan motilitas dan viabilitas
Lab. Biologi Dasar Biologi Unesa
B. Alat dan bahan

No Alat Bahan
1 Gelas Obyek Semen segar dari jenis hewan tertentu
2 Gelas penutup Alcohol 70 %
3 Tabung sentrifus plastic Kapas
4 Aluminium foil Air kelapa
5 Pipet steril Asam sitrat
6 Stik gelas Glukosa
7 Mikropipet ukuran Fruktosa
8 Mikrotip Penisilin-streptomisisin
9 Hemositometer Kuning telur segar
10 Cawan petri Deionize water/air untuk infus
11 Rak tabung reaksi Pewarna eosin negrosin
12 Water bath
13 Hand counter
14 Mikroskop cahaya
15 Pembakar Bunsen
16 Gelas beker ukuran 50,100, 250 ml
17 Kertas saring
18 Syringe / jarum suntik ukuran 5 , 10ml

C. Prosedur Pelaksanaan Praktikum

1. Sterilisasi peralatan
- Bersihkan semua peralatan dari bahan-bahan yang menempel dengan
menggunakan air mengalir
- Rendamlah semua peralatan dengan sabun tidak berbau ( teepol) semalam
 - Gosok dan bilas dengan air mengalir sebanyak 5x
- Rebus dengan air panas selama 5 menit
- Bilas dengan air DO/ aquadessteril sebanyak 2x
- Keringkan
- Lakukan sterilisasi kering untuk peralatan dari gelas dengan oven
- Lakukan sterilisasi basah atau di UV untuk peralatan dari plastic
2. Pembuatan pengencer dasar Air kelapa
- Saringlah air kelapa sebanyak 500 ml dengan menggunakan kertas saring
- Bagi air kelapa tersebut menjadi dua
- Berilah 250 ml air kelapa dengan pinisilin-streptomisin
- Simpanlah pengencer dasar air kelapa dalam lemari es
3. Suplementasi kuning telur
- Keluarkan pengencer dasar air kelapa dari lemari es, biarkan dalam suhu ruang
supaya suhunya naik dn mudah untuk dicampur kuning telur
- Ambil telur yang masih baru , bersihkan kotoran yang menempel pada cangkang
dengan sabun dan air mengalir
- Sterilisasi telur dengan cara disemprot dengan menggunakan alcohol 70%
- Pecahkan telur pada bagian tengah dengan menggunakan pisau atau pinset
- Ambil bagian kuning telurnya saja, usahakan utuh tidak pecah, gulingkan pada
kertas saring untuk menghilangkan sisa putih telur
- Masukkan kuning telur pada cawan petri steril
- Ambil kuning telur dengan cara disedot menggunakan jarum suntik
- Ambil pengencer dasar air kelapa sebanyak 80 ml dengan menggunakan syringe,
masukkan dalam tabung reaksi steril
- Tambahkan kuning telur sebanyak 20 ml, homogenkan dengan cara dikocok-
kocok,
- Simpan dalam lemari es selama 3 hari, ambil bagian supernatant untuk pengencer

4. Proses pengenceran semen

- Siapkan tabung reaksi steril yang sudah dibungkus dengan aluminium foil
- Ambil semen segar dengan menggunakan vagina buatan pada sapi jantan untuk
mengeluarkan semen, simpan dalam tabung reaksi plastic steril alam keadaan
hangat ( suhu 37oC
- Hitung segera konsentrasi spermatozoa dengan menggunakan hemocitometer
- Lakukan pengamatan motilitas spermatozoa dengan semen segar
- Lakukan proses pegenceran dengan menggunakan prinsip V1M1 = V2M2
- Dalam proses pengenceran, terlebih dahulu ambil semen segar menggunakan
mikropipet sesuai ukuran hasil hitungan, kemudian tambahkan pengencer sesuai
dengan hasil hitungan, lakuka pengenceran pada suhu hangat
- Tentukan konsentrasi spermatozoa sebesar 25 x 106 setelah dilakukan pengenceran

5. Pengamatan motilitas spermatozoa

 - Lakukan pengambilan spermatozoa dengan menggunakn stik gelas dengan
terlebih dahulu diaduk-aduk agar spermatozoa dapat terbawa
- Teteskan semen pada gelas obyek
- Panaskan sebentar dengancara dilewat-lewatkan di atas Bunsen
- Amati motilitas spermatozoa dibawah mikroskop

6. Pengamatan viabilitas spermatozoa

- Lakukan pengambilan semen dengan menggunakan stik gelas
- Teteskan pada gelas obyek
- Ambil pewarna eosin-negrosin, teteskan pada gelas obyek yang sama dengan
semen
- Ambil gelas obyek yang lain
- Campurkan semen dengan pewarna eosin negrosin dengan salah satu ujung gelas
obyek
- Buat hapusan antara eosin negrosin dengan menggunakan ujung gelas obyek
- Amati di bawah mikroskop viabilitas spermatozoa yang ditandai dengan
spermatozoa yang masih hidup tidak berwarna, spermatozoa yang sudah mati
berwarna biru keunguan
 Peralatan

- dibersihkan semua peralatan dari bahan-bahan yang menempel

dengan menggunakan air mengalir
- direndamlah semua peralatan dengan sabun tidak berbau ( teepol)
semalam
- digosok dan bilas dengan air mengalir sebanyak 5x
- direbus dengan air panas selama 5 menit
- dibilas dengan air DO/ aquadessteril sebanyak 2x
- dikeringkan
- dilakukan sterilisasi kering untuk peralatan dari gelas dengan oven
- dilakukan sterilisasi basah atau di UV untuk peralatan dari plastic

Peralatan steril

Air kelapa

- Disaring air kelapa sebanyak 500 ml dengan menggunakan kertas

saring
- Dibagi air kelapa tersebut menjadi dua
- diberi 250 ml air kelapa dengan pinisilin-streptomisin
- disimpan pengencer dasar air kelapa dalam lemari es

Pengencer Air kelapa

 kuning telur

- dikeluarkan pengencer dasar air kelapa dari lemari es, biarkan dalam suhu ruang
supaya suhunya naik dn mudah untuk dicampur kuning telur
- diambil telur yang masih baru , bersihkan kotoran yang menempel pada cangkang
dengan sabun dan air mengalir
- disterilisasi telur dengan cara disemprot dengan menggunakan alcohol 70%
- dipecahkan telur pada bagian tengah dengan menggunakan pisau atau pinset
- diambil bagian kuning telurnya saja, usahakan utuh tidak pecah, gulingkan pada
kertas saring untuk menghilangkan sisa putih telur
- dimasukkan kuning telur pada cawan petri steril
- diambil kuning telur dengan cara disedot menggunakan jarum suntik
- diambil pengencer dasar air kelapa sebanyak 80 ml dengan menggunakan syringe,
masukkan dalam tabung reaksi steril
- ditambahkan kuning telur sebanyak 20 ml, homogenkan dengan cara dikocok-kocok,
- disimpan dalam lemari es selama 3 hari, ambil bagian supernatant untuk pengencer

Pengencer air kelapa + Suplemen

kuning telur

Semen

- disiapkan tabung reaksi steril yang sudah dibungkus dengan aluminium foil
- diambil semen segar dengan menggunakan vagina buatan pada sapi jantan untuk
mengeluarkan semen, simpan dalam tabung reaksi plastic steril alam keadaan hangat (
suhu 37oC
- dihitung segera konsentrasi spermatozoa dengan menggunakan hemocitometer
- dilakukan pengamatan motilitas spermatozoa dengan semen segar
- dilakukan proses pegenceran dengan menggunakan prinsip V1M1 = V2M2
- Dalam proses pengenceran, terlebih dahulu diambil semen segar menggunakan
mikropipet sesuai ukuran hasil hitungan, kemudian tambahkan pengencer sesuai
dengan hasil hitungan, lakuka pengenceran pada suhu hangat
- ditentukan konsentrasi spermatozoa sebesar 25 x 106 setelah dilakukan pengenceran

Kualitas awal Semen

perlakuan A1
 Spermatozoa

- dilakukan pengambilan spermatozoa dengan menggunakn stik gelas dengan terlebih

dahulu diaduk-aduk agar spermatozoa dapat terbawa
- diteteskan semen pada gelas obyek
- dipanaskan sebentar dengancara dilewat-lewatkan di atas Bunsen
- diamati motilitas spermatozoa dibawah mikroskop

Data motilitas Spermatozoa

Spermatozoa

- Di;lakukan pengambilan semen dengan menggunakan stik gelas

- diteteskan pada gelas obyek
- diambil pewarna eosin-negrosin, teteskan pada gelas obyek yang sama dengan semen
- diambil gelas obyek yang lain
- dicampurkan semen dengan pewarna eosin negrosin dengan salah satu ujung gelas
obyek
- dibuat hapusan antara eosin negrosin dengan menggunakan ujung gelas obyek
- diamati di bawah mikroskop viabilitas spermatozoa yang ditandai dengan
spermatozoa yang masih hidup tidak berwarna, spermatozoa yang sudah mati
berwarna biru keunguan

Data viabilitas Spermatozoa