PEMBAHASAN

Pada praktikum kali ini dilakukan percobaan pemeriksaan kadar kolesterol

total. Praktikum ini bertujuan untuk menentukan kadar kolesterol total dalam sampel
serta memahami metode penentuan kadar kolesterol total. Pemeriksaan kadar asam urat
sangat penting dilakukan untuk penegakan diagnosa suatu penyakit sehingga terapi
dapat dilakukan dengan tepat.
Metode yang digunakan dalam penetapan kadar kolesterol total kali ini adalah
metode enzimatik yang prinsipnya berdasarkan pada reaksi hidrolisis enzimatik dan
oksidasi. Rekasi indikasi dilakukan terhadap hidrogen peroksida yang direaksikan
dengan 4-minoantipirin dan fenol menghasilkan senyawa berwarna quinoneimina
(Maboach, et.al., 2014). Metode enzimatik ini dipilih karena lebih spesifik dan
memiliki proses yang cepat dikarenakan adanya katalis, walaupun prosedurnya dan
bahan yang dibutuhkan lebih banyak dibandingkan metode yang lainnya (Herliana,
2013).
Dalam percobaan pengukuran kadar kolesterol total dalam darah ini dibuat
larutan standar sebagai pembanding terhadap larutan uji, serta dibuat larutan blangko.
Semua larutan diberikan perlakuan yang sama, hanya saja isi larutan yang terdapat di
dalamnya berbeda. Blangko berisi reagen dan aquadest, larutan standar berisi reagen
dan larutan standar, dan larutan uji berisi reagen dan serum darah. Larutan reagen
merupakan campuran dari beberapa enzim (4-aminoantipirin, koleterol esterase,
kolesterol oksidase, hidrogen peroksidase, fenol dan pipes) yang dapat
mengubahkolesterol menjadi suatu senyawa berwarna sehingga dapat dideteksi
olehspektrofotometri UV-Vis. Sampel atau specimen yang digunakan adalah bagian
serum dari darah, hal ini dilakukan agar pengukuran lebih teliti karena dalam serum
sudah tidak mengandung banyak senyawa dan tidak mengandung faktor pembekuan
darah (Oktari & Silvia, 2016) sehingga tidak akan mengganggu hasil percobaan.
Semua larutan yang telah dicampur diamkan selama 10 menit pada suhu kamar,
hal ini bertujuan agar enzim-enzim yang digunakan dalam reaksi dapat bekerja secara
optimal seperti berada pada kondisi dalam tubuh. Enzim akan bekerja pada suhu
optimumnya, jika suhu yang digunakan lebih rendah yaitu suhu kamar maka waktu
yang diperlukan untuk mencapai kondisi optimum kerja enzim akan lebih lama.
Sedangkan jika suhu yang digunakan terlalu tinggi maka enzim akan mengalami
kerusakan (Gandjar dan Rohman, 2007).
Selain itu proses inkubasi atau pendiaman ini bertujuan memberikan waktu
untuk terjadinya reaksi antara kedua larutan dalam campuran tersebut. Saat proses
inkubasi, terjadi reaksi antara reagen dengan kolesterol yang terdapat pada larutan
standar dan larutan uji. Setelah diinkubasi, kedua larutan yang tadinya berwarna bening
dalam masing-masing kuvet berubah menjadi warna merah muda. Warna ini
menandakan telah terjadinya reaksi antara enzim dengan kolesterol. Warna
merahtersebut berasal dari senyawa quinoneimine, yang merupakan hasil reaksiantara
reagen dan kolesterol. Reaksi yang terjadi sebagai berikut:
Kolesterol esterase
Kolesterol ester + H2O Kolesterol + asam lemak
Kolesterol oksidase
Kolesterol + O2 Kolesterol-3-one + H2O2
Peroksidase
2H2O2 + 4-aminoantipirin + fenol Quinoneimina + 4H2O
Perubahan warna (menjadi berwarna merah) diperlukan agar campuran larutan
dapat diukur absorbansinya dengan menggunakan spektrofotometer UV-Vis,
khususnya dengan sinar visibel. Spektrofometri UV-Vis pada prinsipnya mengacu
pada hukum Lambert-Beer. Apabila cahaya monokromatik masuk melalui suatu media,
maka sebagian cahaya tersebut akan diserap dan sebagian akan dipantulkan serta
sebagiannya lagi akan dipancarkan (Harvey, 2010).
Senyawa dapat dianalisis dengan metode spektrofotometri UV-Vis jika
memiliki kemampuan menyerap pada daerah UV atau sinar tampak. Senyawa yang
dapat menyerap intensitas pada daerah UV-Vis disebut kromofor. quinoneimine
memiliki gugus kromofor pada strukturnya yakni pada benzenenya seperti tampak pada
gambar berikut,
 Gugus Kromofor

Gambar 6.1. struktur quinoneimina

Sehingga dengan adanya gugus kromofor ini quinoneimina mampu dianalisis
menggunakan spektrofotometri, selain itu untuk melakukan analisis senyawa dalam
sinar tampak, senyawa harus memiliki warna, larutan uji dan standar yang dihasilkan
memiliki warna dari regensia 4-Aminoantipirin, 4-Aminoantipirin ini merupakan
kromogen (zat pemberi warna pada larutan). Absorbansi larutan uji dan standar
terhadap blangko regensia dilakukan pada 𝜆 546 nm karena quinoneimine memiliki 𝜆
504 nm dan 4-Aminoantipirin memiliki 𝜆 500 nm dimana termasuk kedalam rentang
sinar tampak 400-780 nm.
Quinoneimine menghasilkan warna merah muda, yang intensitas warna yang
terbentuk akan terukur absorbansinya pada panjang gelombang 546 nm dan nilai
absorbansi tersebut akan sebanding dengan konsentrasi kolesterol total dalam sampel.
Penggunaan blangko bertujuan untuk koreksi serapan yang disebabkan pelarut
pereaksi, sel ataupun pengaturan alat dan penghilangan pengaruh pelarut oleh zat yang
bukan analit (larutan yang dianalisis), sehingga hasil yang didapat adalah hasil yang
sebenarnya (Laksi, 2000). Sementara pengukuran standar dilakukan untuk
membandingkan hasil supaya yang terukur benar-benar senyawa yang dianalisis.
Gandjar dan Rohman, (2007), Kimia Farmasi Analisis, Pustaka Pelajar, Yogyakarta.
Harvey, David, (2010), Modern Analytical Chemistry, Mc Graw-Hill Group, Nw York.
Herliana, E. (2013). Penyakit kolesterol Kandas Berkat Herbal, Agromedia, Jakarta.
Laksi, M. (2000). Kimia Analitik Dasar, Grafindo Media Utama, Bandung.
Maboach, S.J., et.al. (2014). Perbandingan Kadar Asam Urat dengan Metode
Spektrofotometri dan Metode Electrode Based Biosensor.
Oktari, A., dan Silvia, N.D. (2016). Pemeriksaan Golongan Darah Sistem ABO Metode
Slide dengan Reagen Serum Golongan Darah A,B,O, Teknolabjournal, Vol. 5,
No. 2.