Introducción
La terapia celular proporciona un enfoque novedoso para curar una serie de enfermedades [1], [2]. La
terapia celular tiene como objetivo restaurar los tejidos u órganos lesionados mediante la sustitución de
células perdidas o disfuncionales con células funcionales para restablecer sus funciones normales [3]. Las
células madre mesenquimales (CMM) son células estromales multipotentes que son capaces de auto-
renovación y diferenciación en linajes de tejidos mesenquimales, incluyendo estroma de hueso, cartílago,
grasa, tendón, músculo y médula ósea [4]. Se ha demostrado que varias poblaciones de MSC posnatales
multipotentes expresan marcadores asociados a la pluripotencia, como Nanog, que son esenciales para el
mantenimiento de la auto renovación y la diferenciación en las MSC [2].
En general, las células funcionales para terapia se recolectan de células somáticas derivadas de donantes o
células madre. Por lo general, el proceso de recolección de células madre adultas derivadas de donantes,
como las células madre derivadas de tejido adiposo o las células madre derivadas de médula ósea,
requiere la inserción de una aguja o una biopsia, que es altamente invasiva. Por lo tanto, es necesario
buscar una fuente disponible de células madre adultas. Sorprendentemente, la orina, que puede adquirirse
fácilmente de forma no invasiva, ha sido considerada como una fuente ideal novedosa de células madre
adultas para terapias regenerativas personalizadas [5], [6], [7], [8], [9], [10] . Estudios anteriores han
indicado que las células madre derivadas de la orina (USCs) poseen características de las células madre,
incluida la capacidad de adherencia plástica, la clonogenicidad y los potenciales de multidiferenciación
[11].
Sin embargo, se han publicado pocos manuscritos para describir los tipos de células específicas en la
orina humana. Además, los protocolos de cultivo estándar de las USC no han sido bien documentados.
Aquí, informamos que al menos dos subpoblaciones celulares en términos de diferentes morfologías
celulares están presentes en la orina humana, incluidas las células de tipo fibroblasto y las células de tipo
epitelial. Además, los ensayos de caracterización indicaron que las células CXCR4 y Nanog positivas
recolectadas poseían un potencial de multidiferenciación después de la expansión selectiva de colonias de
células similares a fibroblastos utilizando el método del cilindro de clonación.
materiales y métodos
Recolección de muestras de orina humana.
Las muestras de orina se obtuvieron de donantes adultos sanos (rangos de edad de 25 a 40 años, n = 5). El
proceso de recolección fue aprobado por el Comité de Ética e Investigación Clínica de la Universidad
China de Hong Kong o la Universidad de Medicina China de Guangzhou. Los procedimientos
experimentales para muestras de orina y células derivadas de orina se llevaron a cabo de acuerdo con las
directrices aprobadas. Todas las células utilizadas en este estudio se recolectaron con el consentimiento
informado de los donantes para su uso en investigación científica.
Cultivo de células madre derivadas de orina humana
Las muestras de orina (300 ml de cada donante) se centrifugaron a 300 g durante 10 minutos y luego se
lavaron con solución salina tamponada con fosfato (PBS). Las células recolectadas se resuspendieron en
medios de cultivo completos que contenían medio esencial mínimo α (MEMEM-AA; Gibco / Invitrogen,
Thermo Fisher Scientific, EE. UU.) Suplementado con suero bovino fetal al 10% (Gibco, EE. UU.) Y
penicilina / estreptomicina / neomicina al 1%. . La suspensión celular se sembró en placas de 6 pocillos a
una densidad de 0,3 x 105 células / cm2 y luego se incubó en una atmósfera humidificada de 5% de CO2
a 37 ° C. El medio de cultivo se renovó cada 3 días. Una vez que las células cultivadas primarias
alcanzaron una confluencia de aproximadamente el 60%, las células con forma de huso (USC) se pasaron
selectivamente utilizando un cilindro de clonación (Corning, EE. UU.).
Diferenciación osteogénica
Las células se sembraron y se cultivaron hasta que se alcanzó una confluencia de aproximadamente el
80%. El medio se reemplazó por un medio de inducción osteogénico que contenía dexametasona 100 nM,
β-glicerofosfato 10 mM y ácido l-ascórbico-2-fosfato 0,05 mM. Las células expuestas a medios de cultivo
completos sirvieron como grupos de control. Después de 2 semanas de inducción, se aplicó la tinción con
rojo de alizarina para evaluar la mineralización. La capa de células / matriz se tiñó con Alizarin Red S al
0,5% (pH 4,1) durante 5 min. La tinción positiva fue vista bajo un microscopio.
Diferenciación condrogénica
Las partes alícuotas que contenían 3 x 105 células se centrifugaron en tubos de polipropileno para formar
una micromasa granulada. Las células sedimentadas se incubaron en un medio de inducción condrogénico
químicamente definido que consiste en α-MEM complementado con 10 ng / mL de factor de crecimiento
transformante humano recombinante β1 (TGF-β1), dexametasona 100 mM, piruvato de sodio 1 mM,
ácido ascórbico 2 mM -fosfato (Sigma-Aldrich, EE. UU.) y Premezcla de ITS + (BD Biosciences, San
José, CA, EE. UU.). Las células cultivadas en un medio basado en α-MEM sirvieron como control
negativo. El medio se cambió cada 3 días. El proceso de inducción duró 3 semanas. Se aplicó Safranin O:
tinción verde rápida, y los resultados de la tinción se observaron en un microscopio de contraste de fase
(Leica Microsystems Wetzlar Gesellschaft mit beschrankter Haftung, Wetzlar, Alemania).
Inmunocitoquimica
Las células se sembraron en portaobjetos en una placa de 12 pocillos (3000 células por pocillo). Las
células se incubaron en medios de cultivo completos α-MEM durante 24 h. Las células se fijaron con
paraformaldehído al 4% durante 30 minutos después del lavado con PBS. Luego, las células se
bloquearon con PBS que contenía albúmina de suero bovino al 1% (BSA; Sigma-Aldrich, EE. UU.)
Durante 30 min a 37 ° C, seguido de permeabilización con Triton X-100 al 0,5% (Sigma-Aldrich, EE.
UU.). Los anticuerpos anti-CXCR4 (1: 300; R&D Systems, EE. UU.) Y anti-Nanog (1: 300; BD
Biosciences, EE. UU.) Se agregaron por separado y se incubaron a 4 ° C durante la noche. Los
anticuerpos secundarios conjugados con Alexa Fluor 488 (Life Technologies, EE. UU.) Se incubaron con
las células a 37 ° C durante 40 min. Las células se sellaron utilizando glicerina que contenía DAPI (4, 6-
diamidino-2-fenilindol; Life Technologies, EE. UU.) Después del lavado con PBS y luego se observaron
bajo un microscopio confocal.
Citometría de flujo
Las células derivadas de la orina se digirieron enzimáticamente con 0,25% de tripsina-EDTA (Gibco, EE.
UU.) Y luego se resuspendieron en un tampón de resuspensión que contenía BSA al 1% (Sigma, EE.
UU.) A 106 células / ml. Se transfirió un volumen de 300 μL de células a un tubo de citometría de flujo
de 5 ml. Las alícuotas de células se incubaron con CD90, CD44, CD29 y CD73 conjugados con
ficoeritrina (PE) o CD45 y CD34 conjugados con isotiocianato de fluoresceína (FITC) o cada uno de los
anticuerpos de control de isotipo correspondiente (BD Biosciences, EE. UU.) Durante 30 min a
temperatura ambiente. oscuro. Las células se resuspendieron en 1000 μl de tampón de resuspensión
después de lavar con PBS. Luego, la suspensión celular se analizó mediante análisis de citometría de flujo
utilizando el software Cell Quest. BD FACS Canto II se utilizó para la adquisición de datos mediante el
ajuste del voltaje y la compensación utilizando los canales apropiados de excitación y detección. El
análisis de los datos se realizó con el software FlowJo (FlowJo, EE. UU.).
análisis estadístico
Se realizaron al menos tres series de experimentos independientes para cada ensayo. Todos los datos
cuantitativos se transfirieron a hojas de cálculo estadísticas y se analizaron mediante un programa
estadístico disponible en el mercado SPSS versión 16.0 (IBM SPSS Inc., Chicago, IL, EE. UU.). La
prueba de la t de Student se utilizó para las comparaciones de los valores medios entre dos grupos con p
<0,05 considerado estadísticamente significativo. Todos los datos se presentan como media ± desviación
estándar.
Resultados
Observación de la morfología celular.
Se observaron células adherentes y colonias con dos morfologías 7 días después de la siembra (Fig. 1A).
Uno exhibió forma de huso y morfología similar a fibroblastos; La otra forma más redonda mostrada. Por
lo tanto, la orina puede contener al menos dos poblaciones celulares, incluidas las células de tipo MSC
(Tipo A) y las células de tipo epitelial (Tipo B). Luego, las células con forma de huso se pasaron
selectivamente y se expandieron usando el cilindro de clonación. Las células permanecieron en forma de
huso y se volvieron homogéneas en morfología después del pasaje (Fig. 1B). Sin embargo, las células con
forma más redonda pronto desaparecieron después de unas pocas semanas de cultivo porque las células de
tipo epitelial proliferan muy lentamente en los medios α-MEM, y su expansión requiere medios
específicos de células epiteliales [12], [13].
Figura 1
Descargar imagen de alta resolución (777KB) Descargar imagen a tamaño completo
Figura 1. Observación de la cultura y morfología de muestras derivadas de orina humana. (A)
Aparecieron células adherentes con dos formas diferentes 7 días después de la siembra. Un tipo mostraba
la forma del huso y el otro exhibía células de tipo epitelial. (B) Las colonias de células en forma de huso
se expandieron selectivamente utilizando el método del cilindro de clonación. Las células se volvieron
homogéneas en morfología y permanecieron en forma de huso después del pasaje. Barra de escala: 100
μm.