PRAKTIKUM BIOTEKNOLOGI PERTANIAN

JADWAL PRAKTIKUM:

Diatur oleh Asisten

TATA-TERTIB:
1. Mengikuti aturan (tata-tertib) yang berlaku di laboratorium
2. Harus hadir dan melaksanakan semua kegiatan praktikum (100%), baik sesuai
jadwal maupun berbagai kegiatan di luar jadwal praktikum yang disepakati
bersama.
3. Pelaksananaan kegiatan: secara kelompok dan akan diatur setiap kali praktikum,
tetapi praktikan harus saling tukar data sehingga masing-masing kelompok
memperoleh data lengkap.
4. Laporan: dikumpulkan paling lambat 1 mg setelah praktikum selesai (saat TAS)
beserta buku laporan sementara. Keterlambatan pengumpulan laporan hanya
diijinkan bila praktikan memiliki ijin resmi.

LAPORAN PRAKTIKUM:
1. Induksi variasi somaklonal gandum toleran salinitas
2. Pembuatan rennet dan keju
3. Isolasi, Identifikasi dan pemurnian cendawan Trichoderma sp.
4. Isolasi, Identifikasi dan pemurnian bakteri Acetobacter xylinum & Pembuatan Nata
5. Pembuatan Pupuk Hayati- bahan sayur/buah

PENILAIAN:
1. Aktivitas 20 %
2. Laporan sementara 10 %
3. Laporan 40 % (Note: laporan tidak sah bila tidak ada data di laporan sementara)
4. Test 30 %

Endang P- fp uksw-2015 1
 PRAKTIKUM BIOTEKNOLOGI PERTANIAN

ACARA 1. INDUKSI VARIASI SOMAKLONAL GANDUM TOLERAN SALINITAS

TUJUAN:
1. Mengetahui tahapan dan proses induksi variasi somaklonal dalam rangka perakitan
tanaman gandum toleran salinitas
2. Mengetahui penurunan daya regenerasi ES (control dan hasil induksi) pada
berbagai media regenerasi.

ALAT & BAHAN:

1. ALAT: Botol kultur (balsam), pinset, scalpel, otoklaf, cawan petri + tissue (steril),
dan glasswear untuk membuat media kultur in vitro, lampu spiritus
2. BAHAN: benih gandum varietas Dewata, Na-hipoklorit (bayclin), bahan kimia untuk
membuat media MS0, aquadest, 2,4-D, 4-amino-3,5,6-trichloropicolinic acid
(picloram), NaCl, Casein Hidrolisat, Thidiazuron (TDZ), alkohol.

PELAKSANAAN: (dokumentasikan setiap tahapan perkembangan)

1. Persiapan: Pembuatan media
a. Membuat media induksi kalus gandum (MIK):
i. MS0 + 3,5 ppm 2,4D
b. Membuat media induksi variasi somaklonal toleran salinitas (MIVS) dengan
menggunakan media proliferasi
i. MS0 + 2 ppm 2,4D + 1µM Picloram + 300 mM NaCl
c. Membuat media proliferasi control (non Variasi somaklonal) (MP):
i. MS0 + 2 ppm 2,4D + 1 µM Picloram
d. Membuat media maturasi E.S. gandum (MM):
i. MS0 + Arang aktif 2 g/l + 200 mg Casein Hidrolisat
e. Membuat media regenerasi / pengecambahan E.S. gandum (MR):
i. MS0 + 2,4-D (0.1 mg/l ) + TDZ (1.0 mg/l )
2. Melakukan kultur In Vitro
a. INDUKSI KALUS PRIMER
1. Ambil 110 benih gandum varietas Dewata
2. Sterilkan benih gandum dalam Na-hipoklorit 2x @ selama 5 menit, cuci
dengan aquadest steril sebanyak 3-4 kali. Pindahkan benih ke dalam
petridish berisi tissue steril, untuk meniriskan)
3. Tanam benih gandum dengan posisi embrio di atas, pada media induksi
kalus (MIK), inkubasikan selama 3 mg pada kondisi terang. Amati jumlah
kalus atau Embrio Somatic yang terbentuk (E.S.: globular/heart-
shape/torpedo), dan persentase kontaminasi.

Endang P- fp uksw 2
 PRAKTIKUM BIOTEKNOLOGI PERTANIAN

b. A. INDUKSI VARIASI SOMAKLONAL

1. Lakukan subkultur ke media induksi variasi somaklonal (MIVS), dengan cara
mengkultur eksplan berupa satu kalus+E.S. gandum  0,8 cm /botol,
kemudian diinkubasikan pada kondisi gelap selama 3 minggu. Amati
perubahan atau perkembangan E.S. (pengeringan ES, kementhesan ES, ES
bening/putih susu, atau cirri lain)
2. Setelah 3 minggu, lakukan subkultur ke media induksi variasi somaklonal
(MIVS) lagi. kemudian diinkubasikan pada kondisi gelap selama 3 minggu.
Amati perubahan atau perkembangan E.S. (pengeringan ES, kementhesan
ES, ES bening/putih susu, dll).
b. B. PROLIFERASI UNTUK KONTROL (non Variasi Somaklonal):
1. Setelah 3 minggu, Lakukan subkultur ke media proliferasi (MP), dengan cara
mengkultur eksplan berupa kalus+ E.S. gandum  0,8 cm /botol, kemudian
diinkubasikan pada kondisi gelap selama 3 minggu. Amati perubahan atau
perkembangan E.S. (pengeringan E.S., kementhesan E.S., ES bening/putih
susu, dll).
2. Setelah 3 minggu, lakukan subkultur ke media proliferasi (MP) lagi dan
diinkubasikan pada kondisi gelap selama 3 minggu. Amati perubahan atau
perkembangan E.S. (pengeringan ES., kementhesan E.S., ES bening/putih
susu, dll).
c. PEMULIHAN DAN MATURASI: E.S. Kontrol (nonVS) dan hasil Induksi Variasi
Somaklonal, agar pulih dan matang dengan cara mengkultur E.S. toleran pada
media maturasi (MM). Inkubasi pada kondisi terang/gelap (siang/malam) selama 2
minggu. Selanjutnya,
d. REGENERASI (mengecambahkan) E.S. gandum toleran salinitas pada media
regenerasi (MR) dan diletakkan pada tempat yang terkena cahaya 24 jam (beri
penerangan lampu). Amati perkembangan E.S. menjadi planlet: hitung jumlah dan
persentase planlet yang terbentuk, ES yang hanya membentuk akar atau tunas saja,
juga ES yang berbintik hijau, serta E.S. yang masih pada tahap Globular, Heart
Shape dan Terpedo.

NOTE: Membuat media induksi variasi somaklonal

Membuat larutan stock NaCl 5M sebanyak 250 ml
1. Timbang NaCl sebanyak 73,0375 g (dihitung dari = 5 M x 0,25 liter x 58,43 g/mol ).
Masukkan ke dalam beaker glass 500 ml.
2. Tambahkan 200 ml aquadest, kemudian aduk menggunakan strirer.
3. Masukkan ke dalam labu takar 250 ml
4. Tambahkan aquadest hingga 250 ml
Untuk membuat media induksi variasi somaklonal dengan tambahan NaCl sebanyak 1000
ml (=1 liter), maka tambahkan larutan stock NaCl 5M sebanyak:
 300 mM  300 x 1000 ml = 5000 x 60 ml

Endang P- fp uksw 3
 PRAKTIKUM BIOTEKNOLOGI PERTANIAN

ACARA 2. PEMBUATAN RENNET dan KEJU

TUJUAN
Agar mahasiswa mampu membuat rennet dan keju dengan bakteri alami dan bakteri yang
berasal dari susu asam komersial.
PENDAHULUAN
Keju merupakan suatu produk pangan yang berasal dari hasil penggumpalan
(koagulasi) dari protein susu. Susu yang digunakan untuk pembuatan keju adalah susu sapi,
meski susu dari hewan lain juga dapat digunakan. Selain dari kasein (protein susu),
komponen susu lainnya seperti lemak, mineral-mineral dan vitamin-vitamin yang larut
dalam lemak juga terbawa dalam gumpalan partikel kasein. Sedangkan komponen-
komponen susu yang larut dalam air tertinggal dalam larutan sisa dari hasil penggumpalan
kasein, yang disebut whey.

Alat:
Erlen meyer 500 ml, beaker glass 500 ml, beaker glass 1000 ml, otoklaf, inkubator,
pengaduk gelas steril, pemanas (hot-plate), pisau, shaker, lemari es/freezer, oven sentrifus.
Bahan:
Susu sapi segar 3500 ml, kapas, aluminium foil steril, susu asam komersial (Gedono), CaCl2
25% , abomasum sapi, kain saring steril, larutan garam jenuh, NaCl, asam asetat, kertas pH,
NaOH,

PELAKSANAAN
A. PEMBUATAN STARTER KEJU (senin)
A.1. Untuk memperoleh starter keju cara pertama:
1. Masukkan 250 ml susu sapi segar ke dalam erlen meyer 500 ml. Tutup
rapat dengan kapas dan aluminium-foil.
2. Otoklaf 121C selama 15 menit.
3. Setelah dingin (suhu sekitar 35C), tambahkan susu asam (yoghurt
komersial) kemudian aduk dengan pengaduk gelas steril.
4. Peram dalam inkubator pada suhu 30C selama 48 jam, akan diperoleh
starter keju-(a)
A.2. Untuk memperoleh starter keju cara kedua:
1. Masukkan 250 ml susu sapi segar ke dalam erlen meyer 500 ml. Tutup
rapat dengan kapas dan aluminium-foil.
2. Pasteurisasi sekejap (HTST= High Temperature Short Time) dengan cara
memanaskan susu selama 1-2 menit dengan suhu 85oC – 95oC
3. Peram dalam inkubator pada suhu 30C selama 48 jam, akan diperoleh
starter keju-(b)
A.3. Untuk memperoleh starter keju cara ketiga:
1. Masukkan 250 ml susu sapi segar ke dalam erlen meyer 500 ml. Tutup rapat
dengan kapas dan aluminium-foil.
2.Pasteurisasi susu pada suhu 65C selama 15 menit.

Endang P- fp uksw 4
 PRAKTIKUM BIOTEKNOLOGI PERTANIAN

3.Peram dalam inkubator pada suhu 30C selama 48 jam, akan diperoleh
starter keju-(c)
Starter keju yang diperoleh dapat disimpan dalam lemari pendingin (suhu 3C).
Apabila akan digunakan untuk pembuatan keju, starter keju harus disegarkan
kembali dengan cara seperti di atas (=pembuatan starter)

B. PEMBUATAN EKSTRAK RENNET (ekstrak abomasum anak sapi yang

mengandung enzim rennin)
1. Abomasum sapi dibelah, dihilangkan lemak dan isinya, lalu dicuci bersih.
2. Abomasum dimasukkan ke dalam wadah plastik dan disimpan dalam freezer
selama seminggu sebelum digunakan.
3. Abomasum beku dicairkan dengan cara merendam dalam air pada suhu ruang.
Setelah mencair, abomasum dibelah membujur dan lapisan mukosanya
dipisahkan dari jaringan dinding luarnya (muscular wall).

4. Mukosa kemudian dicincang dengan pisau sampai ukuran sekecil mungkin, lalu
dimasukkan ke dalam gelas piala 1 liter yang telah diisi dengan larutan asam
asetat 10 % yang sudah ditambah 5 gram NaCl/100 ml lar Asam Asetat (5%
NaCl), dengan perbandingan mukosa : asam asetat = 1 : 2. Untuk mempercepat
ekstraksi, campuran asam asetat dan mukosa di-shaker selama 24 jam pada suhu
ruang
5. Setelah proses ekstraksi berjalan selama 24 jam, dilakukan pemisahan ampas
dari larutan hasil ekstraksi dengan cara sentrifugasi pada kecepatan 2750 rpm
selama 15 menit. Endapan dipisahkan dari filtrat (bagian cairan) dengan cara
menuangkan cairan pada wadah gelas.
6. Endapan dari hasil ekstraksi selanjutnya diekstraksi lagi, empat kali, dengan
cara yang sama dengan ekstraksi pertama. Filtrat atau cairan hasil ekstraksi
kemudian dikumpulkan dan dinetralkan dengan cara menambahkan NaOH 1 N
sampai pH menjadi 5.4. Penambahan NaOH dilakukan sedikit demi sedikit dan
selama penambahan dilakukan pengadukan.
7. Larutan rennet kemudian di endapkan dengan cara menambahkan larutan garam
amonium sulfat jenuh. Perbandingan volume larutan rennet dengan amonium
sulfat jenuh ditentukan berdasarkan hasil percobaan. Endapan yang terjadi
kemudian dipisahkan secara sentrifusa pada kecepatan 5.000 rpm selama 15
menit.

Endang P- fp uksw 5
 PRAKTIKUM BIOTEKNOLOGI PERTANIAN

8. Endapan rennet kemudian dipekatkan dengan melakukan pengeringan

o
menggunakan oven pada suhu 40 – 50 C. Pengeringan dilakukan sampai kadar
o
air 5 %. Ekstrak rennet dapat disimpan pada suhu 5 C.

C. PEMBUATAN KEJU (rabu – kamis/jumat – senin)

1. Siapkan 2500 ml susu sapi segar dan tambahkan CaCl2 25% sebanyak 2
ml/l susu.
2. Pasteurisasi pada suhu 65 C selama 15 menit.
3. Dinginkan susu sampai 40 C
4. Tambahkan starter keju (0,5-1%) dan ekstrak rennet 5 ml/L susu, aduk
dengan pengaduk steril.
5. Masukkan dalam inkubator dengan suhu 40-42 C. Diamkan selama 24 jam,
sampai terjadi koagulasi atau penggunpalan protein susu (casein) dengan
sempurna.
6. Potong-potong dengan pisau, gumpalan susu yang terbentuk, dengan
ukuran 3x3 cm.
7. Panaskan kembali potongan gumpalan susu sampai suhu 40C, agar cairan
whey keluar sempurna.
8. Siapkan cetakan keju, lapisi dasarnya dengan kain saring (steril). Tuang
gumpalan susu ke dalam cetakan keju tsb, kemudian peras/tekan selama
2-3 jam.
9. Rendam keju yang terbentuk dalam larutan garam jenuh selama
3x24 jam.
10. Tiriskan hingga kering, bungkus dengan aluminium-foil, kemudian letakkan
dalam wadah, bisa petridish steril.
11. Peram keju tersebut pada suhu 3-4 C, RH 70% - 75%, selama 3-6 bulan
12. Pengamatan pada akhir semester (warna + foto, tekstur, kepadatan, aroma,
dan citarasa).

Endang P- fp uksw 6
 PRAKTIKUM BIOTEKNOLOGI PERTANIAN

ACARA 3. ISOLASI, PEMURNIAN & IDENTIFIKASI fungi Trichoderma sp.

TUJUAN:
Mengetahui tahapan dan proses isolasi, pemurnian dan identifikasi Trichoderma sp. dari
rhizosfer
ALAT & BAHAN:
3. ALAT: entkas, jarum ent, jarum ose, otoklaf, cawan petri steril (sebagian diisi
tissue), tabung reaksi steril, gunting steril, dan glasswear untuk membuat media
PDA, lampu spiritus, mikroskop
4. BAHAN: Akar dan tanah di sekitar sistem perakaran tanaman budidaya yang sehat
(Kebun Kartini), bahan untuk membuat media PDA, aquadest steril, etanol 75%,
larutan NaOCl (bayclin), pewarna nigrosin.
PELAKSANAAN: (dokumentasikan setiap tahapan perkembangan)
2. Persiapan: (Suciatmih dan Kramadibrata, 2002)
a. Akar tanaman digali pada kedalaman 0-15 cm, dipotong, dan tanahnya
diambil sebanyak ± 0,5 kg. Lakukan 1-2 jam sebelum proses isolasi.
b. Kemudian dimasukkan dalam kantung plastik berukuran 1 kg. Bila isolasi
dilakukan setelah >2 jam, sampel tersebut selanjutnya dipindahkan ke dalam
ice bag agar tetap stabil hingga proses isolasi di laboratorium.
3. Isolasi kapang: Pengisolasian kapang dilakukan dengan metode langsung (direct
innoculation).
a. Akar tanaman terlebih dahulu dicuci di bawah air mengalir selama 10 menit
kemudian dipotong sepanjang ± 1 cm dengan gunting steril. Lakukan
sebanyak 6 ulangan – per kelompok
b. Potongan akar selanjutnya disterilisasi secara bertahap dengan cara direndam
dalam larutan etanol 75% selama 1 menit, dilanjutkan larutan sodium
hipoklorit 5,3% selama 5 menit dan terakhir dicuci secara aseptik dengan
akuades steril (Ritchie, 1995; Lumyong et al., 2001; Park, 2003).
c. Potongan akar diletakkan di atas kertas saring steril dan dikeringkan selama
15 menit. Potongan akar yang sudah kering diletakkan pada media kultur
potato dextrose agar (PDA) dalam petridish, lalu diinkubasi selama 48-72
jam pada suhu ruang (27°C).
1. Pemurnian kapang: (hari jumat)
a. Koloni kapang yang tumbuh selama proses isolasi, dimurnikan dengan
propagasi koloni yaitu dengan cara memotong dan mentransfer secara
aseptik sebagian miselium kapang ke dalam media kultur (Alexopoulos et
al., 1996). Media kultur yang digunakan adalah agar miring low carbon agar
(PDA).
b. Koloni diinkubasi selama 48-72 jam pada suhu ruang. Koloni yang terpisah
dan tumbuh dengan baik selanjutnya dipilih dan ditanam kembali sebanyak
dua ulangan.
2. Identifikasi kapang: Isolat kapang yang telah murni diidentifikasi secara
makroskopis (morfologi dan mikroskopis, yaitu dengan mengamati beberapa
karakter morfologi baik secara makroskopis maupun secara mikroskopis.
a. Pengamatan makroskopis meliputi warna dan permukaan koloni (granular,
seperti tepung, menggunung, licin), tekstur, zonasi, daerah tumbuh, garis-
garis radial dan konsentris (khususnya pada kapang Penicillium), warna balik
koloni (reverse color), dan tetes eksudat (exudate drops).

Endang P- fp uksw 7
 PRAKTIKUM BIOTEKNOLOGI PERTANIAN

b. Pengamatan secara mikroskopis meliputi ada tidaknya septa pada hifa,

pigmentasi hifa, hubungan ketam (clamp connection), bentuk dan
ornamentasi spora (vegetatif dan generatif), serta bentuk dan ornamentasi
tangkai spora (Gandjar et al., 1999).
http://nt.ars-grin.gov/taxadescriptions/keys/TrichodermaIndex.cfm
http://www.mold.ph/tricho16.jpg&imgrefurl=http://www.mold.ph/trichoderma.htm
&usg

Green Mold (Trichoderma harzianum)

Macroscopic Appearance
Growth rate is rapid and colonies are
wooly becoming compact in time; and
The surface colony color is white and
scattered greenish patches become visible as the
conidia are formed and may form concentric rings
at times while on the reverse, the color is pale,
tan, or yellowish;

Endang P- fp uksw 8
 PRAKTIKUM BIOTEKNOLOGI PERTANIAN

Microscopic Appearance
Septate hyaline hyphae (divided by a septum or septa), conidiophores, phialides, and
conidia are present;
Trichoderma longibrachiatum and Trichoderma viride may also produce chlamydospores
(=chlamydoconidia - a thick-walled, thallic conidium formed within the vegetative hyphae;
Chlamydoconidia function as organs of perennation rather than dissemination);
Phialides (- a specialized conidiogenous cell that produces conidia in basipetal succession
without increasing in length) are hyaline, branched, flask – shaped, inflated at the base,
solitary or may appear in clusters, and are attached to the conidiophores at right angles;
Conidiophores (a specialized hypha upon which conidia develop) are hyaline, branched,
and may occasionally demonstrate a pyramidal arrangement; and
Conidia (an asexual reproductive propagule formed in any manner that does not involve
cytoplasmic cleavage and conidia function as organs of dissemination) are unicellular,
round or ellipsoidal, green in color, smooth walled or rough, with an average diameter of 3
µm, and are grouped in sticky heads at the tips of the phialides, however, these clusters
usually get disrupted during slide preparation procedure intended for microscopic
examination.

PENGECATAN NIGROSIN
1. Siapkan gelas preparat
2. Bersihkan dan sterilkan dengan kapas beralkohol
3. Teteskan sedikit nigrosin di satu sisi permukaan gelas preparat
4. Ambil cendawan menggunakan jarum ent/ose steril (sudah dipanaskan membara di
atas lampu spiritus, tetapi ditunggu dingin). Campurkan ke dalam nigrosin.

Endang P- fp uksw 9
 PRAKTIKUM BIOTEKNOLOGI PERTANIAN

5. Ratakan campuran cendawan dan nigrosin ke seluruh permukaan gelas preparat,

menggunakan gelas preparat lain (membentuk sudut 30) sehingga terbentuk lapisan
tipis (smear)
6. Fiksasi sebentar dengan melewatkan di atas lampu spiritus, bolak-balik.

Endang P- fp uksw 10
 PRAKTIKUM BIOTEKNOLOGI PERTANIAN

ACARA 4. NATA DE COCO

DASAR TEORI:
Banyak sekali makanan yang dapat dihasilkan dari fermentasi bakteri Acetobacter xylinum
salah satu yang banyak digunakan saat ini adalah untuk pembuatan nata. Nata adalah
biomassa yang sebagian besar terdiri dari sellulosa, berbentuk agar dan berwarna putih
seperti gel. Massa ini berasal dari pertumbuhan bakteri Acetobacter xylinum pada
permukaan media cair yang asam dan mengandung gula.
Bakteri pembentuk nata tersebar secara luas di alam dan dapat ditemukan pada sari
tanaman bergula.yang telah mengalami fermentasi atau pada sayuran dan buah-buahan
bergula yang telah membusuk. Isolasi bakteri tersebut dapat dilakukan dengan cara
menumbuhkannya pada media agar yang telah ditambah dengan gula dan diperkaya
dengan sari buah atau ekstrak ragi.
Nata de Coco dibentuk oleh spesies bakteri asam asetat pada permukaan cairan yang
mengandung gula, sari buah, atau ekstrak tanaman lain (Lapuz et al., 1967).. Bakteri ini
dapat menghasilkan asam asetat dari etanol. Beberapa spesies yang termasuk bakteri
asam asetat dapat membentuk selulosa, namun selama ini yang paling banyak dipelajari
adalah Acetobacter xylinum (Swissa et al., 1980). Bakteri Acetobacter xylinum termasuk
genus Acetobacter (Ley & Frateur, 1974)., Bakteri A. xylinum bersifat (menunjukkan reaksi)
Gram negatip, bersifat obligat aerobik, berbentuk batang pendek atau kokus, non-motil
dan tidak membentuk endospora(Moat, 1986; Forng et al., 1989).
Faktor-faktor yang mempengaruhi pertumbuhan Acetobacter xylinum adalah nutrisi,
sumber karbon, sumber nitrogen, serta tingkat keasaman media, suhu, dan udara (oksigen.
Senyawa karbon yang dibutuhkan dalam fermentasi nata berasal dari monosakarida dan
disakarida. Sumber dari karbon ini yang paling banyak digunakan adalah gula.
Sumber nitrogen dapat berasal dari bahan organic seperti ZA, urea. Syarat tumbuh bakteri
Acetobacter Xylinum dapat tumbuh pada pH 3,5 – 7,5 namun akan tumbuh optimal bila pH
nya 4,3. Sedangkan suhu ideal bagi pertumbuhan bakteri Acetobacter xylinum pada suhu
ruang, yaitu 28°– 31 °C. Bakteri ini sangat memerlukan oksigen.
Untuk mengisolasi bakteri Acetobacter xylinum diperlukan media agar khusus yaitu media
agar bernutrisi dengan air kelapa sebagai pengencer. Air kelapa yang ditambahkan dapat
meningkatkan selektivitas pada saat isolasi.

Endang P- fp uksw 11
 PRAKTIKUM BIOTEKNOLOGI PERTANIAN

ACARA 4.1. ISOLASI, IDENTIFIKASI & PEMURNIAN BAKTERI Acetobacter xylinum

TUJUAN:
1. Mampu melakukan isolasi bakteri Acetobacter xylinum dengan memanfaatkan
mikroorganisme dari berbagai sumber inokulum
2. Mampu melakukan identifikasi bakteri Acetobacter xylinum
3. Mampu melakukan pemurnian isolat bakteri Acetobacter xylinum untuk
pembuatan starter/bibit nata de coco

A. ISOLASI BAKTERI Acetobacter xylinum

A.1. Membuat bibit/starter dari Nira Kelapa

ALAT & BAHAN:
ALAT: kain saring, stoples steril, panci, kompor gas, pengaduk, incubator,
thermometer, tabung reaksi
BAHAN: nira kelapa 1 liter, media Hassid Barker Agar (HBA)
PELAKSANAAN:
1. Saring nira/air kelapa dengan kain bersih agar diperoleh air kelapa yang bersih
dari kotoran
2. Ukur pH air kelapa. Atur pH media menjadi 4,0 dengan menggunakan Asam
Asetat glacial (pekat).
3. Pasteurisasi nira kelapa pada suhu 50°C selama 15 menit.
4. Dimasukkan ke dalam 5 buah stoples steril (@ 200 ml), kemudian tutup dengan
kertas koran bersih/steril.
5. Simpan dalam incubator yang diatur suhunya pada 30°C (kisaran 28-32 °C)
6. Pertumbuhan bakteri akan tampak setelah diinkubasi pada suhu kamar selama
4-5 hari. Inkubasi selama 3 minggu pada suhu ruang.
7. Setelah waktu tersebut tercapai, akan terbentuk gumpalan/lapisan putih pada
permukaan nira, yang dapat digunakan sebagai bibit/starter dalam pembuatan
Nata de coco.

A.2. Mengisolasi bakteri Acetobacter xylinum

ALAT & BAHAN:
1. ALAT: Gelas piala 1L, cawan petri, tabung reaksi, jarum ose
2. BAHAN: larutan NaCl 0,85%, media Hassid Barker Agar (HBA) untuk menumbuhkan
biakan (murni) Acetobacter xylinum (komposisi lihat Tabel 1)
PELAKSANAAN:
A.2.1. Membuat media Hassid Barker Agar (HBA) untuk Isolasi dan pemurnian bakteri:
1. Timbang berbagai bahan yang diperlukan (lihat Tabel 1.)
2. Masukkan semua bahan ke dalam gelas piala 1L (kecuali agar)
3. Tambahkan 1 liter air kelapa
4. Aduk menggunakan Magnetic strirer
5. Atur pH media menjadi 4,0 dengan menggunakan Asam Asetat glacial (pekat)
6. Tambahkan agar

Endang P- fp uksw 12
 PRAKTIKUM BIOTEKNOLOGI PERTANIAN

7. Panaskan hingga matang

8. Tuang media ke dalam cawan petri dan tabung reaksi
9. Disterilkan dalam autoclave 121 C, 2 atm, selama 15 menit.
10. Media dalam tabung reaksi masih panas diletakkan miring hingga membeku untuk
menghasilkan media agar miring.

Tabel 1. Media Hassid Barker Agar (HBA)

No Komposisi Media Bobot (gram/liter)
1 Sukrosa (gula pasir) 100,0
2 Ragi (yeast) 2,5
3 KH2PO4 5,0
4 Amonum sulfat/pupuk ZA ((NH4)2SO4) 0,6 atau
Atau pupuk Urea 5
5 Magnesium sulfat (MgSO4.7 H2O) 0,2
6 Agar 15,0
7 Air Kelapa muda sebagai pengencer () 1 liter
Sumber: modifikasi dari PPPG Pertanian, 1999.

A.2.2. Membuat media Yeast Extract Agar (YEA) untuk Isolasi dan pemurnian bakteri:
1. Disiapkan bahan-bahan pada Tabel 2, ditimbang dan dicampur, kemudian diencerkan
dengan akuades. Untuk mempercepat larutnya bahan-bahan tersebut, perlu dilakukan
pemanasan.
2. Kemudian larutan didinginkan dan ditambah asam cuka sampai pH mencapai 4,5.
Selanjutnya disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121C, tekalan 15 lbs selama 15
menit.
3. Dalam keadaan masih panas dimasukkan ke dalam cawan petri dan tabung reaksi-agar
miring steril, dan didiamkan miring sampai beku.

Tabel 2. Media Yeast Extract Agar (YEA)

No Komposisi Media Bobot (gram/liter)

1 Yeast extract agar 0,2504
2 K2HPO4 / KH2PO4 0,50 / 0,3908
3 MgSO4 0,0640
4 Gula pasir/sukarosa 10
5 Agar-agar 2
6 Air Kelapa 100 ml

Endang P- fp uksw 13
 PRAKTIKUM BIOTEKNOLOGI PERTANIAN

A.2.2. Isolasi bakteri

Isolasi bakteri dapat menggunakan 2 cara, yaitu:
1. Cara tuang (Plating)
a. Mula-mula dilakukan pengenceran berseri (serial dilution) sampai 10-3 atau 10-6
untuk bahan air sayur asin atau yoghurt plain. Pada cara ini kita mengambil 1 ml
sampel gumpalan/lapisan putih pada permukaan nira, kemudian ditambahkan 9
ml NaCl 0,85% (konsentrasi 10-1). Selanjutnya dibuat sampai pengenceran 10-6,
b. Selanjutnya dilakukan Pour-plate technique: penuangan larutan hasil
pengenceran 10-3 hingga 10-6 pada cawan petri berisi media MRS, ratakan
dengan garpu kultur kemudian di inkubasi selama 48-72 jam pada suhu ruang
(37°C / 30°C; berturut-turut Lactobacillus plantarum/Lactococcus lactis) dan
diamati hasilnya.
2. Cara gores (Streak)
Pada cara ini kita mengambil satu ose dari sampel gumpalan/lapisan putih pada
permukaan nira dengan konsentrasi 10-1 dan digoreskan (streak) pada media dalam
cawan petri setelah itu diinkubasi dan diamati hasilnya.

Adapun cara pengenceran dan Plating larutan kultur bakteri adalah sebagai berikut:

Endang P- fp uksw 14
 PRAKTIKUM BIOTEKNOLOGI PERTANIAN

Sedangkan cara menggores (streak) larutan kultur bakteri pada media padat adalah
sbb.:

(1) (2)

(4)
(3)

B. PEMURNIAN DAN IDENTIFIKASI BAKTERI Acetobacter xylinum

ALAT & BAHAN:
ALAT: mikroskop, jarum ose, gelas preparat, gelas penutup (deck glass)
BAHAN: pewarna gram, larutan NaCl 0,85%, media HBA pada cawan petri dan agar
miring dalam tabung reaksi.

PELAKSANAAN: Amati, hitung ada berapa macam koloni yang tumbuh. Kemudian tiap
macam koloni dimurnikan
B.1. TAHAP PEMURNIAN BAKTERI dilakukan dengan metode Goresan Kuadran (Streak
Quadrant):
a. Dipilih satu koloni yang nampak terdiri dari satu tipe sel
b. Jarum ose dibakar, setelah dingin disentuhkan ke permukaan koloni bakteri yang
akan di streak pada plating media HBA/YEA, pada daerah kuadran I

Endang P- fp uksw 15
 PRAKTIKUM BIOTEKNOLOGI PERTANIAN

c. Streak ini dianggap sebagai streak primer pada permukaan media HBA/YEA
d. Jarum ose kemudian diangkat dan dibakar, setelah dingin, jarum ose di streak lagi
pada bagian kuadran II, diawali dengan cara melewati streak primer.
e. Jarum ose kemudian diangkat dan dibakar, setelah dingin, jarum ose di streak lagi
pada bagian kuadran III, diawali dengan cara melewati streak seconder.
f. Langsung dilanjutkan streak pada kuadran IV, tanpa mengangkat & membakar
jarum ose
g. Koloni diinkubasi selama 48-72 jam pada suhu ruang.
h. Koloni yang terpisah dan tumbuh dengan baik selanjutnya dipilih dan ditanam
kembali sebanyak dua ulangan.

B.2. TAHAP IDENTIFIKASI BAKTERI.

a. Pilih koloni tunggal dari tiap macam koloni. Buat larutan bakteri yang berasal dari 1
koloni bakteri yang dilarutkan dalam 10 ml larutan NaCl 0,85% , sebanyak macam
koloni yang diduga bakteri Acetobacter xylinum.
b. Lakukan uji dengan mengunakan reagen pewarna gram dan pengamatan
menggunakan mikroskop.
c. Koloni yang selnya berbentuk batang / kokus dan menunjukkan hasil pengecatan
gram negative merupakan koloni bakteri yang diduga merupakan bakteri
Acetobacter xylinum. Gunakan isolat ini untuk membuat Nata de coco.
d. Goreskan (streak) koloni terpilih pada media HBA yang terdapat dalam cawan petri
e. Sebagian disimpan pada media agar miring dan disimpan pada suhu 12 C (mampu
bertahan hidup 1-1,5 bulan).
f. Pemeliharaan koleksi kultur yang dimiliki dapat dilakukan dengan cara peremajaan
kultur (subkultur) setiap 2-3 bulan.
g. Bakteri A. xylinum bersifat Gram negatip, aerob, berbentuk batang pendek atau
kokus (Moat, 1986; Forng et al., 1989).

PENGAMATAN MAKROSKOPIS meliputi warna dan permukaan koloni

Endang P- fp uksw 16
 PRAKTIKUM BIOTEKNOLOGI PERTANIAN

PENGAMATAN MIKROSKOPIS meliputi bentuk individu bakteri

Gambar video Acetobacter xylinum dan

pada saat bakteri mensintesis selulosa
dapat diakses pada
http://www.botany.utexas.edu/facstaff
/facpages/mbrown/movies/movies.htm

UJI PEWARNAAN GRAM:

1. Siapkan gelas preparat bersih
2. Oleskan massa bakteri tipis-tipis pada permukaan gelas preparat.
3. Fiksasi dengan melewatkan di atas lampu spiritus.
4. Teteskan pereaksi-1 kristal violet (Gram-A), biarkan selama satu menit.
5. Cuci dengan air leding.
6. Teteskan Gram-Iodine (Gram-B), biarkan selama satu menit.
7. Cuci dengan air leding.
8. Lakukan penghilangan warna dengan menggunakan etil alcohol 95% (Gram-C).
Berikan tetes demi tetes, hingga Kristal violet tercuci dari massa tipis bakteri.
9. Cuci dengan air leding.
10. Beri pewarna lawannya, yaitu safranin (Gram-D). Biarkan selama 45 detik.
11. Cuci dengan air leding.
12. Setelah kering angin, amati menggunakan mikroskop.
13. Untuk membedakan hasil pewarnaan, apakah Gram (+) atau Gram (-) dapat diakses
pada http://panji1102.blogspot.com/2009/11/pewarnaan-gram.html

Endang P- fp uksw 17
 PRAKTIKUM BIOTEKNOLOGI PERTANIAN

Gambar Tahapan Uji Pewarnaan Gram

Endang P- fp uksw 18
 PRAKTIKUM BIOTEKNOLOGI PERTANIAN

Gambar Hasil Uji Pewarnaan Gram:

1. Bakteri Gram positif (+) diindikasikan dengan warna violet yang tidak hilang pada
tahapan Decolorization
2. Bakteri Gram negative (-) diindikasikan dengan warna violet yang hilang pada
tahapan Decolorization, dan menjadi berwarna merah muda (pink) yang
merupakan warna dari Safranin

Endang P- fp uksw 19
 PRAKTIKUM BIOTEKNOLOGI PERTANIAN

ACARA 4.1. PEMBUATAN NATA DE COCO

TUJUAN:
1. Mengetahui tahapan dan proses pembuatan NATA DE COCO
2. Mampu membuat NATA DE COCO

ALAT & BAHAN:

ALAT: Kompor, Panci untuk merebus media / air kelapa, Gelas ukur besar 1liter dan 250
ml, Pengaduk, Pisau pengiris nata, Plastik kemasan 1/2 kg, kain saring untuk
menyaring air kelapa, nampan/wadah untuk fermentasi, kertas Koran atau kain
putih/mori untuk penutup 3 m, tali pengikat/karet, Ember/baskom
perendam/pencuci, timbangan.
BAHAN: Air kelapa 10 liter, Gula pasir 1 kg, Asam cuka (asam asetat 25%)/asam cuka dapur
160 mili liter, Urea 10 g,Sirup rasa dan warna disesuaikan kesukaan masyarakat

PELAKSANAAN:
A. PENYARINGAN DAN PEMANASAN
1. Untuk menghilangkan kotoran yang bercampur pada air kelapa dilakukan penyaringan
air kelapa dengan menggunakan kain saring.
2. Kemudian campurkan gula pasir 2,5%- 10% (25-100 g/l air kelapa ) dan amonium sulfat
0,5%.
3. Lakukan pasteurisasi dengan merebus pada suhu 61°C selama 30 menit, atau 75°C
selama 15 detik atau 131°C selama 0,5 detik), kemudian dinginkan.
B. INOKULASI (PENCAMPURAN DENGAN STARTER)
1. Setelah dingin, pHnya diatur dengan menambahkan asam asetat 99,8% sebanyak
0,75% atau asam cuka sekitar 20 ml untuk menurunkan pH hingga diperoleh kisaran
keasaman (pH) 4,0 agar sesuai bagi pertumbuhan bakteri.
2. Selanjutnya dapat ditambahkan starter nata (Acetobacter xylinum) sebanyak 170 ml
3. Tuang ke dalam nampan (wadah dengan permukaan luas untuk menjamin
ketersediaan oksigen) dan diinkubasi selama 1-2 minggu pada suhu kamar. Bakteri ini
sangat memerlukan oksigen. Sehingga dalam fermentasi tidak perlu ditutup rapat
namun hanya ditutup untuk mencegah kotoran masuk kedalam media yang dapat
mengakibatkan kontaminasi – dapat menggunakan kertas Koran bersih/steril (oven
suhu 50C atau disetrika)

Endang P- fp uksw 20
 PRAKTIKUM BIOTEKNOLOGI PERTANIAN

Gambar serat selulosa yang dihasilkan oleh bakteri Acetobacter xylinum

(Michael Sano , Jaclyn Brennan Paul Gatenholm, Rafael V. Davalos, 2009. Direct
Control of Biological Assembly Using Electrokinetic Forces.
http://www.aicheproceedings.org/2009/Fall/data/papers/Paper162160.html)

C. PEMANENAN
Nata yang terbentuk kemudian dipanen dan lembaran direndam dalam air segar
selama 1 hari untuk menghilangkan lendir dan asam.

D. PEMROSESAN NATA DE COCO

Selanjutnya dilakukan pemotongan (1,5 cm x 1,5 cm) dan pencucian kembali dalam air
segar selama 2 hari (setiap hari diganti airnya) hingga asam hilang.
Penyiapan air bergula dengan cara menambahkan gula pasir sebanyak 500 gr ke dalam
5 liter air ditambahkan vanili atau flavour lain yang diinginkan. Potongan Nata de Coco
bentuk dadu dimasukkan ke dalam air bergula selanjutnya direbus hingga mendidih
selama 15 -30 menit. Nata de Coco didingankan dan siap untuk dikonsumsi atau untuk
dikemas.

Endang P- fp uksw 21