Anda di halaman 1dari 82

Makalah

LAPISAN ENDODERM

Tugas Kelompok III

diajukan untuk melengkapi tugas-tugas


mata kuliah Biologi Perkembangan

oleh

Cut Putri Amalya : 1806203010002


Febrina Rahmadani : 1806203010017
Khairati : 1806203010011
Nadia Rahmi : 1806203010026
Risa Rianda : 1806203010001

Dosen Pengasuh
Dr. Safrida, S.Pd, M.Si

PROGRAM STUDI MAGISTER PENDIDIKAN BIOLOGI


FAKULTAS KEGURUAN DAN ILMU PENDIDIKAN
UNIVERSITAS SYIAH KUALA
DARUSSALAM, BANDA ACEH
2019
KATA PENGANTAR

Dengan memanjatkan puji syukur kehadirat Allah SWT, serta rahmat


shalawat dan salam untuk junjungan besar Nabi Muhammad SAW. Penulis dapat
menyelesaikan makalah ini yang berjudul: “LAPISAN ENDODERM”.
Penulisan makalah ini ini diajukan untuk memenuhi tugas kelompok dari mata
kuliah Biologi Perkembangan pada Program Studi Magister Pendidikan Biologi
Fakultas Keguruan dan Ilmu Pendidikan Universitas Syiah Kuala. Terima kasih
kami ucapkan kepada seluruh unsur yang telah membantu menyelesaikan makalah
ini, baik secara langsung maupun tidak langsung. Semoga amal kebaikan yang
telah bapak dan Ibu berikan kepada penulis akan mendapat imbalan yang setimpal
dari Allah S.W.T Amin.
Penulis sangat menyadari di dalam penulisan makalah ini masih terdapat
kekurangan-kekurangan yang disebabkan oleh keterbatasan dan kemampuan
penulis. Oleh karena itu dengan segala kerendahan hati penulis sangat
mengharapkan saran dan kritik membangun untuk menyempurnakan makalah ini.
Semoga Allah SWT melimpahkan rahmat dan Karunia-Nya serta
membalas kebaikan semua pihak yang telah membantu dalam penyelesaian
makalah ini. Akhir kata, semoga makalah ini dapat bermanfaat bagi anggota
kelompok khususnya dan bagi pembaca pada umumnya
Akhirnya hanya kepada Allah jualah kami mohon ridha-Nya. Amin Ya
Rabbal ‘Alamin.

Banda Aceh, Oktober 2019

Tim Penulis

i
DAFTAR ISI

Halaman

KATA PENGANTAR ............................................................................................ i


DAFTAR ISI .......................................................................................................... ii

BAB I PENDAHULUAN .......................................................................................1


1.1 Latar Belakang..............................................................................................1
1.2 Rumusan Masalah ........................................................................................2
1.3 Tujuan ...........................................................................................................2
1.4 Manfaat .........................................................................................................2

BAB II KAJIAN TEORI .......................................................................................3


2.1 Pengertian Organogenesis ............................................................................3
2.2 Tahapan Organogenesis................................................................................4
2.3 Lapisan Endoderm ........................................................................................6
2.3.1 Pembentukan Saluran Pencernaan .....................................................9
2.3.2 Pembentukan Hati dan Kantung Empedu ........................................13
2.3.3 Pembentukan Pankreas.....................................................................15
2.3.4 Pembentukan Paru-Paru dan Trakea ...............................................16
2.3.5 Pembentukan Vesika Urinaria.........................................................20
2.3.6 Pembentukan Germ Cell .................................................................21
2.3.7 Lapisan Endoderm pada Katak .......................................................21
2.9 Kelainan Turunan Endoderm .....................................................................22

BAB III KAJIAN PENELITIAN TENTANG ENDODERM .........................29

BAB IV PENUTUP ..............................................................................................78

DAFTAR PUSTAKA ...........................................................................................79

ii
BAB I
PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang


Organogenesis adalah suatu proses pembentukan organ yang berasal dari tiga

lapisan germinal embrio yang telah terbentuk terlebih dahulu pada tahap

gastrulasi. Masing- masing lapisan yaitu ektoderm, mesoderm dan endoderm akan

membentuk suatu bumbung yang akan berkembang menjadi sistem organ tertentu

yang berbeda namun berkaitan satu dengan yang lain. Pada organogenesis juga

terjadi tahap pertumbuhan akhir embrio yaitu penyelesaian secara halus bentuk

definitif menjadi ciri suatu individu (Wibowo & W, 2009)

Lapisan-lapisan tersebut berkembang menjadi turunan jaringan dan organ

masing-masing pada saat dewasa. Misalnya lapisan Ektoderm akan

berdiferensiasi menjadi cor (jantung), otak (sistem saraf), integumen (kulit),

rambut dan alat indera. Lapisan Mesoderm akan berdiferensiasi menjadi otot,

rangka (tulang/osteon), alat reproduksi (testis dan ovarium), alat peredaran darah

dan alat ekskresi seperti ren. Lapisan Endoderm akan berdiferensiasi menjadi alat

pencernaan, kelenjar pencernaan, dan alat respirasi seperti pulmo. Imbas

embrionik yaitu pengaruh dua lapisan dinding tubuh embrio dalam pembentukan

satu organ tubuh pada makhluk hidup. Contohnya : Lapisan mesoderm dengan

lapisan ektoderm yang keduanya mempengaruhi dalam pembentukan kelopak

mata. Lapisan Endoderm akan berdiferensiasi menjadi alat pencernaan, kelenjar

pencernaan, dan alat respirasi seperti pulmo. Imbas embrionik yaitu pengaruh dua

lapisan dinding tubuh embrio dalam pembentukan satu organ tubuh pada makhluk

hidup. Contohnya : Lapisan mesoderm dengan lapisan ektoderm yang keduanya

mempengaruhi dalam pembentukan kelopak mata.

1
2

1.2 Rumusan Masalah


Rumusan masalah dalam makalah ini yaitu:

1. Apakah yang dimaksud dengan organogenesis ?

2. Bagaimanakah tahapan organogenesis ?

3. Bagaimanakah organogenesis derivat dari endoderm ?

4. Bagaimanakah kelainan kelainan turunan Endoderm ?

1.3 Tujuan
Adapun tujuan dari penulisan makalah ini adalah sebagai berikut:

1. Untuk mengetahui maksud dari organogenesis.

2. Untuk mengetahui tahapan organogenesis.

3. Untuk mengetahui turunan derivat dari endoderm.

4. Untuk mengetahui kelainan turunan endoderm.

1.4 Manfaat
Manfaat dari penulisan makalah ini adalah:

1. Sebagai bahan bacaan tambahan dan referensi mengenai organogenis dari

lapisan endoderm.

2. Memberikan pengetahuan dan masukan mengenai penelitian yang sudah

dilakukan mengenai lapisan endoderm .


BAB II
KAJIAN TEORI

2.1 Pengertian Organogenesis

Dalam perkembangan hewan, organogenesis (organo-genesis berasal dari

kata Yunani όργανον yaitu dengan mana yang bekerja", dan γένεσις "asal,

penciptaan, generasi") adalah proses di mana ektoderm, endoderm, dan

mesoderm berkembang menjadi organ-organ internal organisme. Organ-organ

internal memulai pembangunan pada manusia dalam 3 sampai minggu ke-8 di

dalam rahim. Lapisan dalam organogenesis dibedakan menjadi tiga proses:

lipatan, perpecahan, dan kondensasi. Mengembangkan selama tahap awal pada

hewan chordata adalah tabung saraf dan notochord. Semua hewan vertebrata

memiliki proses pembentukan gastrula dengan cara yang sama. Vertebrata

mengembangkan pial neural yang membedakan ke dalam banyak struktur,

termasuk beberapa tulang, otot, dan komponen dari sistem saraf perifer.

Organogenesis adalah proses pembentukan organ atau alat tubuh.

Pertumbuhan ini diawali dari pembentukan embrio (bentuk primitif)

menjadi fetus (bentuk definitif) kemudian berdiferensiasi menjadi memiliki

bentuk dan rupa yang spesifik bagi keluarga hewan dalam satu species.

Organogenesis mencangkup proses transformasi atau perubahan bentuk serta

proses diferensiasi prosesyang terjadi secara terus menerus pada sel, jaringan

untuk membentuk struktur yang spesifik. Diferensiasi sel terjadi melalui

interaksi sel yang diperantarai oleh molekul signalling yang bervariasi.

Organogensisi dimulai akhir minggu ke 3 dan berakhir pada akhir minggu

ke 8. Dengan berakhirnya organogenesis maka cirri-ciri eksternal dan system

3
4

organ utama sudah terbentuk yang selanjutnya embryo disebut fetus.

Organogenesis terdiri dari dua periode, yaitu pertumbuhan antara dan

pertumbuhan akhir. Pada periode pertumbuhan antara atau transisi terjadi

transformasi dan differensiasi bagian-bagian tubuh embryo dari bentuk

primitive sehingga menjadi bentuk definitif. Pada periode ini embryo akan

memiliki bentuk yang khusus bagi suatu spesies. Pada periode pertumbuhan

akhir, penyelesaian secara halus bentuk definitive sehingga menjadi ciri suatu

individu. Pada periode ini embryo mengalami penyelesaian pertumbuhan jenis

kelamin, watak (karakter fisik dan psikis) serta wajah yang khusus bagi setiap

individu.

2.2 Tahapan Organogenesis

Dalam berlangsungnya proses organogenesis memiliki dua periode atau

tahapan yaitu:

a. Periode pertumbuhan antara

Pada periode ini terjadi transformasi dan diferensiasi bagian – bagian

tubuh embrio sehingga menjadi bentuk yang definitif, yang khas bagi

suatu spesies. Seperi pada katak adanya tingkat berudu.

b. Periode Pertumbuhan akhir

Periode pertumbuhan akhir adalah periode penyelesaian bentuk definitif

menjadi suatu bentuk individu (pertumbuhan jenis kelamin, roman /

wajah yang khas bagi suatu individu). Namun pada aves, reptil dan

mamalia batas antara periode antara dan akhir tidak jelas.


5

Organogenesis yaitu proses pembentukan organ-organ tubuh pada makhluk

hidup (hewan dan manusia). Organ yang dibentuk ini berasal dari masing-masing

lapisan dinding tubuh embrio pada fase gastrula yaitu (Campbell, 2004)

- Lapisan Ektoderm akan berdiferensiasi menjadi cor (jantung), otak

(sistem saraf), integumen (kulit), rambut dan alat indera.

- Lapisan Mesoderm akan berdiferensiasi menjadi otot, rangka

(tulang/osteon), alat reproduksi (testis dan ovarium), alat peredaran

darah dan alat ekskresi seperti ren.

- Lapisan Endoderm akan berdiferensiasi menjadi alat pencernaan,

kelenjar pencernaan, dan alat respirasi seperti pulmo. Imbas embrionik

yaitu pengaruh dua lapisan dinding tubuh embrio dalam pembentukan

satu organ tubuh pada makhluk hidup. Contohnya : Lapisan mesoderm

dengan lapisan ektoderm yang keduanya mempengaruhi dalam

pembentukan kelopak mata.

Gambar 2.1 Organogenesis lapisan ektoderm, mesoderm, dan endoderm


6

2.3 Lapisan Endoderm

Selama perkembangan awal, kebanyakan hewan melalui proses yang

disebut gastrulasi. Ini menyusun sel-sel embrio, sekarang disebut gastrula, untuk

menghasilkan lapisan germinal embrio yang berbeda. Beberapa hewan yang

diploblastik dan hanya memiliki dua lapisan germ: endoderm dan ektoderm.

Endoderm adalah lapisan germinal terdalam dan dikelilingi oleh ektoderm

dibagian luar.

Ubur-ubur, anemon laut, karang, dan ubur-ubur sisir adalah diploblastik.

Sebagian besar hewan lain, termasuk manusia, adalah triploblastik. Ini berarti

bahwa mereka memiliki tiga lapisan germinal yang berbeda. Di antara endoderm

dan ektoderm adalah lapisan yang disebut mesoderm. Masing-masing lapisan

jaringan ini akan berkembang menjadi struktur dewasa yang berbeda. Sebagai

contoh, pada manusia:

Ektoderm: berkembang menjadi sistem saraf (otak dan sumsum tulang

belakang) dan lapisan kulit luar. Mesoderm: memproduksi sebagian besar sistem

organ Anda, termasuk sistem tulang dan otot Anda. Endoderm: berkembang

menjadi hanya Anda jaringan terdalam dan organ.

Lapis benih atau Endoderm akan menumbuhkan beberapa sel seperti,

epithelium saluran pencernaan dan derivatnya seperti hati, pancreas, vesika

urinaria. Lapis benih juga menumbuhkan sel epitel saluran pernapasan, saluran

perkencingan, dan beberapa kelenjar endokrin seperti tyroid dan parathyroid.

Organ-organ turunan endoderm yang utama adalah saluran pencernaan

makanan (SPM) dan kelenjar- kelenjarnya, serta paru-paru dan saluran respiratori

(pernapasan). Selain itu, beberapa kelenjar endokrin berasal dari endoderm juga.
7

Pembentukan SPM diawali dengan terbentuknya arkenteron, yang pada anamniota

dari awal sudah berbentuk rongga yang akan membentuk saluran. Pada amniota,

saluran baru terbentuk melalui pelipatan-pelipatan splanknopleura di bagian

anterior, posterior, dan lateral. Di bagian tengah saluran, terdapat bagian yang

terbuka yaitu pada tangkai yolk yang menghubungkan saluran dengan kantung

yolk.

SPM terbagi menjadi wilayah usus depan, usus tengah, dan usus belakang.

Usus depan akan menjadi faring, esofagus, lambung, dan duodenum anterior.

Usus tengah adalah bakal duodenum posterior dan sebagian dari kolon. Usus

belakang ialah bakal kolon dan rektum. Lubang mulut terdapat di ujung anterior

usus depan, dari pertemuan ektoderm stomodeum dengan endoderm faring yang

kemudian pecah membentuk lubang mulut Ektoderm stomodeum masuk ke dalam

rongga mulut. Oleh karena itu, epitel rongga mulut adalah ektoderm. Hal yang

sama terjadi di bagian kaudal, epitel rongga anus atau rongga kloaka adalah

ektoderm yang berasal dari ektoderm proktodeum.

Faring memperlihatkan banyak derivat yaitu evaginasi laterad berupa kantung

faring yang selengkapnya ada 6 pasang. Pada kantung faring bagian distal terdapat

bakal tonsil, timus dan paratiroid. Bakal tiroid berupa divertikulum, tampak

medioventral dari faring. Kantung faring nomor 2 adalah saluran timpani bagian

telinga. Kantung faring bertemu dengan lekukan ektoderm bermesoderm yaitu

lekuk/celah faring (viseral), yang dibatasi oleh lengkung faring ke arah anterior

dan posterior. Lengkung faring 1 adalah lengkung mandibula, yang kedua ialah

lengkung hioid. Celah di antara kedua lengkung itu ialah celah hiomandibula.

Lengkung III dan seterusnya adalah lengkung insang. Derivat-derivat SPM


8

lainnya keluar dari medioventral usus depan ialah laringotrakea, hati, pankreas

ventral dan pankreas dorsal. Dari pangkal divertikulum hati, dibentuk kantung

empedu dengan duktus sistikus. Divertikulum hati bercabang-cabang membentuk

pita-pita hati dan duktus hepatikus. Duktus hepatikus bertemu dengan duktus

sistikus membentuk saluran empedu (ductus choledochus) yang bermuara di

dalam duodenum. Kedua bakal pankreas (ventral dan dorsal) bergabung di bagian

dorsal dan berdiferensiasi, sampai terjadi sitodiferensiasi. Saluran pankreas

bermuara di dalam duodenum Pankreas berdiferensiasi membentuk bagian

eksokrin dan bagian endokrin (pulau Langerhans) Hasil sitodiferensiasi ialah

terbentuknya berbagai sel khusus di dalam pulau Langerhans. Masing-masing sel

khusus (A, B, dan C) menghasilkan hormon tertentu, misalnya hormon glukagon

dan hormon insulin yang masing-masing dihasilkan oleh sel A dan sel B.

Divertikulum laringotrakea tumbuh ventroposteriad dan bercabang dua

(bifurkasi) menjadi bronkus ekstrapulmonalis. Ujung percabangan selalu

menggelembung yaitu bakal paru-paru. Selanjutnya, percabangan berlangsung

beberapa generasi menghasilkan bronkus intrapulmonalis, bronkiolus, sampai ke

terminal percabangan yaitu alveolus-alveolus. Semua percabangan

intrapulmonalis akan diselaputi oleh mesoderm yang mengisi ruang antarcabang-

cabang membentuk paru-paru. Paru-paru terdiri atas 3 lobus sebelah kanan dan 2

lobus sebelah kiri. Paru-paru merupakan organ yang paling akhir berfungsi, yaitu

saat lahir/ menetas. Agar alveoli tidak lengket satu sama lain sehingga tidak

collapse, dihasilkan senyawa surfaktan oleh sel-sel alveoli, yang mengatur

tegangan permukaan.
9

2.3.1 Pembentukan Saluran Pencernaan

Saluran pencernaan berkembang dari bumbung endoderm atau bakal

saluran percernaan yang terbentuk pada saat neurulasi. Pembentukan saluran

pencernaan tergantung pelipatan embrio di wilayah cephalocaudal & lateral.

Bumbung endoderm ini akan terbagi menjadi tiga wilayah, yaitu usus depan, usus

tengah dan usus belakang.

Saluran pencernaan primitif terbagi menjadi 3 bagian, yaitu usus depan

(fore gut), usus tengah (mid gut), dan usus belakang (hind gut).

 Usus depan: terbentuk oleh adanya pelipatan endodern atap arkenteron

bagian anterior, yang akan diikuti oleh mesoderm splanknik. Usus depan

akan menjadi rongga mulut, faring, esofagus, lambung dan duodenum.

 Usus tengah: daerah arkenteron antara usus depan dan usus belakang.

Usus tengah akan menjadi yeyunum, ileum dan kolon.

 Usus belakang: terbentuk oleh adanya pelipatan endodern atap arkenteron

bagian posterior, yang akan diikuti oleh mesoderm splanknik.

Usus belakang akan menjadi rektum dan kloaka atau anus

Epitel saluran pencernaan terbentuk dari endoderm, kecuali epitel mulut

dan anus – dari ektoderm.

Usus depan yang berada di daerah posterior dan farinks akan berkembang

membentuk oesofagus, ventriculus (lambung), duodenum (usus 12 jari), hati,

kantung empedu, dan pancreas. Lapisan permukaan dalam dari saluran percernaan

ini serta kelenjar-kelenjarnya berasal dari endoderm, tetapi otot pada dinding

saluran, jaringan ikat, pembuluh darah, mesenterium, dan epitel yang menutupi
10

permukaan luar usus yang berbatasan dengan coelom berasal dari mesoderm

splanknik.

Gambar 2.2 Pembentukan Saluran Pencernaan

Pada embrio awal, saluran pencernaan merupakan suatu saluran sederhana,

lebih ke kaudal terbentuk usus, dan bagian tengah saluran pencernaan ini

berhubungan dengan kantung yolk. Pada ujung kaudal dari usus terbentuk suatu

lekukan tempat pertemuan endoderm dengan ektoderm yang disebut proctodeum.

Kedua lapisan ini dibatasi oleh membrane kloaka yang kemudian akan pecah

untuk membentuk anus.


11

Gambar 2.3 Diagram pembentukan saluran pencernaan dan kelenjar pencernaan


(hati & pankreas)

Di bagian kaudal lambung (masih wilayah usus depan) terbentuk tiga

organ yang merupakan turunan saluran pencernaan, yaitu hati, pancreas, dan

duodenum. Perkembangan awal hati di wilayah usus depan adalah berupa

penggembungan atau disebut divertikulum hati. Divertikulum hati (corda hepatic)

merupakan tonjolan yang keluar dari usus depan, masuk ke mesenkim (mesoderm

hepatic) yang ada di sekeliling lambung. Mesenkim menginduksi endoderm

diverticulum hati untuk berproliferasi, bercabang, dan membentuk sel-sel hati.

Sebagian dari diverticulum hati (bagian yang terdekat dengan saluran pencernaan)

akan berfungsi sebagai saluran hati dan cabangnya akan membentuk kantung

empedu.
12

Awalnya, pancreas berkembang juga berupa diverticulum yang muncul

pada bagian dorsal dan vebtral usus depan. Kemudian, diverticulum yang berasal

dari sebelah dorsal dan vebtral saluran pencernaan tepat di sebelah kaudal kantung

empedu berfusi membentuk pancreas. Saluran pencernaan yang berasal dari usus

depan adalah : farinks, oesofagus, ventriculus, dan duodenum.

Dalam perkembangannya, usus tengah akan menjadi usus halus lanjutan

duodenum, yaitu jejunum dan ileum dan sebagian dari usus besar, yaitu colon

ascenden.

Selanjutnya, usus belakang akan berkembang menjadi sebagian besar usus


Gambar 2.4. Perkembangan Lambung
besar, yaitu colon transversum dan colon descenden serta kantung alantois.

Sebagian dari kantung alantois yaitu pangkalnya kelak akan berkembang menjadi

vesica urinaria (kantung kemih).


13

Gambar 2.5 perkembangan Usus

2.3.2 Pembentukan Hati dan Kantung Empedu

Tunas (divertikulum) hati timbul sebagai evaginasi ke arah ventaral dari

endoderm di antara bakal lambung dan duodenum. Tonjolan endoderm tersebut

dilapisi oleh mesenkim dan mesoderm splanknik. Tunas hati kemudian

bercabang-cabang membentuk hati, percabangan bagian distal membentuk sel-sel

parenkim sekretori, bagian proksimal membentuk sel-sel duktus hepatikus.

 Sel-sel hati (perenkim hati) dan sel-sel duktus hepatikus terbentuk dari

endoderm

 Jaringan-jaringan lain dari hati dibentuk oleh mesenkim dan mesoderm

splanknik.

 Dari bagian akar tunas hati timbul tonjolan yang lain, yaitu tunas kantung

empedu.

Kuncup hati (endoderm) /divertikulum berkembang dari bagian terminal

forgut (di bagian kaudal lambung) selama pertengahan minggu ketiga.

Divertikulum hati merupakan tabung endoderm yang memanjang dari usus depan

ke mesenkim di sekitarnya (mesoderm kardiogenik). Kuncup ini yang berisi sel


14

yang berproliferasi , bercabang dan membentuk epitel glandular hati kemudian

tumbuh ke arah dalamseptum transversum (mesodermal).

Gambar 2.6 Pembentukan Hati

Bagian divertikulum hati yang terdekat dengan tabung pencernaan terus

berfungsi sebagai saluran pembuang/drainage duct dari hati dan bercabang serta

menghasilkan: empedu. Hubungan antara bagian divertikulum hati yang aktif

proliferasi dan usus depan menyempit dan menjadi saluran empedu. Kuncup sistik

tumbuh dari saluran empedu membentuk kantung empedu dan duktus sistik. Sel

darah, sel Kupffer dan jaringan ikat dan sel-selnya berkembang dari mesoderm

septum transversum. Selama minggu ke10, hati membentuk 10% berat badan ,

sedangkan saat lahir hanya tinggal 5%.


15

Gambar 2.7 Perkembangan Empedu

2.3.3 Pembentukan Pankreas

Pankreas tunggal berasal dari dua buah tonjolan endoderm di dekat tunas

hati (1 diventral dan 1 di dorsal). Kedua tonjolan tersebut kemudian bercabang-

cabang dan berfusi membentuk pankreas tunggal.

 Sel-sel pankreas sekretori (asini pankreas) dan sel-sel duktus pankreatik

dibentuk dari sel-sell endodermal

 Pulau-pulau Langerhans dibentuk dari sel-sell endodermal. Pada awal

perkembangannya, kelompok sel-sel endodermal ini menjadi terpisah dan

terperangkap dalam mesoderm di antara asini pankreas.

 Kelompok-kelompok tersebut termodifikasi menjadi sel-sel pulau

Langerhans. Di dalam pankreas manusia dewasa terdapat 200.000 sampai

1.800.000 pulau Langerhans


16

Gambar 2.8 pembentukan Pankreas dan pulau Langerhans

2.3.4 Pembentukan Paru-Paru dan Trakea

Pembentukan trakea dan paru-paru berkaitan dengan saluran pencernaan.

Pada usus depan di perbatasan faring dan esofagus terjadi evaginasi endoderm ke

arah ventral membentuk lekuk laringotrakea.

o Lekuk laringotrakea memanjang, kemudian memisahkan diri dari usus depan

dan akan tumbuh ke arah posterior sebagai trakea yang terletak di sisi ventral

esofagus. Endoderm yang berasal dari usus depan membentuk bagian epitel

trakea, sedangkan tulang rawan, jaringan ikat dan ototnya berasal dari

mesenkim disekitarnya.

o Sementara memanjang, kedua ujung trakea menggelembung → menjadi tunas

paru-paru.

o Mesoderm akan menginduksi tunas paru-paru untuk terus tumbuh dan

membentuk percabangan bronkus dan bronkiolus. Di akhir percabangan,

epitel akan menipis dan terbentuklah alveolus.


17

o Epitel bronkus sampai dengan alveolus terbentuk dari endoderm, demikian

pula dengan kelenjar-kelenjarnya; sedangkan jaringan ikat dan otot pada

paru-paru terbentuk dari mesenkim. Pleura yang membungkus paru-paru

berasal dari mesoderm splanknik.

Perkembangan Paru-Paru

Divertikulum endoderm usus depan ventral terbentuk pada minggu ke-4

pascakonsepsi → Fase embrionik. Endoderm menonjol ke dalam mesoderm


(splanknik).
thoraks Interaksi epitel-mesenkim berakibat pada morfogenesis

percabangan dan perkembangan paruàMembentuk 2 kuncup paru. Endoderm

membentuk epitel respirasi. Mesoderm membentuk interstitium, otot polos,

pembuluh darah dan rawan paru.

Gambar 2.11 Pembentukan Paru-Paru

Kedua kuncup paru membentuk :

– Kanan : menjadi 3 bronchus utama

– Kiri : membentuk 2 bronchus utama


18

Gambar 2.12 Perkembangan Paru-Paru

Perkembangan paru pada minggu ke-4

sesudah konsepsi dan diteruskan sampai lahir.

Pada umur kehamilan 30 minggu Belum terdapat

alveoli sejati. Bayi manusia memiliki : 50 juta

alveoli, permukaan paru 3 m2, volume paru 150-

200 mL. Sedangkan pada organisme dewasa 300

juta alveoli, 75-100 m2 dan volume5000 mL.

Gambar 2.13 Perkembangan Paru-Paru


Stadium perkembangan paru
19

Pada embrio manusia hari ke 26 muncul suatu pembukaan di usus depan

→ evaginasi → laringotrakea. Epitel berkembang dari endoderm tabung

laringotrakea. Mesoderm berkembang dari mesoderm splanknik. Rawan

berkembang dari pial neural

Gambar 2.9 (a) Pemisahan diverticulum Laringotrachea. (b) Pemisahan septum


tracheoesophageal

Perkembangan trachea dari epitel berkembang dari endoderm tabung

laringotracheal. Termasuk kelenjar-kelenjarnya sedangkan pada jaringan ikat dan

otot dari mesoderm splanknik


20

Gambar 2.10 Mesoderm Splanknik

2.3.5 Pembentukan Vesika Urinaria

Selama perkembangan minggu 4 sampai 8, septum urorektal membagi

kloaka menjadi saluran anorektal dan sinus urogenitalis. Selaput kloaka terbagi

menjadi membrana urogenitalis di anterior dan membrana analis di posterior.

Tiga bagian sinus urogenitalis primitif dapat dibagi menjadi:

1. Kandung kemih : Pada awalnya, kandung kemih berhubungan langsung

dengan allantois, tetapi setelah allantois tertutup, maka yang tersisa

hanya korda fibrosa yang tebal (urakus) dan korda ini menghubungkan

puncak kandung kemih dengan umbilikus. Pada orang dewasa, dikenal

sebagai ligamentum umbilikus medial.

2. Sinus urogenitalis bagian panggul : Berupa saluran yang agak sempit yang

pada pria membentuk uretra pars prostatika dan pars membranosa.

3. Sinus Urogenitalis Tetap (sinus urogenitalis bagian penis) : merupakan

bagian yang sangat memipih ke samping dan terpisah dari dunia luar oleh

membrana urogenitalis (perkembangan urogenitalis berbeda pada kedua

jenis kelamin).
21

2.3.6 Pembentukan Germ Cell

Primordial germ cell merupakan sel-sel embrio yang bermigrasi ke

prekursor gonad dan membentuk gamet. Sel germinal/benih (seperti

sprema/ovum) embrionik induk/primordial (primordial germ cells) dan prekursor

sel germinal diploid ada sesaat pada embrio sebelum mereka terasosiasi dengan

sel somatik gonad dan kemudian menjadi sel germinal. Sel germinal embrionik

manusia/human embryonic germ cells (hEGCs) termasuk sel punca yang berasal

dari sel germinal primordial dari janin berumur 5-9 minggu.

2.3.7 Lapisan Endoderm Pada Katak

1. Pembentukan mulut dan hidung

Pembentukan mulut terjadi karena stomodeum atau invaginasi

ectoderm yang terjadi didaerah foregut bertemu dengan evaginasi

endoderm didaerah fore gut.lalu tumbuh birai bakal platinum (langit-

langit) sehingga stomodeum terbagi menjadi dua yaitu rongga hidung

di dorsal dan rongga mulut di ventral. Sementara itu terbentuk pula

penjorokkan dari atap ke lantai rongga hidung di median menjadi nasal

septum sehingga rongga hidung terbagi menjadi dua. Stomodeum juga

menumbuhkan pula peraltan mulut seperti lidah,kelenjarludah, dan

gigi.

2. Pembentukan hati dan pancreas

Hati tumbuh berupa evaginasi medio-ventral foregut yang berbatasan

dengan midgut. Bagian posterior kemudian membuat divertikulum

menjadi vesica vellea. Vena vitellin akan memasuki dan bercabang


22

halus dalam hepar yang sedang tumbuh ini. Pankreas tumbuh tumbuh

berupa evaginasi dekat hepar. Terjadi 3 evaginasi yaitu 1 dorsal dan 2

ventral. Ketiganya kemudian bersatu Tetapi saluranya ke duodenum

ada dua, kadang juga ada tiga seperti asal.

3. Pembentukan Duodenum

Tumbuh dari daerah midgut sewdangkan colon dan rectum dari

hindgut Hindgut memiilki evaginasi jaringan extra embryonal di media

ventral yakni allantois. Diverticulum allantois ini berasal dari cloaca.

Vesica urinaria juga evaginasi hindgut.

2.4 Kelainan Turunan Endoderm

Adapun kelainan-kelainan pada turunan Endoderm pada mausia yaitu sebagai

berikut:

1. Gastroschisis

Gastroschisis adalah cacat lahir pada dinding perut, di mana usus

bayi tergantung keluar tubuh tanpa lapisan pelindung melalui lubang di

dekat pusar. Lubang pada dinding perut yang menyebabkan usus atau

organ lainnya tergantung diluar tubuh biasanya berada di sebelah kanan

pusar. Ukuran lubang tersebut berbeda-beda pada tiap penderita. Kondisi

yang disebabkanoleh gastroschisis hampir mirip dengan omfalokel, namun

pada omfalokel usus dan organ tubuh lainnya tergantung di luar tubuh

terbungkus dengan membran tipis. Pencegahan Tindakan yang biasa

digunakan oleh dokter untuk menangani gastroschisis adalah pembedahan

darurat. Bayi yang megidap kelainan ini biasanya membutuhkan tindakan


23

pembedahan lebih dari sekali. Prosedur umum yang dilkaukan untuk

pembedahan adalah memasukan kembali organ yang berada di luar perut,

kemudian memasang kain pembalut yang biasa untuk menekan perut

sehingga menahan usus tetap di dalam rongga perut, sampai luka sembuh

sendiri. Perawatannya yaitu dengan memberi nutrisi lewat infus dan

memberi obat antibiotik untuk mencegah infeksi.

Gambar 2.13 Gastroschisis

2. Sindrom respiratory distress (RDS)

RDS ini adalah gangguan pernapasan yang mempengaruhi bayi

yang baru lahir. Kelainan ini sering terjadi pada bayi prematur yang lahir

sekitar 6 minggu atau lebih sebelum tanggal jatuh tempo. RDS sering

terjadi pada bayi prematur karena paru-paru mereka tidak mampu

membuat cukup surfaktan. Surfaktan yaitu cairan yang melapisi bagian

dalam paru-paru.

Pencegahan Untuk mencegah terjadinya RDS maka dilakukan :


24

a. Perawatan prenatal yang baik, mulai sedini munngkin dalam

kehamilan

b. Makan makanan yanng sehat dan konsumsi suplement tambahan

seperti vitamin dan tablet penambah besi

c. Hindari rokok, alkohol dan narkoba

d. Pada saat kehamilan, hindari konsumsi obat atau jamu yang dijual

bebas tanpa resep dokter

e. Perbanyak asupan makan bergizi

f. Pola hidup sehat dan cukup olahraga untuk meningkatkan daya tahan

tubuh.

Gambar 2.14 Respiratory Distress Syndrom (RDS)

3. Esophageal stenosis

Kelainan ini akan terjadi dekat kerongkongan yang akan

mempersempit kerongkongan. Penyempitan ini bisa diakibatkan oleh


25

trauma, pembedahan, peradangan kronis, dan radiasi. Stenosis esopagus

dapat menyebabkan kesulitan menelan, terutama makanan yang

padat. Pencegahan Untuk mencegah terjadinya kelainan ini maka perlu

dilaksanakan langkah-langkah berikut yakni konsultasi dengan dokter jika

terkena kelainan esophagus stenosisi atau penyempitan esopagus ini,

hindari konsumsi zat kaustik dan jauhkan zat korosif.

Gambar 2.15 esophagus stenosis

4. Extrahepatic biliary atresia

Disebabkan karena kegagalan dalam rekanalisasi duktus selama

perkembangan. Pencegahan untuk mencegah terjadinya kelainan ini maka

dilakukan tindakan kasai. Tindakan kasai adalah pengobatan utama bagi

kelainan ini. Pada tindakan ini saluran empedu yang telah rusak akan

diangkat dan akan diganti dengan bagian kecil dari usus. Sehingga, cairan

empedu dapat mengalir dengan normal. Ini bukanlah tindakan kuratif, tapi

paling tidak cairan empedu dapat mengalir ke usus. Dengan demikian,

dapat mengurangi gejala-gejala yang muncul, misalnya penyakit kuning.


26

Gambar 2.16 extrahepatic biliary atresia

5. Pankreas annular

Pankreas annular ini adalah kondisi langka dimana bagian kedua

duodenum dikelilingi oleh cincin jaringan pankreas yang terus berlanjut

dengan kepala pankreas. Bagian pankreas ini bisa menyempitkan

duodenum dan menghalangi atau mengganggu aliran makanan ke sisa

usus. Kita tidak bisa mencegah pankreas annular. Namun ada beberapa

langkah yang harus dilakukan saat kehamilan agar bayi yang sehat :

- Pertahankan diet sehat selama kehamilan termasuk buah-buahan,

sayuran, dan biji-bijian.

- Menemui dokter secara teratur untuk memeriksa prenatal

- Jangan mengonsumsi alcohol

- Jangan merokok bagi suami di dekat kehamilan.


27

Gambar 2.17 Pankreas annular


6. Imperforate anus

Anus imperforata adalah masalah dengan cara anus pada bayi atau

rektum terbentuk. Anus imperforata terjadi ketika tidak adanya

pembukaan di ujung saluran pencernaan atau tidak ada lubang di anus.

Saluran pencernaan mungkin akan berakhir di dalam kantong tertutup

di suatu tempat yang ada di dalam tubuh.

Gambar 2.18 imperforata Anus


28

7. Omphalocele

Omphalocele adalah cacat lahir di mana usus atau organ-organ

perut lain keluar dari pusar (pusar). Pada bayi dengan omphalocele,

usus hanya ditutupi lapisan tipis dan dapat dengan mudah dilihat.

Gejala dari Omphalocele dapat jelas terlihat, karena isi perut

menonjol melalui daerah pusar. Ada berbagai ukuran omphaloceles.

Omphalocele kecil, hanya usus menonjol. Omphalocele besar organ

yang menonjol meliputi hati atau limpa.

Pengobatan Omphaloceles dirawat dengan operasi. Apabila

kantung yang melindungi isi perut terjadi masalah lain yang lebih

serius (seperti cacat jantung) dokter akan menanganai masalah ini

lebih dulu. Untuk memperbaiki omphalocele, kantung ditutupi dengan

bahan sintetis khusus, yang kemudian dijahit. Perlahan-lahan, seiring

waktu, isi perut didorong ke dalam perut. Ketika omphalocele berada

sesuai dalam rongga perut, bahan sintetis akan diambil dan perut

ditutup.

Gambar 2.19 Omphalocele


29

BAB III
KAJIAN PENELITIAN TENTANG ENDODERM

REVIEW JURNAL KE-1


Nama Jurnal : Stem Cell Research
Judul Jurnal : Endothelial cells instruct liver specification of embryonic
stem cell-derived endoderm through endothelial VEGFR2 signaling and
endoderm epigenetic modifications
Penulis : Songyan Hana,1, Christopher Tanb, Junjun Dinga,
Jianlong Wanga, Avi Ma'ayanb, Valerie Gouon-Evansa
Penerbit, Tahun : Elsevier, 2018.

Isi Review
A. Pendahuluan
Endoderm hepatik murin berasal dari endoderm foregut ventral pada E7.5 dan
spesifik ke hepatoblas untuk membentuk kuncup hati di sekitar E8.25 melalui
pensinyalan FGF dan BMF yang disediakan oleh septum transversum yang
berdekatan dan mesoderm jantung (Deutsch et al., 2001; Gordillo et al., 2015;
Rossi et al., 2001). Bukti yang berkembang melaporkan peran kunci sel endotel
dalam memicu hati dari forodut endoderm. Memang, tunas hati tidak berkembang
tanpa adanya sel endotel fungsional pada embrio nol Flk-1 (Matsumoto et al.,
2001). Sejalan dengan penelitian ini, kami sebelumnya menunjukkan bahwa
spesifikasi hati endoderm yang diturunkan ESC tikus dikendalikan oleh sel
endotel, endoderm hepatic murine berasal dari endoderm foregut ventral pada
E7.5 dan spesifik ke dalam hepatoblas untuk membentuk kuncup hati di sekitar
E8. 25 melalui pensinyalan BMP dan FGF yang disediakan oleh septum
transversum dan mesoderm jantung yang berdekatan (Deutsch et al., 2001;
Gordillo et al., 2015; Rossi et al., 2001). Bukti yang berkembang melaporkan
peran kunci sel endotel dalam memicu nasib hati dari forodut endoderm. Memang,
tunas hati tidak berkembang tanpa adanya sel endotel fungsional pada embrio nol
Flk-1 (Matsumoto et al., 2001). Sejalan dengan penelitian ini, kami sebelumnya
menunjukkan bahwa spesifikasi hati endoderm yang diturunkan ESC tikus
30

dikendalikan oleh sel endotel melalui represi ganda jalur Wnt dan Notch (Han et
al., 2011). Meskipun ada bukti substansial yang mendukung peran instruktif sel
endotel untuk pembentukan dan spesifikasi kuncup hati, mekanisme yang
digunakan sel endotel bertindak tidak sepenuhnya dipahami.
Selama dekade terakhir ini, banyak penelitian telah memberikan bukti kuat
bahwa perkembangan banyak organ termasuk hati dikendalikan oleh modifikasi
epigenetik dengan membungkam atau menginduksi gen spesifik organ.
Modifikasi epigenetik termasuk metilasi DNA dan perubahan histone (Bernstein
et al., 2007; Goldberg et al., 2007) seperti metilasi, asetilasi, fosforilasi,
ubiquitinasi, dan penjumlahan yang memainkan peran penting dalam arsitektur
kromatin dan transkripsi hensgen. Biasanya histoneacetyltransferases (HATs)
membuka struktur kromatin dan mengaktifkan ekspresi gen, sedangkan
hipoasetilasi yang dikatalisis oleh histone deacetyltransferases (HDACs)
berkorelasi dengan pengurangan transkripsi atau pembungkaman gen (Sterner dan
Berger, 2000). Metilasi DNA dan histone dikatalisis oleh DNA methyltransferase
(DNMTs) dan Histone methyltransferase (HMTs) masing-masing diperlukan
untuk perekrutan HDAC, oleh karena itu terutama terkait dengan represi gen
(Vaissiere et al., 2008).
Baru-baru ini, beberapa penelitian telah mengaitkan tanda epigenetik spesifik
dengan perkembangan hati. Kontrol perbedaan garis keturunan sel hati oleh
modifikasi epigenetik histone dinamis telah dilaporkan dalam kultur ESC tikus
dan manusia (Kim et al., 2011; Snykers et al., 2009; Vanhove et al., 2016). Bukti
in vivo untuk fungsi tanda epigenetik dalam perkembangan hati sebagian besar
berasal dari penelitian pada ikan zebra dan tikus. Pada ikan zebra, KO dari dnmt1
(Anderson et al., 2009), dnmt2 (Rai et al., 2007), dnmt3b (Takayama et al., 2014)
atau co-factor dari DNMT1, uhrf1, (Mudbhary et al., 2014), mengarah pada
hipometilasi DNA dan mengubah perkembangan hati, menunjukkan bahwa
aktivitas DNMT diperlukan untuk pengembangan yang tepat. Di mouse, KO KO
kondisional dari Peningkat HMT dari zeste homolog 2 (Ezh2) dalam sel
endoderm Foxa3 + atau reduksi dari APP300dalamP300 +/oss
embryossignisisiakan secara signifikanmenurunkan ukuran kuncup hati pada
31

E9.5-10 disertai dengan berkurangnya angka hepatoblast (Xu et al, 2011). Efek
positif Ezh2 pada ekspansi hepatoblast didukung in vivo (Koike et al., 2014) dan
ex vivo mengikuti isolasi sel dan kultur kultur (Aoki et al., 2010). Namun peran
Ezh2 untuk perbedaan hepatoblast menjadi hepatosit berbeda tergantung pada
strategi KO in vivo (Koike et al., 2014) atau strategi knockdown ex vivo (Aoki et
al., 2010). Memang dilaporkan bahwa EZh2 knockdown mempromosikan
hepatoblas perbedaan menjadi hepatosit janin dengan mengatur faktor transkripsi
terkait dengan perbedaan hepatosit (Aoki et al., 2010).
Secara keseluruhan, spesifikasi hati adalah hasil dari cross-talk yang
kompleks antara forodut endoderm dan microenvironment untuk mengarah pada
endoder jaringan untuk mendapatkan modulasiepi genetik epigenetik pada
beberapa faktor kunci dan pada waktu-waktu tertentu. Dalam penelitian ini, kami
membedah lebih lanjut mekanisme di mana sel-sel endotel memicu spesifikasi
hati endoderm. Dengan menggunakan sistem ESC mouse in vitro yang telah kami
buat sebelumnya (Han et al., 2011), kami membandingkan profil transkriptome sel
endoderm hati yang diisolasi dari kultur dan sel endoderm yang dikultur sendiri,
dan menemukan bahwa sel endotel menginstruksikan spesifikasi hati endoderm
yang diturunkan ESC. melalui pensinyalan VEGFR2 endotel dan modifikasi
epigenetik endoderm.

B. Material dan Metode


1. Pemeliharaan dan perbedaan ESC
Garis ESC tikus yang digunakan adalah garis ketukan ganda dengan CD4
manusia yang ditargetkan ke lokus Foxa2 dan CD25 manusia ke lokus Foxa3
(Gadue et al., 2009). ESC dikultur pada 30.000 sel / ml untuk memungkinkan
pembentukan tubuh embrioid (EB) dalam media diferensiasi bebas serum (SFD)
ke dalam cawan petri dengan kelekatan rendah (Gouon-Evans et al., 2006). EB
hari-2 dipisahkan, dan 40.000 sel / ml sel dikumpulkan kembali di media SFD
yang dilengkapi dengan Activin-A (100ng / ml). EB Day5 dipisahkan dengan
0,25% trypsin / EDTA dan sel-sel endoderm (Foxa2 + / Foxa3 +) dimurnikan
dengan penyortiran sel dan disepuh pada pelat 48-sumur yang dilapisi matrigel
32

(80.000 sel / sumur) di hadapan atau tidak adanya sel endotel D4T ( 4000 sel /
baik) dalam media hati selama 3-8 hari (Gouon-Evans et al., 2006). Semua sitokin
kecuali Activin-A (PeproTech) dan bFGF (invitrogen) dibeli dari R&D Systems.

2. Alur sitometri dan penyortiran sel


EB hari ke 5 dipisahkan dengan 0,25% trypsin / EDTA. Sel-sel endoderm
dimurnikan dengan penyortir sel BDFACSAria II menggunakan antibodi anti-
hCD4-PE dan anti-hCD25-APC dan kemudian dikultur dalam media hati pada
pelat sumur p48 berlapis matrigel selama 3 hari. Kultur diferensiasi hari ke-8
dipisahkan dan diwarnai dengan antibodi anti-hCD4-PE dan antiCD31-APC
diikuti dengan penyortiran sel. Analisis aliran cytometry dilakukan dengan
menggunakan perangkat lunak FlowJo (Tree Star Inc). Antibodi tercantum dalam
Informasi Pendukung Tabel 1.

3. Pengurutan RNA yang mendalam dan analisis data


1μg RNA total kualitas tinggi dibuat dari hari ke-8 sel endoderm yang
dikultur sendiri atau dimurnikan hari-8 sel endoderm yang dikultur-purifikasi
menggunakanQiagenRNeasyPlusMicrokit. Deep RNA Sequencing dilakukan
pada Illumina Genome Analyzer (HiSeq 2500) di Genomics Core Facility di Icahn
School of Medicine di Mount Sinai. Sebanyak 24.373 transkrip dari seluruh
genom tikus dianalisis. Jumlah bacaan untuk setiap transkrip dan bacaan per
kilobase dari transkrip per juta bacaan yang dipetakan (RPKM) dihitung dan
ditugaskan untuk masing-masing transkrip (Data tambahan-data mentah RNA
pengurutan dalam). Duplikat dirata-rata dan dinormalisasi ke tingkat ekspresi
awal. Analisis ekspresi diferensial dilakukan dengan menggunakan DES dan
qtranskrip untuk analisis lebih lanjut dipilih hanya lima kali juga ditampilkan
setidaknya perubahan 2 kali lipat dan jumlah pembacaan baku> 100 dalam
setidaknya satu sampel. Gen yang ekspresinya berubah antara kelompok kultus
dan kelompok sendiri secara hierarkis berkerumun dengan Cluster 3.0 dan
divisualisasikan menggunakan TreeView. Analisis ontologi gen dilakukan dengan
33

Database untuk Anotasi, Visualisasi, dan Penemuan Terpadu (DAVID)


(http://david.abcc.ncifcrf.gov).

4. Imunostaining
Immunostaining CD31 dilakukan pada hari ke-13 sel yang mengalami
erensiasi setelah difiksasi dengan paraformaldehyde 4% dan pemblokiran dengan
blocking bufer (Dako) dengan inkubasi dengan antibodi CD31 selama 1 jam pada
suhu kamar diikuti dengan inkubasi dengan antibodi sekunder keledai anti-tikus
IgGA488. Sel kemudian permeabilisasi dengan 0,3% Triton X-100, diblokir, dan
secara berturut-turut diinkubasi dengan antibodi anti-AFP dan anti-Foxa2 pada
suhu 4 ° C semalam, diikuti oleh antibodi antirabbit keledai IgG-Cy3 dan antibodi
sekunder anti-kambing kambing Cy5. IgG tikus, kelinci atau kambing (untuk
CD31, AFP dan Foxa2) digunakan dalam kontrol negatif. Sel-sel yang bernoda
akhirnya diimbangi dengan DAPI dan divisualisasikan menggunakan mikroskop
fluoresen Leica dan gambar yang ditangkap menggunakan perangkat lunak Leica.
Antibodi tercantum dalam Informasi Pendukung Tabel 1.

5. Western blotting
Kultur diferensiasi hari ke-13 dipanen menggunakan 0,25% Trypsin /
EDTA. Protein lisat total diperoleh dengan analisis RIPA ditambah dengan
koktail penghambat proteinase. Lisis total difraksinasi pada gradien 4-12% SDS-
polyacrylamide gel gradien dan elektroblot pada membran PVDF. Deteksi
chemiluminescence dilakukan sesuai dengan instruksi pabrik (Millipore).
Antibodi tercantum dalam Informasi Pendukung Tabel 1.

6. Waktu QPCR
RNA secara terbalik ditranskripsi menjadi cDNA menggunakan kit
Sistem Sintesis Untai Pertama Superscript III (Invitrogen). Quantitative Real
TimePCR (qPCR) dilakukan dengan Roche System (LC480, Indianapolis, IN,
http://www.roche.com). Semua percobaan dilakukan dalam rangkap tiga
menggunakan campuran master Roche SYBR Green. Urutan primer tercantum
34

dalam Tabel Informasi Pendukung 2. Kuantifikasi relatif dihitung dengan


menggunakan metode siklus standar komposit (CT) dan dinormalisasi terhadap
dCT gen pemelihara rumah β-aktin.

7. Analisis statistik
Hasil ditunjukkan sebagai rata-rata ± SD. Untuk setiap kelompok, sampel
dari 3 atau 6 percobaan individu dianalisis, dan kelompok yang berbeda
dibandingkan menggunakan analisis uji-t. p <0,05 dianggap signifikan secara
statistik; *, p <.05; **, p <.01; dan ***, p <0,001.

8. Tabel sumber daya utama


Itu termasuk daftar antibodi (Tabel 1), primer (Tabel 2) dan molekul kecil
(Tabel 3).

C. Hasil
1. Analisis pelaporan transkrip memvalidasi spesifikasi hati endotel-
mediated cell endotel sel-sel endoderm yang diturunkan ESC
Penelitian kami sebelumnya menunjukkan bahwa spesifikasi hati dan
perluasan endoderm yang diturunkan ESC tikus dikendalikan oleh sel endotel
melalui represi ganda jalur Wnt dan Notch dalam sel endoderm (Han et al., 2011).
Untuk mengeksplorasi lebih lanjut mekanisme di mana sel-sel endotel
mempromosikan spesi fi kasi endoderm hati dan proliferasi sel, garis ESC reporter
tikus di mana hCD4 dan hCD25 masing-masing ditargetkan ke lokus Foxa2 dan
Foxa3 digunakan untuk melacak sel endoderm definitif (Gadue et al., Dengan
teliti. 2009). Sel-sel endoderm dihasilkan dengan adanya Activin-A dosis tinggi
dan dimurnikan dengan penyortiran sel pada hari ke-5 perbedaan dalam populasi
sel hCD4 + hCD25 + yang mewakili sel-sel Foxa2 + Foxa3 + seperti yang
dijelaskan sebelumnya (Han et al., 2011). Sel endoderm purifikasi dikultur selama
3 hari dalam medium hepatik baik sendiri (sel endoderm saja: AL End) atau
dengan adanya sel endotel mur4 D4T (sel endoderm kultur: CC End). Sel-sel
35

endotel D4T awalnya dihasilkan dari hari-4 kultur diferensiasi ESC tikus dan
selanjutnya diabadikan (Kennedy et al., 1997). Day-8 co-cultured endoderm dan
sel endotel dipisahkan dan dimurnikan menggunakan hCD4 sebagai pengganti
untuk penanda endoderm Foxa2 dan penanda endapan CD31 masing-masing
(Gbr. 1A). Penelitian kami sebelumnya memang menunjukkan bahwa sel-sel D4T
mengekspresikan penanda endotel CD31 dan Flk-1 / VEGFR2, sementara
penanda-penanda itu hampir tidak ada dalam sel hati hepatik yang diturunkan sel
hod4 + hCD25 + endoderm (Han et al., 2011). Sequencing RNA yang dalam
dilakukan pada hari ke-8 AL End dan CC End yang dimurnikan, dan profil
transkripnya dibandingkan. Dari 24.373 transkrip yang dipetakan, 2207 gen yang
diregulasi ke atas (> 2 kali lipat) dan 1761 gen yang diregulasi ke bawah (untuk
setidaknya 50%) diidentifikasi dalam CC End (Gbr. 1B). Analisis spesifikasi
jaringan menunjukkan bahwa di antara 2207 gen yang diregulasi, 479 secara
spesifik dibatasi pada hati (Gambar 1C), mengkonfirmasi penelitian kami
sebelumnya yang menunjukkan bahwa kultur sel endoderm ESCderived dengan
sel endotel secara spesifik lebih memilih spesifikasi hati daripada keputusan nasib
organ lainnya (Han et al. al., 2011). Contoh gen hepatik yang diatur naik adalah
protein alphafeto (Afp) dan transthyretin (Ttr), dua penanda perkembangan hati
awal (Gualdi et al., 1996; Makover et al., 1989) masing-masing dengan
peningkatan 182,32 dan 309,92 kali lipat. HNF4α, faktor transkripsi utama yang
mengatur spesifikasi epitel hati dan morfogenesis hati janin (Parviz et al., 2003),
diinduksi 43,75 kali lipat dalam kultur. Apolipoprotein (Apob, Apoc2, Apoa4,
Apom, Apoa1, Apoa2), yang banyak disintesis dalam hepatosit, sangat diinduksi
pada CC End dengan peningkatan 53,18-737 kali lipat (Gbr. 1D). Peta panas (Gbr.
1E) menunjukkan bahwa penanda endoderm beruntun primitif seperti CXCR4,
Sox17, Nodal, Eomes, Hhex, cKit dan Foxa3 sangat diperkaya pada hari ke-5 sel
endoderm yang dimurnikan, sedangkan penanda untuk spesifikasi hati (Afp,
pengkodean gen) untuk protein pengikat vitamin D Gc, Ttr, Onecut-1, Apob ...)
sangat diekspresikan pada hari ke-8 CC End. Gen yang terkait dengan inisiasi
pematangan hati termasuk Apoa2, Rbp4, Fgb, Apom, Fga juga diregulasi di CC
End. Meskipun ekspresi beberapa penanda maturasi hati (Alb, Itih2, C3, Vtn dan
36

F2) tetap rendah di CC End, level transkripnya lebih tinggi daripada di AL End
yang menunjukkan bahwa hari ke-8 CC End merekapitulasi tahap awal
diferensiasi hati seperti yang dijelaskan dalam penelitian kami sebelumnya (Han
et al., 2011). Analisis throughput tinggi ini mendukung penelitian kami yang
diterbitkan sebelumnya yang menunjukkan bahwa ceruk sel endotel
mempromosikan spesifikasi hati tikus (Han et al., 2011) dan memvalidasi
kegunaan sistem ESC tikus untuk membedah lebih lanjut proses spesiifikasi hati
endotelial yang diperantarai sel endotel.
2. Aktivasi VEGFR2 endotelial secara tidak langsung memediasi spesifikasi
hati endoderm
Mengingat bahwa sumbu VEGF / VEGFR2 adalah jalur kritis dalam
biologi sel endotel, kami menyelidiki dampak tidak langsung dari aktivasi
VEGFR2 endotel untuk spesi fi kasi endoderm hati. Ikatan VEGFA ke VEGFR2
dalam sel endotel mengaktifkan beberapa jalur pensinyalan hilir termasuk Ras /
MAPK, ERK1 / 2 / MAPK, FAK / paxillin, jalur PI3K / AKT dan Jak-STAT yang
memicu beberapa respons biologis yang terkait dengan angiogenesis seperti
proliferasi sel endotel, kelangsungan hidup , adhesi, dan migrasi (Vieira et al.,
2010). VEGFR2 / Flk-1 sangat diekspresikan dalam sel endotelus D4T tikus yang
digunakan dalam kultur bersama, sementara itu tidak ada pada endoderm hati
(Han et al., 2011). Untuk menyelidiki fungsi tidak langsung dari aktivasi
VEGFR2 endotel pada spesifikasi hati endoderm, tes penghambatan VEGFR2
dilakukan dengan menggunakan molekul kecil SU5416 (Fong et al., 1999),
penghambat ampuh dan selektif VEGFR2. Ko-kultur sel endoderm dengan sel
endotel D4T diobati dengan SU5416 dari hari ke-5 hingga hari ke-13 dalam media
hepar yang menghabiskan VEGF. Level transkrip dari empat gen hepatik Hnf4α,
Afp, Ttr dan Alb berkurang secara signifikan pada hari ke-13 di SU5416 yang
diobati dengan kultur kultur dibandingkan dengan mereka yang mengendalikan
cocultures yang diobati dengan DMSO (Gbr. 2A). Penurunan level transkrip Afp
di hadapan SU5416 konsisten dengan penurunan kadar protein Afp sebagaimana
dinilai dengan immunostaining dalam piringan (Gbr. 2B) dan secara kuantitatif
dengan western blotting (Gbr. 2C). Induksi ekspresi protein Afp pada CC End
37

versus AL End dikonfirmasikan dengan immunostaining (Gbr. 2B). Secara


keseluruhan, data ini menunjukkan bahwa aktivasi sumbu VEGF / VEGFR2
dalam sel endotel secara tidak langsung mempromosikan spesifikasi hati
endoderm.

3. Modifikasi epigenetik endoderm berhubungan dengan spesifikasi hati


endoderm endoderm yang diperantarai sel endotel
Untuk mengeksplorasi lebih lanjut mekanisme di mana sel-sel endotel mendorong
spesifikasi dan proliferasi hati endoderm, kami melakukan analisis ontologi gen
dari kedua set 2207 gen yang diregulasi ke atas dan 1761 gen yang diregulasi ke
bawah di CC End. Analisis ontologi menunjukkan bahwa gen yang diregulasi
sangat terkait dengan siklus sel dan replikasi DNA termasuk Ccna2, Ccnb1,
Ccnb2, Ccne1, Ccne2, Mki67, F2f1 dan Chek1 (Gbr. 3A). keluarga faktor
transkripsi; serta faktor transkripsi utama untuk keputusan nasib hepatik seperti
Hhex, faktor nuklir hepatosit (Hnf4, Hnf1α, Hnf1β) dan protein kotak Forkhead
(Foxa1, Foxa3, Foxm1, Foxo4) (Gbr. 3A), mendukung lagi peran kunci dari sel-
sel endotel dalam spesifikasi hati. Analisis fungsi menunjukkan bahwa sebagian
besar gen yang diregulasi naik secara signifikan diperkaya untuk gen yang terlibat
dalam homeostasis lipid, proses metabolisme glukosa dan metabolisme hormon
(Gambar 3A), yang merupakan fungsi utama hati. Menariknya, sejumlah besar
gen yang diatur naik di CC End terkait dengan modifikasi epigenetik termasuk
modifikasi kromatin dan metilasi DNA seperti DNA methyltransferases (Dnmt1,
Dnmt3b, Dnmt3a), histone methyltransferases (HMT seperti Ezh1 dan Suz12).
HAT1) dan deacetyltransferases (HDACs: Hdac10, Hdac5, dan Sirt1) (Gbr. 3A).
Sebaliknya, daftar gen yang diatur ke bawah diperkaya untuk gen yang
bertanggung jawab atas komitmen organ lainnya, seperti otak, plasenta, otot dan
jantung (Gambar 3B), memvalidasi peran terbatas sel endotel D4T dalam
keputusan nasib hepar endoderm. Jaringan gen yang diprediksi untuk gen yang
diregulasi ke atas dan gen yang diregulasi ke bawah di CC End dilakukan dengan
menggunakan -4 fold of4-foldor25% (Gbr.3C, D). Gen yang diregulasi atas sangat
38

terkait dengan faktor transkripsi yang penting untuk perkembangan hati (HNF4α)
, pertumbuhan jaringan (Esr1) atau pluripotency (Pou5f1).

Gambar. 1. co-kultur sel endotel mempromosikan spesifikasi hati endoderm. (A)


Ilustrasi desain eksperimental sel endoderm yang dipanen untuk pengurutan RNA
dalam. Hari ke-5 Sel Foxa2 + / Foxa3 + dikultur baik sendiri (AL End) selama 3
hari atau dikultur dengan D4Telepon selama 3 hari diikuti oleh selisih kultur dari
kultur pada hari ke 8 (CCEnd). (B) Peta panas meringkas tingkat transkrip relatif
dalam CC End (CC) versus AL End (AL). Setiap kelompok memiliki 2 sampel
dari 2 perbedaan independen. (C) Analisis ontologi gen dari gen yang diatur di CC
End. (D) Daftar dari 44 gen hati teratas yang diinduksi di CC End. (E) Peta panas
dalam sel endoderm hari ke-5, hari ke-8 CC Akhir dan hari8-AL Akhir
membandingkan ekspresi gen yang terkait dengan endoderm, spesi fi kasi hepatik,
dan pematangan.
39

Menariknya, banyak gen yang diprediksi terkait dengan modifikasi


epigenetik seperti HDACs (Hdac1, Hdac2, Hdac3, Hdac4 dan kompleks Sin3a
terkait), dan HMTs (Ezh2 dan Suz12 kompleks terkait) (Gbr. 3C), mendukung
hubungan yang erat antara modifikasi epigenetik dan spesifikasi endoderm yang
dimediasi sel endotel. Interaksi serupa juga dilaporkan antara jaringan gen yang
diatur ke bawah (Gbr. 3D), dan HDAC (Hdac1, Hdac2, Hdac3 dan Sin3a), HMTs
(Ezh2, Suz12 dan Eed), serta DNMTs (Dnmt1, Dnmt3a dan Ndmt3b) (Gbr. 3D)
mendukung lebih lanjut peran modifikasi epigenetik dalam spesifikasi endoderm
hepatic endoderm yang dimediasi sel.

4. Metilasi DNA, deasetilasi histone, dan demetilasi mendorong spesi fi kasi


hati
Untuk secara spesifik mengeksplorasi dampak metilasi DNA, asetilasi
histone dan metilasi pada spesifikasi hati endoderm yang dikolaborasikan dengan
sel D4T, molekul kecil yang memodulasi modifikasi epigenetik digunakan secara
individual dalam budaya. Mereka termasuk asam proval (VPA), C646, 5-Aza-2′-
deoxycytidine (5-aza), dan GSK126. VPA adalah inhibitor global untuk HDAC
kelas I dan II dengan mengikat pusat katalitik HDAC (Gottlicher et al., 2001).
C646 adalah inhibitor HAT reversibel khusus untuk p300 / CBP, yang bersaing
dengan asetil-KoA untuk kantong pengikat Lys-CoA p300 dan menekan asetilasi
histone H3 dan H4 (Bowers et al., 2010). 5-aza secara luas digunakan sebagai
inhibitor DNMT dan mengarah pada demetilasi DNA. Akhirnya, GSK126 adalah
molekul kecil yang sangat menghambat aktivitas HMT Ezh2 dan karenanya
menurunkan tingkat H3K27me3 global yang terkait dengan pembungkaman gen
(McCabe et al., 2012).
40

Gambar. 2. Memblokir pensinyalan VEGF oleh SU5416 menghambat spesifikasi


hati endoderm.
(A) Relativetranskrip tingkat-hari ke-13 dari
penandauntukmendapatkankodendepartusepanjang (Hnf4a), sertifikat heparasi
(AfpandTtr), danmaturasi (albumin, Alb) dalam selodimembiakan sel yang
dikultur sendiri atau sel-sel yang dikultur bersama yang diperlakukan dengan
DMSO atau SU5416. n = 6 perbedaan independen; * p <0,05, ** p <0,01, *** p
<0,001.
(B) Imunostaining pada hari ke-13 untuk Afp (merah) dan CD31 (hijau) dari sel
endoderm yang dikultur sendiri atau dikultur bersama dengan sel D4T dan diobati
dengan DMSO atau SU5416.
(C) Western blot dari ekspresi Afp pada hari ke-13 sel endoderm yang dikultur
yang diobati dengan DMSO atau SU5416.

Konsentrasi masing-masing molekul kecil dioptimalkan dengan hati-hati


untuk mencegah kematian sel yang disebabkan oleh pengobatan yang dapat
mempengaruhi spesifikasi hepatik. Jumlah sel total dan persentase sel CD31 +
D4T oleh flow cytometry ditentukan untuk setiap kondisi perawatan dan
selanjutnya jumlah sel endoderm diekstrapolasi (Gambar 4A). Jumlah sel
endoderm tidak berubah secara signifikan setelah perawatan VPA dan GSK126
yang menginduksi dua efek yang berlawanan pada spesi fi kasi hati yang dinilai
oleh gen hepatik dan ekspresi protein (Gbr. 4 B-H). Perawatan dengan C646 dan
5-Aza mengurangi jumlah sel endoderm sebanyak 2 kali lipat, meskipun kultur sel
tetap sehat. Keputusan nasib hepar diperiksa pada hari ke-13 dengan
mengevaluasi transkrip dan tingkat protein dari penanda hepatik. Dibandingkan
dengan DMSO, VPA sepenuhnya menghapus level transkrip Hnf4α, Afp, Ttr dan
Alb (Gbr. 4B), menunjukkan bahwa deasetilasi histone mempromosikan spesi fi
kasi hepatik. Akibatnya, protein Afp tidak terdeteksi dalam kultur koaksial yang
41

diobati dengan VPA sebagaimana dinilai dengan western blotting (Gbr. 4C) dan
immunostaining (Gbr. 4D: DMSO, 4E: VPA). Perawatan C646 dan 5-aza secara
signifikan menurunkan tingkat transkrip Hnf4α, Afp, Ttr dan Alb (Gbr.4B) serta
tingkat proprotein (Gbr.4C, F, G), walaupun tampaknya tidak sedramatis VPA.
Namun, memblokir Ezh2 dengan GSK126 menyebabkan peningkatan yang
signifikan dari tingkat transkrip Hnf4α, Afp, Ttr dan Alb (Gbr. 4B) dan
augmentasi protein Afp (Gbr. 4 C, H), yang mendukung etilasi histon, paling
mungkin H3K27me3, adalah keputusan untuk pengambilan keputusan
berdasarkan kebijakan. Secara keseluruhan, data kami menunjukkan bahwa sel
endotel secara tidak langsung memediasi spesi fi kasi hati melalui modifikasi
epigenetik dalam sel endoderm termasuk asetilasi histon, metilasi DNA dan
demetilasi histon.

D. Pembahasan
Memahami perkembangan hati adalah dasar untuk secara efisien
menghasilkan hepatosit fungsional dari kultur sel induk pluripotent (PSC).
Meskipun garis waktu perkembangan hati didefinisikan dengan baik, pembicaraan
silang antara sel endoderm hati prospektif dan ceruk sel yang berdekatan tetap
sulit dipahami. Ceruk sel endotel diakui sebagai pemain penting dalam perluasan
endoderm hati untuk membangun murine liver bud (Matsumoto et al., 2001), serta
dalam perbedaan hati endoderm turunan ESC yang dimediasi melalui represi
sinyal Wnt dan Notch (Han) et al., 2011). Penelitian ini lebih lanjut mengungkap
bahwa aktivasi VEGFR2 dalam sel endotel D4T diperlukan untuk
mempromosikan nasib sel hepatik dari endoderm yang diturunkan ESC tikus,
karena baru-baru ini dilaporkan pada kuncup hati 3D turunan PSC manusia (Camp
et al., 2017). Investigasi lebih lanjut diperlukan untuk mengidentifikasi
kesenjangan yang cross-link aktivasi VEGFR2 dalam sel endotel dan keputusan
nasib hati sel endoderm.
Perbandingan dari prokrip transkrip CC End dan AL End mengungkapkan
bahwa modulasi epigenetik endoderm dipicu oleh proses spesiifikasi hepatic yang
dimediasi sel endotel. Modulasi pengubah epigenetik dengan molekul kecil
42

menyediakan mekanisme dimana sel endotel secara tidak langsung memediasi


spesi fi kasi hepatik dalam sel endoderm melalui modifikasi epigenetik.
Mengingat bahwa efek target yang diinduksi oleh molekul kecil tidak dapat
sepenuhnya dikesampingkan, temuan ini perlu dikonfirmasi menggunakan cara
lain atau molekul kecil tambahan untuk memodulasi pengubah epigenetik.
Beberapa penelitian yang menggunakan sistem ESC in vitro atau embrio tikus in
vivo dan ex vivo telah mendukung atau melengkapi temuan kami. Menariknya,
waktu penggunaan molekul kecil yang mempengaruhi tanda epigenetik mengubah
nasib sel hati bervariasi. Sebagai contoh, Sodium butyrate, inhibitor HDAC
umum, berhasil digunakan dalam kultur ESC untuk mempromosikan perbedaan
hati ketika dimasukkan selama induksi endoderm (Duan et al., 2010; Hay et al.,
2008). Dalam studi ini, pengobatan dengan ramuan yang dicampur dengan sel
dengan HDAC, VPA, dicegah mereka berbeda dalam sel-sel hati AFP +,
menunjukkan bahwa HDAC mengerahkan peran yang berbeda pada berbagai
tahap perkembangan hati. Menghalangi aktivitas HAT P300 oleh C646 yang
menekan level transkrip gen endoderm hati. Temuan kami konsisten dengan
pengamatan kuncup hati kecil pada embrio P300 +/− pada E9.5 dan penurunan
ekspresi gen hepatik pada hepatoblas murni dari embrio ini (Xu et al., 2011).
Mirip dengan modifikasi asetilasi histon, status metilasi histon juga diubah dalam
sel endoderm yang menjalani spesi fi kasi dengan adanya sel endotel.
Menghalangi HMT Ezh2 dengan inhibitor spesifik GSK126 menyebabkan
ekspresi transkrip Hnf4α, Afp, Ttr dan Alb yang lebih tinggi dan protein Afp yang
menunjukkan bahwa demetilasi histone meningkatkan spesifikasi endoderm hati.
43

Gambar. 3. Modifikasi epigenetik memengaruhi spesifikasi hati endoderm. (A)


Gen ontologi (GO) dari analisis proses biologis pada gen yang diatur di sel CC
End. (B) ontologi gen (GO) analisis proses biologis pada gen yang diatur ke
bawah dalam sel CC End. (C) Jaringan gen yang diprediksi untuk gen teregulasi
atas dalam sel-sel CC End yang mengidentifikasi HDAC dan HMT. (D) Jaringan
gen yang diprediksi untuk gen yang diregulasi ke bawah dalam sel CC End
menunjukkan koneksi gen yang diatur ke bawah dengan HDACs, HMTs dan
DNMTs. (C, D) Faktor transkripsi ditunjukkan dengan warna merah; kinase
dalam co-faktor hijau dan transkripsional dengan warna kuning. Ukuran lingkaran
berkorelasi dengan jumlah interaksi dengan gen kandidat lainnya.

Hubungan antara metilasi histone dan gen master utama perkembangan hati
baru-baru ini dipelajari oleh beberapa kelompok. Ezh2 sangat diekspresikan
dalam hepatoblas pada E9.5 dan ekspresinya menurun selama pertumbuhan dan
pematangan hati janin hampir tidak terdeteksi pada E17.5, bayi baru lahir dan
dewasa (Koike et al., 2014), menunjukkan bahwa regulasi Ezh2 diperlukan untuk
perkembangan hati. Demikian pula, hati yang mengalami defisiensi HNF4α
menunjukkan peningkatan level transkrip Ezh2 yang terkait dengan penurunan
tingkat gen hepatik (Zhang et al., 2014), menunjukkan bahwa pemeliharaan
ekspresi Ezh2 memengaruhi pematangan hati negatif seperti yang terungkap
dalam penelitian kami saat ini. Namun, KO Ezh2 bersyarat dalam sel-sel
mengekspresikan Foxa3 menghasilkan hati kecil (Xu et al., 2011) menunjukkan
bahwa metilasi histone diperlukan untuk organogenesis hati yang tepat. Konflik
ini mungkin disebabkan oleh hasil yang kompleks dari KO Ezh2 pada beberapa
gen target dan secara tidak langsung pada beberapa tipe sel dalam hati.
44

Menariknya, memblokir metilasi DNA dengan 5-aza menurunkan semua level


transkrip gen hati yang diuji dalam penelitian ini. Metilasi DNA dimediasi melalui
DNMT dan biasanya dikaitkan dengan represi gen. Akibatnya, demetilasi 5-aza-
dimediasi DNA menghasilkan struktur kromatin terbuka, yang memungkinkan
aksesibilitas faktor transkripsi ke promotor dan peningkat untuk mengaktifkan
ekspresi gen (Christman, 2002). Di sini kami mengusulkan bahwa peran
penghambatan demetilasi DNA pada spesifikasi hati mungkin bertindak melalui
penghambatan gen yang menekan keputusan nasib hepatik. Konsisten dengan
temuan kami, ekspresi gen Foxa2 telah dilaporkan sangat dihambat oleh
pengobatan 5-aza atau knockdown DNMT3b selama pengembangan endoderm.
Gen Foxa2 menampilkan metilasi DNA tinggi di jaringan CXCR4 + (penanda
endoderm) dan metilasi DNA rendah di jaringan CXCR4- (Bahar Halpern et al.,
2014). Penelitian ini lebih lanjut mendukung temuan kami saat ini yang
menunjukkan bahwa ekspresi HNF4α ditekan oleh pengobatan 5-aza.

Gambar. 4. Deasetilasi histone, metilasi DNA dan demetilasi histone menginduksi


spesi fi kasi hati endoderm. (A) Jumlah sel endoderm pada hari ke-13 dikultur
bersama dengan sel D4T dan diobati dengan inhibitor untuk modifikasi
45

epigenetik. n = 3 perbedaan independen; * p <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001. (B)


KuantitatifRT-PCRanalisis pada hari ke-13 dari gen yang berkaitan dengan
antibodi statik (Hnf4α), sertifikasi hepar (AfpandTtr), dan maturasi (Alb) di sel-
sel otak dikoordinasikan dengan sel D4T dan diobati dengan inhibitor untuk
modifikasi epigenetik. n = 6 perbedaan independen; * p <0,05, ** p <0,01, *** p
<0,001. (C) Western blot dari ekspresi Afp pada hari ke-13 sel endoderm yang
dikulturkan yang diobati dengan DMSO atau inhibitor modifikasi epigenetik. (D –
H) Imunostaining untuk Afp dan Foxa2 dari sel endoderm yang dikultur pada hari
ke-13 yang diobati dengan DMSO atau inhibitor.

E. Kesimpulan
Sistem kultur kultur berbasis ESC tikus kami menawarkan platform yang
efisien untuk membedah pembicaraan silang antara sel endotel dan sel endoderm
berdasarkan spesifikasi hati awal. Studi-studi ini menyediakan mekanisme dengan
sel endotel yang mempromosikan spesifikasi hati sel endoderm secara otonom
non sel melalui aktivasi VEGFR2 endotel dan modifikasi epigenetik endoderm.
Temuan kami menyediakan alat baru untuk mengoptimalkan protokol spesifikasi
hati PSC untuk menghasilkan sel-sel hati fungsional untuk aplikasi pra-klinis dan
klinis terapi sel berbasis PSC untuk penyakit hati (Han et al., 2018).
46

REVIEW JURNAL 2
Judul :
OSKM Induce Extraembryonic Endoderm Stem Cells in Parallel to Induced
Pluripotent Stem Cells

(OSKM Menginduksi Sel Punca Endoderm Extraembryonik secara Paralel dengan


Sel Punca Pluripotent Terinduksi).

Penulis : Anthony Parenti, Michael A. Halbisen, Kai Wang, Keith Latham, and
Amy Ralston.

Jurnal : Stem Cell Reports j Vol. 6 j 447–455 j April 12, 2016.

Ringkasan

Faktor-faktor pemrograman ulang OCT4, SOX2, KLF4, dan MYC (OSKM) dapat
mengaktifkan kembali jaringan pluripotency dalam sel yang terdiferensiasi secara
terminal, tetapi juga mengatur ekspresi gen non pluripotency dalam konteks lain,
seperti endoderm primitif mouse. Endoderm primitif adalah garis keturunan
ekstraembrionik yang didirikan sejajar dengan epiblas pluripoten dalam
blastokista, dan merupakan kumpulan progenitor untuk sel batang endoderm
ekstraembrilik (XEN). Kami menunjukkan bahwa OSKM menginduksi ekspresi
gen endodermal, yang mengarah pada pembentukan sel-sel XEN terinduksi
(iXEN), yang memiliki sifat-sifat kunci sel-sel XEN yang diturunkan blastokista,
termasuk morfologi, profil transkripsi, pembaruan diri, dan multipotensi. Data
kami menunjukkan bahwa sel iXEN muncul secara paralel dengan sel induk
berpotensi majemuk yang diinduksi, menunjukkan bahwa OSKM mendorong sel
ke dua nasib sel yang berbeda selama pemprograman ulang.

Pengantar
Peran mempromosikan-pluripotency dari faktor pemrograman ulang
OCT4, SOX2, KLF4, dan MYC (OSKM) sangat dihargai. Namun, faktor-faktor
pemrograman ulang ini juga mempromosikan ekspresi gen non-pluripotency.
Misalnya, OCT4 (Pou5f1) secara langsung mempromosikan ekspresi gen yang
penting untuk endoderm primitif tikus (Aksoy et al., 2013; Frum et al., 2013; Le
47

Bin et al., 2014), garis keturunan ekstraembrionik yang terdapat dalam blastokista,
SOX2 secara tidak langsung mempromosikan ekspresi gen endoderm primitif
dalam blastokista tikus (Wicklow et al., 2014), KLF4 dapat mengatur ekspresi gen
endoderm primitif dalam blastokista tikus (Morgani dan Brickman, 2015), dan
MYC mengatur gen endodermal dalam fibroblast dan sel batang embrionik (ESC)
(Neri et al., 2012; Smith et al., 2010). Pengamatan ini meningkatkan kemungkinan
bahwa OSKM menginduksi ekspresi gen endodermal dalam sel somatik. Untuk
mendukung ide ini, beberapa kelompok telah melaporkan bahwa gen endodermal,
seperti Gata6, Gata4, dan Sox17, diregulasi dalam protokol yang digunakan untuk
memprogram ulang blast untuk menginduksi sel induk berpotensi majemuk
(iPSCs) (Hou et al., 2013; Serrano et al., 2013) ., 2013; Zhao et al., 2015).
Namun, tidak ada konsensus apakah endodermal ekspresi gen
mempromosikan atau memusuhi perolehan kemajemukan. GATA4 dan GATA6
dilaporkan dapat menggantikan OCT4 untuk menghasilkan iPSCs (Shu et al.,
2013, 2015), dengan alasan bahwa gen endodermal mendorong akuisisi
pluripotency. Konsisten dengan ini, gen endodermal dilaporkan diekspresikan oleh
sel ketika mereka menjadi pluripoten selama pemrograman ulang kimia (Hou et
al., 2013; Zhao et al., 2015). Sebaliknya, bukti lain menunjukkan bahwa gen
endodermal menentang pluripotensi selama pemrograman ulang. Sebagai contoh,
Gata4 mengganggu akuisisi pluripotency selama pemrograman ulang OSKM
(Serrano et al., 2013), Gata6 diekspresikan dalam beberapa sel yang diprogram
ulang sebagian (Mikkelsen et al., 2008), yang dianggap terjebak dalam keadaan di
antara perbedaan dan pluripotent (Meissner et al., 2007), dan knockdown Gata6
menyebabkan peningkatan ekspresi Nanog dalam sel-sel ini (Mikkelsen et al.,
2008). Dengan demikian, gen endodermal telah digambarkan sebagai indikator
pemrograman ulang yang tidak lengkap. Di sini, kami menunjukkan bahwa
OSKM mendorong sel di sepanjang dua jalur yang berbeda dan paralel, satu
pluripotent dan satu endodermal.
48

Hasil Dan Diskusi


Hasil penelitian menunjukkan kemiripan yang luas antara garis sel stem
endoderm ekstraembrionik (XEN) yang diturunkan blastokista dan garis sel yang
diturunkan MEF yang selanjutnya kami sebut sebagai sel XEN terinduksi (iXEN).

Gambar 1. Sel XEN yang Diinduksi OSKM Bangkit selama Pemrograman


Ulang

Keterangan Gambar 1
A. Fibroblast diprogram ulang (Takahashi dan Yamanaka, 2006), dan
diperiksa 18 hari setelah infeksi OSKM.
B. Frekuensi di mana koloni sel iPSC dan iXEN diamati. Bar kesalahan
menunjukkan SE di antara masing-masing tiga pemrograman ulang.
C. Morfologi sel iXEN mirip dengan sel XEN yang diturunkan blastokista.
D. Analisis sitometrik aliran menunjukkan bahwa protein endodermal
terdeteksi pada dasarnya semua sel XEN dan iXEN (mewakili tiga jalur sel
XEN dan iXEN yang diturunkan secara independen; tanda kurung, lihat
Gambar S1C).
E. Analisis penskalaan multidimensi dari 100 gen yang diekspresikan paling
bervariasi menunjukkan bahwa garis sel iXEN dan XEN sangat mirip,
49

terlepas dari media kultur, dan berbeda dengan MEFs dan garis sel induk
berpotensi majemuk (Ichida et al., 2009).
F. Plot gunung berapi menunjukkan gen yang tingkat ekspresi rata-ratanya
berbeda secara signifikan (FDR> 0,05, garis putus-putus merah) antara
garis sel XEN dan iXEN di setiap media kultur sel.

Ekspresi OSKM tidak terdeteksi dalam sel iXEN, konsisten dengan


pembungkaman transgen. Analisis jalur dan ontologi gen (GO) dari gen yang
diekspresikan secara berbeda mengidentifikasi defisiensi dalam ekspresi
fosforilasi oksidatif dan gen metabolisme glutathione dalam sel iXEN yang
dikultur dalam medium ESC tidak lengkap dibandingkan dengan yang tumbuh
dalam media sel XEN, yang dapat menunjukkan defisiensi Proliferasi sel iXEN
tanpa faktor pertumbuhan. Tidak ada jalur yang diperkaya secara signifikan di
antara gen yang diekspresikan secara berbeda ketika sel XEN dan iXEN dikultur
dalam media sel XEN. Dengan demikian, sementara lebih banyak perbedaan
transkripsi antara garis sel iXEN, XEN, MEF, dan pluripoten dapat menjadi jelas
dengan pengambilan sampel biologis yang lebih dalam, kami menyimpulkan
bahwa transkripom sel iXEN dan XEN sangat mirip, dan bahwa media sel XEN
lebih baik mendukung konversi MEFs menjadi XEN- seperti sel, konsisten
dengan peran pensinyalan FGF4 dalam mempromosikan perkembangan endoderm
primitif in vivo.

MEF-Berasal Sel XEN Bagian dari Sel Punca


Dari hasil evaluasi pembaruan diri dan multipotency jalur sel iXEN.
Dalam hal pembaruan diri, baris sel Ixen Karena sel XEN blastokista yang
diturunkan dapat berdiferensiasi menjadi endoderm visceral (VE) atau parietal
endoderm (Pare), peneliti mengevaluasi multipotency sel iXEN. Selama VE
diferensiasi assay (Gambar 2B), baris sel iXEN mampu membedakan untuk VE,
dibuktikan dengan epitelisasi, isasi lokal-E-cadherin (CDH1) pada batas sel
(Gambar 2C), dan peningkatan regulasi VE penanda (Gambar 2D). Untuk
mengevaluasi diferensiasi Pare, kami membuat chimera dengan XEN dan baris sel
iXEN. ESC dan IPSC garis yang digunakan dalam kontrol positif paralel. Dalam
chimera diperiksa antara embry- hari onic 7,5 dan 8,5, ESCs dan iPSCs kontribusi
50

terhadap keturunan epiblast, sementara sel-sel XEN kontribusi terhadap pare


dengan gelar yang diharapkan dan frekuensi (Angka 2F dan S2). sel iXEN dikultur
dalam medium ESC tidak lengkap tidak berkontribusi chimera, meskipun sel-sel
XEN dibiakkan dalam media ESC tidak lengkap lakukan. Namun, baris sel iXEN
dikultur dalam medium sel XEN berkontribusi Pare (Angka 2F dan 2G) sampai
batas yang sama seperti sel XEN, menunjukkan bahwa sel-sel iXEN berbudaya di
FGF4/ HEP memiliki potensi perkembangan XEN sel-seperti in vivo. Pengamatan
ini menggarisbawahi pentingnya FGF4/HEP untuk akuisisi fungsi sel iXEN. Hasil
ini juga menunjukkan bahwa sel-sel iXEN berbeda dari sel totipoten diisolasi dari
kultur sel pluripotent, karena sel iXEN tidak berkontribusi pada garis keturunan
epiblast atau trofoblas.

Gambar 2. Sel iXEN Memperbarui Sendiri dan Multipoten


Gen endodermal dilaporkan diregulasi sebelum gen pluripotensi dalam kultur
MEF yang menjalani pemrograman ulang molekul kecil, tetapi tidak selama
pemrograman ulang OSKM. Namun, kami mengamati sel GATA6-positif 6 hari
setelah infeksi OSKM (Gambar 3A). Selain itu, analisis qPCR menunjukkan
bahwa gen endodermal, seperti gen pluripotency, semakin diregulasi selama 20
hari program pemrograman ulang OSKM (Gambar 4A), tetapi ini tidak
51

menyelesaikan apakah gen endodermal diekspresikan dalam nenek moyang iPSC


atau dalam populasi yang berbeda. Oleh karena itu kami menggunakan aliran
cytometry untuk menentukan apakah NANOGpositif, pra-iPSCs (Bar-Nur et al.,
2015) menyatakan protein endodermal (GATA6 atau SOX17) selama
pemrograman ulang.
Peneliti mendeteksi NANOG dan protein endodermal dalam dua populasi
yang berbeda yang meningkat dalam ukuran selama pemrograman ulang (Gambar
4B dan S3A-S3C). Tidak ada populasi yang lazim di MEFs yang menjalani
pemrograman ulang tiruan (Gambar S4A), tetapi kedua populasi itu hadir dan
berbeda dalam TTF selama pemrograman ulang OSKM (Gambar S4B).
Pengamatan ini menunjukkan bahwa gen endodermal tidak diekspresikan dalam
sel pluripoten selama pemrograman ulang OSKM, berbeda dengan bukti bahwa
MEFs menjalani transisi pemrograman ulang kimia melalui keadaan seperti XEN
(Zhao et al., 2015). Untuk menyelidiki lebih lanjut apakah transisi iPSC melalui
keadaan seperti XEN selama pemrograman ulang OSKM, kami menggunakan
penelusuran garis keturunan. Kami memprogram ulang MEF secara retroviral
yang membawa Cre di bawah kendali promotor Sox17 (Liao et al., 2009) dan
seorang reporter tomat Tox-stop-lox-tdTomato yang sensitif terhadap CRE
(Madisen et al., 2010). Kami memperkirakan bahwa jika iPSC mengekspresikan
gen endodermal selama pemrograman ulang, maka sebagian besar iPSC akan
tdTOMATO-positif 20 hari setelah infeksi OSKM karena SOX17 sangat dan
homogen diekspresikan dalam sel iXEN / XEN (Gambar 1D). Namun, kami
mengamati bahwa hampir semua sel SSEA1-positif adalah tdTOMATO negatif
(Gambar 4C dan S3D), menunjukkan bahwa sebagian besar sel pluripoten tidak
mengekspresikan Sox17 selama pemrograman ulang. Secara keseluruhan,
pengamatan kami menunjukkan bahwa selama pemrograman ulang OSKM, gen
endodermal diregulasi dalam sel yang sebagian besar berbeda dari yang menjadi
pluripoten. Selain itu, pengamatan kami menunjukkan bahwa pluripotensi dan
jalur XEN adalah paralel selama pemrograman ulang OSKM, berbeda dengan
serial, jalur XEN-ke-iPSC yang mendominasi pemrograman ulang kimia (Zhao et
al., 2015). Selain itu, sel-sel mirip-XEN yang diperoleh selama pemrograman
52

ulang kimia tidak dapat dipertahankan dalam medium sel XEN (Zhao et al.,
2015), menyoroti perbedaan mendasar dalam sel yang dihasilkan oleh
pemrograman ulang kimia dan OSKM.

Gambar 3. OSKM menginduksi Nasib Sel iXEN pada MEF

Keterangan :
(A) GATA6 Nuklir, tetapi bukan NANOG, dalam koloni iXEN yang baru lahir
pada hari ke 6 pemrograman ulang OSKM (dibandingkan dengan sel XEN dan
kontrol ESC). Panah menunjuk ke protein nuklir. Bilah skala, 100 mm. (B)
Lineage tracing menunjukkan bahwa sel iXEN tidak berasal dari koloni iPSC
selama pemrograman ulang OSKM dari MEF (mewakili dua percobaan). (C)
Pengukuran qPCR absolut nomor salinan OSKM dalam DNA genom sel XEN /
iXEN. (D) Perbandingan frekuensi koloni sel iXEN / iPSC setelah ekspresi
berlebih retroviral atau transgenik OSKM pada hari ke-18 pemrograman ulang.
Bilah galat menunjukkan SE; dua garis sel, masing-masing empat percobaan.
53

Gambar 4. Gen Endodermal yang Dinyatakan MEF Mempromosikan


Nasib Sel iXEN
Keterangan :
(A) endodermal (baris atas) dan pluripotency (baris bawah) gen diregulasi selama
OSKM pemrograman ulang retroviral dari MEFs, diukur dengan qPCR.
Kesalahan bar menunjukkan SE antara tiga reprogrammings dan empat qPCRs.
(B) Arus cytometry analisis MEFs selama OSKM pemrograman ulang
menunjukkan bahwa sel-sel mantan menekan endodermal dan pluripotency teins
pro sebagian besar berbeda. Kesalahan bar menunjukkan SE antara dua
percobaan (lihat juga gambar S3A-S3C dan S4).
(C) Sox17Cre keturunan pelacakan dan mengalir cy- tometry analisis sel 20 hari
setelah infeksi OSKM dari MEFs, menunjukkan bahwa sebagian besar
pluripotent (SSEA1-positif) sel tidak pernah menyatakan Sox17. Kesalahan bar
menunjukkan SE antara tiga reprogrammings (lihat jugaGambar S3D).
(D) Proporsi IPSC dan iXEN sel onies kumpulkan setelah koinfeksi dari MEFs
dengan OSKM dan shRNA konstruksi. Kesalahan bar menunjukkan SE antara
tiga reprogrammings (lihat jugaGambar S3E).
(E) Model mengusulkan bahwa ekspresi GATA6 endogen dapat mendorong sel-
sel ke arah baik IPSC a tau iXEN nasib selama pemrograman ulang.
54

Kesimpulan
Akhirnya, kami menguji persyaratan untuk gen endodermal dalam
pembentukan sel iXEN, dengan harapan bahwa penurunan ekspresi gen
endodermal akan menurunkan proporsi sel iXEN. Kami pertama kali
mengonfirmasi knockdown substansial Gata6, Gata4, Sox17, atau Sox7 dalam sel
XEN yang telah mapan melalui transfeksi plasmid pengkodean pengkodean RNA
(shRNA) hairpin kecil (Gambar S3E). Kami kemudian menginfeksi MEF dengan
shRNAs selama pemrograman ulang. Knockdown dari Gata6 atau Gata4
menyebabkan penurunan 2 kali lipat dalam jumlah koloni sel iXEN yang
diperoleh (Gambar 4D), menunjukkan bahwa gen ini diperlukan untuk nasib sel
iXEN. Khususnya, knockdown Gata6 juga menyebabkan peningkatan yang
signifikan dalam jumlah koloni iPSC. Dengan demikian, ekspresi gen endodermal
mengganggu pluripotensi selama pemrograman ulang OSKM. Kami mengusulkan
bahwa ekspresi heterogen GATA6 dalam MEF (Gambar 4B) dapat berkontribusi
pada hasil yang berbeda selama pemrograman ulang Gambar 4E). Atau,
perbedaan stokastik dalam waktu terjemahan atau lokalisasi nuklir dari faktor-
faktor pemrograman ulang dapat mempengaruhi nasib sel. Akhirnya, pengamatan
kami menunjukkan bahwa pluripotensi paralel dan jalur XEN bersaing satu sama
lain, bukannya saling mendukung, selama pemrograman ulang. Sebaliknya,
pensinyalan parakrin dari sel-sel epiblast pluripoten mendukung pembentukan
progenitor sel XEN dalam blastokist, tetapi bukti kami tidak mendukung model
ini selama pemrograman ulang. Kami mengantisipasi bahwa identifikasi
mekanisme tambahan yang mengatur keseimbangan antara sel iXEN dan nasib
iPSC akan menginformasikan upaya masa depan untuk mengkarakterisasi
langkah-langkah molekuler dari spesifikasi nasib sel, dan mengarah pada
pembentukan model genetik baru gangguan reproduksi (Parenti, Halbisen, Wang,
Latham, & Ralston, 2016).
55

REVIEW JURNAL 3

Jurnal :
Cripto is required for mesoderm and endoderm cell allocation during mouse
gastrulation
(Cripto diperlukan untuk mesoderm dan endoderm alokasi sel selama gastrulasi
tikus)

Penulis : Jiu-Zhen Jin, Jixiang Ding


Jurnal : Developmental Biology 381 (2013) 170–178

Ringkasan
Selama gastrulasi tikus, sel-sel dalam garis primitif menjalani transformasi
mesenchymal epitel dan sel-sel mesenchymal yang dihasilkan bermigrasi keluar
secara lateral untuk membentuk mesoderm dan endoderm definitif di seluruh
silinder embrionik. Mekanisme yang mendasari spesifikasi, migrasi, dan alokasi
mesoderm dan endoderm kurang dipahami. Dalam studi ini, kami fokus pada
fungsi mouse Cripto, anggota keluarga gen EGF-CFC yang sangat diekspresikan
dalam garis primitif dan migrasi sel mesoderm pada hari embrionik 6.5. Inaktivasi
kondisional Cripto selama gastrulasi menyebabkan beragam defek pada
perkembangan mesoderm dan endoderm. Embrio mutan menampilkan akumulasi
sel mesenkhim di sekitar garis primitif pendek yang menunjukkan persyaratan
fungsional Cripto selama pembentukan lapisan mesoderm dalam gastrulasi. Selain
itu, beberapa embrio mutan menunjukkan pembentukan yang buruk dan alokasi
abnormal sel endoderm definitif pada hari embrionik 7.5. Secara konsisten,
banyak embrio mutan yang bertahan hingga hari 8.5 embrionik menunjukkan
cacat pada penutupan ventral endoderm usus yang menyebabkan kardia bi fi da.
Analisis terperinci mengungkapkan bahwa baik jalur Fgf8-Fgfr1 dan aktivasi p38
MAP kinase sebagian dipengaruhi oleh hilangnya fungsi Cripto. Hasil ini
56

menunjukkan peran penting bagi Cripto selama gastrulasi tikus, terutama dalam
pembentukan dan alokasi mesoderm dan endoderm.

Pengantar
Sebelum gastrulasi, sel-sel embrionik tikus diatur ke dalam struktur
silindris yang disebut silinder telur yang terdiri dari dua lapisan, epiblas bagian
dalam (juga dikenal sebagai ektoderm embrionik) dan endoderm visceral luar
(Beddington dan Robertson, 1999; Tam dan Behringer, 1997) . Pada awal
gastrulasi, sel-sel di satu sisi epiblast delaminate dan menjalani transisi
mesenchymal epitel (EMT) mengarah ke pembentukan area yang dapat dibedakan
secara morfologis yang disebut garis primitif (Beddington dan Robertson, 1999;
Tam dan Loebel, 2007). Garis primitif yang muncul meluas ke arah distal dan
membentuk struktur karakteristik yang disebut simpul di ujung distal (Beddington,
1994; Tam dan Loebel, 2007). Ujung anterior primitif beruntun (APS), dan
kemudian simpul, berfungsi sebagai pengatur batang yang mampu menginduksi
daerah posterior ketika ditransplantasikan ke embrio inang (Beddington, 1994).
Anterior visceral endoderm (AVE), yang terletak di daerah anterior embrio, sangat
penting untuk pembentukan dan pola saraf anterior (Beddington, 1998;
Beddington dan Robertson, 1998, 1999; Kimelman, 2006; Shawlot et al., 1999;
Thomas et al., 1998). Sementara meluas ke ujung distal embrio, sel-sel garis
primitif juga bermigrasi keluar secara lateral untuk membentuk lapisan mesoderm
antara endoderm visceral dan epiblas, yang selanjutnya akan ditentukan untuk
mesoderm jantung dan lateral, mesoderm aksial, mesoderm aksial dan mesoderm
parsial ( Harvey, 2002; Lawson et al., 1991; Shawlot et al., 1999; Tam dan
Behringer, 1997; Tam dan Tan, 1992). Setelah migrasi dan alokasi sel mesoderm,
sel endoderm definitif juga bermigrasi keluar dari lapisan primitif untuk
membentuk jaringan dan organ yang diturunkan endoderm seperti usus (Tam et
al., 2007). Selain itu, sel-sel dari lapisan primitif juga bergerak secara proksimal
untuk membentuk mesoderm ekstra-embrionik (Downs et al., 2004).
57

Banyak signaling dan faktor regulasi telah ditemukan untuk


terlibat pada awal induksi embrio dan pola. Di antara mereka,
komponen jalur nodal dan Wnt sangat penting. Nodal, anggota dari
superfamili TGF-β, dan transduser intraseluler yang, Smad2 dan Smad3,
diperlukan untuk berbagai aspek kegiatan embrio awal seperti AP Kerja
membentuk lishment, mesoderm dan endoderm induksi dan pola, dan
pembentukan aksial garis tengah (Brennan et al., 2001 dkk) Secara
konsisten, hilangnya Nodal inhibitor seperti Drap1 dan Lefty1 hasil
aktivitas nodal tinggi dan streak primitif diperluas serta kelebihan
mesoderm pada tikus (Iratni et al., 2002; Meno et al., 1999). Hilangnya
fungsi β-catenin pada tikus mempengaruhi pembentukan AVE serta streak
primitif dan turunannya (Huelsken et al., 2000), Sedangkan mutasi gen
Wnt3 menghapuskan hanya streak primitif tanpa mempengaruhi
pembentukan AVE (Liu et al., 1999). Menariknya, AVE menginduksi
pembentukan saraf anterior yang menghasilkan Nodal dan Wnt antagonis
seperti Cer1 dan DKK1 menunjukkan bahwa penekanan kegiatan Nodal dan
Wnt di epiblast anterior sangat penting untuk pembentukan kepala dan pola
(Glinka et al., 1998; Mao et al., 2001; Piccolo et al., 1999; Semenov et
al.,2001). Oleh karena itu, regulasi spasial dan temporal yang tepat
dari nodal dan aktivitas Wnt adalah penting untuk induksi embrio dan
ing pola yang ada. jalur tambahan dan faktor penting untuk awal
pembentukan pada embrio tikus termasuk Shh (Chiang et al., 1996),
BMP dan antagonis mereka Chordin dan Noggin (Bachiller et al.,
2000; Fujiwara et al., 2002; Hogan, 1996), Transkripsi faktor Lhx1
(Shawlot dan Behringer 1995; Shawlot et al., 1999), Foxa2 (Ang dan
Rossant 1994), Mixl1 (Hart et al., 2002) dan banyak lagi (Tam dan Loebel
2007).
Dibandingkan dengan induksi mesoderm dan pola, sedikit yang
diketahui tentang migrasi dari mesoderm dan endoderm. The Fgf8-
58

Fgfr1 jalur memainkan peran sentral dalam mendorong migrasi sel


mesoderm dan dimediasi, setidaknya sebagian, oleh transkripsi
faktor Snai1 dan Tbx6 (Ciruna dan Rossant 2001; Deng et al., 1994; Sun
et al., 1999; Yamaguchi et al., 1994). Dalam jalur ini, Snai1 terutama
bertanggung jawab untuk EMT, karena mampu menekan E-Cadherin
ekspresi gen (Barrallo-Gimeno dan Nieto 2005; Batlle et al., 2000; Cano
et al., 2000) Dan yang lebih penting, Snai1 embrio tikus mutan
membentuk lapisan antara epiblast dan endoderm visceral, dari
mana sel-sel epitel lebih dari mesenchymal dalam karakter dan
mempertahankan ekspresi E-Cadherin, menunjukkan kebutuhan
fungsional Snai1 untuk EMT selama gastrulasi (Carver et al., 2001).
Karena sebuah intervensi lapisan sel epitel masih terbentuk di Snai1
embrio tikus mutan, tampak bahwa migrasi sel dari lapisan primitif
belum tentu tergantung pada EMT. Studi dengan p38 berinteraksi
protein (p38IP) mengungkapkan bahwa aktivasi p38 MAP kinase
diperlukan untuk yang efisien EMT di streak primitif dan migrasi
lateral yang selanjutnya sel mesoderm (Zohn et al., 2006).
Pengamatan ini konsisten dengan laporan sebelumnya yang p38-α
MAP kinase diperlukan untuk angiogenesis bercabang embrio, proses
invol- Ving migrasi sel endotel (Adams et al., 2000; Mudgett et al.,
2000). Aktivasi jalur p38-dimediasi dalam streak primitif membutuhkan
p38IP dan NCK berinteraksi kinase (NIK), tetapi independen dari Fgf8
signaling. Selain itu, Eomesodermin diperlukan untuk EMT selama
gastrulasi mouse yang independen dari jalur Fgf8 (Arnold et al., 2008).
Namun, hubungan-kapal antara Eomesodermin dan jalur p38 belum
dilaporkan.

Cripto adalah anggota pendiri EGF-CFC keluarga dan berfungsi


sebagai co-faktor penting untuk beberapa anggota superfamili TGF-β
59

seperti Nodal selama vertebrata embriogenesis (Dono et al., 1993;


Schier dan Shen, 2000; Shen, 2007; Shen dan Schier, 2000; Shen et
al., 1997). Cripto bertindak baik sebagai ligan dan co-reseptor dalam
memfasilitasi Nodal signaling (Yan et al., 2002). Selain itu, Cripto dapat
memblokir fungsi Aktivin, juga anggota TGF-β keluarga super, dengan
membentuk kompleks dengan reseptor tipe II nya (Gray et al., 2003).
Selama perkembangan mouse, Cripto awalnya dinyatakan dalam
epiblast sebelum gastrulasi (Ding et al., 1998). Selama lation gastru-,
Cripto sangat disajikan dalam streak primitif, migrasi mesoderm,
node dan mesendoderm aksial (Chu et al., 2005; Ding et al., 1998).
Dalam embrio mutan Cripto-null, calon AVE adalah ditentukan dalam
ujung distal, tetapi tidak mampu anterior migrasi (Ding et al., 1998).
Demikian pula, calon penyelenggara batang dimulai pada akhir
proksimal dari epiblast, tetapi gagal untuk mentranslokasi ke wilayah
posterior, yang mengakibatkan kurangnya beruntun primitif, mesoderm
embrionik dan endoderm (Ding et al., 1998). Hasil ini menunjukkan
bahwa Cripto mampu mengatur migrasi sel embrio pada tahap pra-
gastrulasi. Percobaan dengan alel hypomorphic Cripto
mengungkapkan bahwa itu juga diperlukan untuk pembentukan
struktur garis tengah aksial, khususnya anterior definitif endoderm
dan mesoderm prechordal (Chu et al., 2005). Namun, fungsi Cripto
selama awal tion gastrulasi, terutama dalam pembentukan lapisan
mesoderm, tetap sulit dipahami.material dan metode garis mouse Cripto
ThelacZ alel nol yang digunakan dalam penelitian ini telah dijelaskan
sebelumnya (Ding et al., 1998). Cripto Thefl sapi alel dihasilkan dengan
menghapus fl oxed wilayah PGK-Neo di Cripto dilaporkan sebelumnya3loxP alel

(Chu et al., 2005) Menggunakan garis EIIa-Cre. Generasi Cripto yangfl sapi / fl
sapi alel adalah skematis ilustrasi di tambahan Gambar. S1. Berikut
60

PCR pasangan primer yang digunakan untuk genotipe Cripto yangfl sapi alel:
5'-GTG GTA AGT AAT TCC TCT TTC-3 '(forward) dan 5'AGG
AAC ATT CCA ATG GCC TTG3' (reverse) mendeteksi loxP
kedua menghasilkan band 500 bp untuk fl oxed alel dan 400 bp
band untuk jenis alel wild; 5'-AGC CAT CTC ACC AGC CTT CA-
3 '(forward) dan 5'-ACC TCC CCA CCA TCC A-3' (reverse)
digunakan untuk menentukan loxP pertama memproduksi sebuah
band 450 bp untuk fl oxed alel dan band 580 bp untuk jenis alel liar.

The Sox2-Cre garis dibeli dari Jackson Laboratory (Hayashi et al., 2002)

Dan Fgf8lacZ, S e b u a h Fg f 8 n o l s t r a i n m u t a n ya n g d i h a s i l k a n
o l e h k e l o m p o k D r . G a i l M a r t i n , d i b e l i d a r i M M R R C . Dalam
hibridisasi in situ Seluruh gunung hibridisasi in situ dilakukan menurut
Shen (Shen, 2001) Dan ganda dalam hibridisasi in situ didasarkan
pada Cai (Cai et al., 2003). Embrio pasca-hibridisasi yang dipotong dan
kontra-diwarnai dengan merah cepat nuklir dari Vector Laboratories
(katalog # H-3403). Untuk setiap probe, lebih dari 10 embrio dianalisis.

Hasil

Hilangnya fungsi Cripto menyebabkan akumulasi sel mesoderm sekitar


area beruntun primitif selama gastrulasi Cripto sangat disajikan dalam streak
primitif dan migrasi mesoderm selama gastrulasi awal (Ding et al., 1998)
Menunjukkan bahwa Cripto dapat berfungsi selama proses ini. Namun,
perkembangan embrio mutan Cripto-nol ditangkap pada tahap
gastrulasi pra karena kegagalan dalam pembentukan polaritas
anterior-posterior (Ding et al., 1998). Oleh karena itu kami menghasilkan
fl oxed alel dari Cripto seperti yang ditunjukkan pada tambahanGambar.

S1. Cripto yang dihasilkanfl sapi / fl sapi tikus yang layak dan berkembang

secara normal. Persilangan Cripto fl sapi / fl sapi tikus jantan dengan


61

[CriptolacZ / wt: Sox2-Cre] tikus betina, yang mengandung tingkat


tinggi aktivitas Cre ibu (Hayashi et al., 2003; Vincent dan Robertson,
2003), Memunculkan fenotipe parah yang identik dengan embrio mutan
Cripto-nol, menunjukkan penghapusan wilayah fl oxed mengganggu

seluruh fungsi Cripto (tambahan Gambar. S2). Selain itu, Cripto inifl sapi
alel telah digunakan dalam penelitian terbaru meneliti fungsi Cripto
dalam regenerasi otot rangka (Guardiola et al., 2012; Michael Shen,
komunikasi pribadi).

Untuk menyelidiki fungsi Cripto selama tikus gastrulasi, kita dimanfaatkan

Cripto yangfl sapi dan Cripto lacZ baris dalam kombinasi dengan Sox2-
Cre garis transgenik, yang mengekspresikan aktivitas Cre seluruh
epiblast dan telah berhasil digunakan untuk mempelajari fungsi nodal
selama gastrulasi (Hayashi et al., 2003). Untuk menghindari aktivitas
Cre ibu yang tinggi di garis Sox2-Cre sebagaimana disebutkan di atas
(Hayashi et al., 2003; Vincent dan Robertson, 2003), Kami

menyeberangi [Cripto lacZ/wt; Sox2-Cre] males dengan Criptofl


sapi / fl sapi betina. Mayoritas yang dihasilkan [Cripto lacZ / fl sapi;

Sox2-Cre] embrio selamat untuk gastrulasi dan pasca-gastrulasi


tahap. Seperti ditunjukkan dalamGambar. 1, Menggunakan hibridisasi in
situ, kita meneliti ekspresi Brachyury, beruntun penanda primitif, pada E7.5.

Dibandingkan dengan tipe liar embrio (Gambar. 1A), [CriptolacZ / fl sapi;


Sox2-Cre] embrio terbentuk daerah beruntun primitif yang
abnormal yang disingkat dan melebar (Gambar. 1D). Lintas-bagian embrio ini
mengungkapkan bahwa sel-sel mesoderm dalam jenis embrio liar bermigrasi
keluar dari wilayah posterior dan tersebar di seluruh embrio (Gambar. 1B).
Sebaliknya ditandai, sel-sel mesoderm dalam embrio mutan bersyarat akumulasi di
wilayah posterior dalam wilayah primitif streak abnormal (Gambar. 1E),
62

menunjukkan cacat dalam migrasi lateral mesoderm. Cacat ini terdeteksi sedini
E6.5. Pada E6.5, sion expression of Lim1 menandai anterior visceral endoderm
(AVE) dan baru terbentuk bermigrasi sel mesoderm yang telah pindah dari daerah
posterior (Gambar. 1C dan G). Namun, dalam Cripto menderita penyakit embrio
mutan tional pada E6.5, sel-sel mesoderm Lim1-positif terbatas pada daerah
posterior, meskipun Lim1- mengekspresikan sel endoderm visceral sudah
bermigrasi dari ujung distal ke daerah anterior (Gambar. 1F dan I). Dibandingkan
dengan sel-sel ektoderm embrio epitel, sel-sel yang berdekatan dengan wilayah
beruntun primitif abnormal pada embrio mutan bersyarat adalah sel mesenchymal
khas dengan adhesi sel sel yang longgar, menunjukkan bahwa sel-sel telah
menjalani EMT (Gambar. 1E). Secara konsisten, ekspresi E-Cadherin itu turun-
diatur dalam sel-sel mesoderm di embrio mutan bersyarat (Gambar. 1H dan J).
Selain itu, Cripto-nol embrio mutan masih dapat membentuk sel-sel mesoderm
mesenchymal di daerah ekstra-embrio (Ding et al., 1998; Kimura et al., 2001).
Kami juga menemukan formasi yang luas dari pulau-pulau darah di embrio mutan
Cripto-null (data tidak ditampilkan), menunjukkan bahwa bahkan Cripto-nol
mutan menjalani EMT. Oleh karena itu, cacat diamati di sini adalah bukan karena
de fi sien EMT. Fgf8-Fgfr1 jalur dalam sel mesoderm sebagian dipengaruhi oleh
hilangnya fungsi Cripto
63

Gambar. Cacat alokasi sel 1. mesoderm di Cripto embrio mutan bersyarat. Di


Situ hibridisasi yang menunjukkan ekspresi Brachyury (A, B, D dan E), Lim1
(C, F, G dan I) dan E-Cadherin (H dan J) dalam jenis liar (Wt) dan Cripto
ketukan bersyarat (CKO) embrio. Pada E7.5, jenis embrio liar membentuk
lapisan primitif, ditandai dengan ekspresi Brachyury, dalam garis sempit di
embrio dari proksimal ke ujung distal (panah di A). Sel-sel mesoderm
Mesenchymal ditemukan di seluruh embrio (panah di B). Sebaliknya, Cripto
embrio mutan bersyarat membentuk patch diperpendek dan melebar dari streak
primitif yang abnormal (panah di D) dan sel-sel mesoderm mesenchymal
akumulasi di wilayah posterior sekitar streak primitif yang abnormal (panah di
E). Pada E6.5, sel-sel mesoderm migrasi, ditandai dengan ekspresi Lim1, dalam
jenis embrio liar (C) telah bermigrasi dari wilayah posterior (panah di G),
sedangkan sel Lim1-mengekspresikan di Cripto bersyarat embrio mutan (F)
tetap di wilayah posterior (panah di I), meskipun ekspresi Lim1 di endoderm
visceral telah pindah ke anterior daerah dalam kedua kasus (panah kepala di G
dan saya). Wt: tipe liar; CKO: bersyarat knock-out. Garis putus-putus di panel
A, C, D dan F mewakili posisi penampang ditampilkan di panel B, E, G dan I,
masing-masing.
64

Penelitian sebelumnya dengan Fgf8 dan Fgfr1 embrio mutan


mengungkapkan peran penting mereka dalam EMT dan migrasi sel
mesoderm selama gastrulasi (Deng et al., 1994; Sun et al., 1999;
Yamaguchi et al. 1994). penelitian selanjutnya menunjukkan bahwa
fungsi ini dimediasi, setidaknya sebagian, melalui regulasi Snai1
dan ekspresi Tbx6 (Ciruna dan Rossant 2001). Oleh karena itu, Fgf8
bertindak melalui Fgfr1 untuk mengatur ekspresi gen target hilir
seperti Snai1 dan Tbx6 untuk mengontrol EMT dan sel mesoderm
migrasi selama gastrulasi (Ciruna dan Rossant 2001; Zohn et al.,
2006). Karena Cripto embrio mutan bersyarat ditampilkan cacat
dalam migrasi sel mesoderm yang, untuk beberapa derajat, mirip
dengan fenotipe yang ditemukan di Fgf8 embrio mutan, kami
memeriksa ekspresi Fgf8 di Cripto embrio mutan bersyarat, tapi
tidak menemukan perubahan yang signifikan (Gambar. 2A dan D),
kecuali bahwa ekspresi di Cripto embrio mutan bersyarat cenderung lebih lebar
dan proksimal terletak karena streak primitif diperpendek dan melebar. Kami
kemudian diuji apakah Cripto adalah target hilir Fgf8 di streak primitif dan
bermigrasi mesoderm. Untuk ini, kami menguji ekspresi Cripto di Fgf8- nol

mutan (Fgf8lacZ / lacZ ) Embrio, dan menemukan bahwa Cripto expression


sion itu sangat dipertahankan dalam sel mesoderm terakumulasi dalam

Fgf8lacZ / lacZ embrio mutan pada E7.5, menunjukkan bahwa


Cripto expression sion tidak dikendalikan oleh Fgf8 (Gambar. 2B dan
E). Sebaliknya, kami menemukan bahwa ekspresi Fgfr1 itu sangat terpengaruh
dalam sel-sel mesoderm di Cripto embrio mutan bersyarat. Pada tipe embrio
liar, Fgfr1 sangat disajikan di seluruh embrio pada E7.5 termasuk epitel embrio
ektoderm dan mesoderm mesenchymal sel, dengan ekspresi kuat di mesoderm
dibandingkan dengan ektoderm (Gambar. 2C dan G). Ekspresi pada embrio
mutan berkurang secara keseluruhan, dan bagian menunjukkan bahwa ekspresi
65

Fgfr1 tersisa ditemukan sebagian besar dalam ektoderm embrio, dengan sedikit
ekspresi dalam sel mesoderm (Gambar. 2F dan J). Pada tipe embrio liar,
ekspresi di mesoderm bahkan lebih tinggi dari itu dalam ektoderm (Gambar. 2C
dan G). Kami juga memeriksa Fgfr1 ekspresi di Cripto embrio nol mutan pada
E7.5 dan menemukan bahwa ekspresi Fgfr1 dipertahankan dalam ektoderm dari
Cripto embrio nol (data tidak ditampilkan). Oleh karena itu, ekspresi Fgfr1
adalah berbeda-beda down-diatur dalam sel Derm meso di embrio mutan
bersyarat Cripto. Kami kemudian meneliti ekspresi Snai1 dan Tbx6, dua gen
target hilir Fgf8 / Fgfr1 dan menemukan bahwa ekspresi Tbx6 benar-benar

dihapuskan di semua [CriptolacZ / fl sapi: Sox2-Cre] embrio


diperiksa dengan streak morfologi abnormal (n 4 10) (Gambar.
2Aku dan L), sedangkan Snai1 masih dinyatakan dalam embrio mutan (Gambar.
2H dan K). Selain itu, kami menemukan Snail1 juga. dinyatakan dalam
Cripto embrio mutan null pada E7.5 (data tidak ditunjukkan),
menunjukkan bahwa bahkan hilangnya lengkap fungsi Cripto tidak
menghapuskan ekspresi Snail1. Hasil ini menunjukkan bahwa jalur
Fgf8-Fgfr1 sebagian dipengaruhi oleh vation inacti- bersyarat dari
Cripto.
66

Gambar. 2. Fgf8-Fgfr1 jalur sebagian terpengaruh Cripto embrio mutan


bersyarat. (A dan D) Fgf8 ekspresi E7.5 tidak menunjukkan perbedaan yang
signifikan antara tipe liar (A) dan Cripto mutan bersyarat (D) embrio, kecuali
bahwa embrio mutan (D) menunjukkan lebih banyak ekspresi di ujung
proksimal karena dipersingkat primitif garis. (B dan E) Cripto sangat disajikan
dalam Fgf8 embrio mutan null pada E7.5 termasuk massa sel mesoderm
akumulasi di wilayah posterior (panah di E). (C, F, G dan J) Pada E7.5, Fgfr1
sangat disajikan dalam jenis embrio liar (panah di C), termasuk kedua sel
mesoderm (panah di G) dan sel-sel ektoderm embrio (panah pusat di G).
Khususnya, ekspresi di mesoderm lebih tinggi dari ekspresi di ektoderm embrio.
Namun, dalam Cripto bersyarat embrio mutan, ekspresi sebagian besar
berkurang (panah di F). Dibandingkan dengan ekspresi dalam ektoderm embrio
(panah pusat di J), ekspresi di mesoderm jauh lebih lemah (tanda panah di J).
(H, I, K dan L) Hibridisasi in situ menunjukkan ekspresi Snai1 (H dan K) dan
Tbx6 (I dan L), dua dikenal Fgf8-Fgfr1 gen hilir, dalam jenis liar dan embrio
mutan tergantung pada E7.5. Ekspresi Snai1 pada embrio mutan (K) tidak
berubah dibandingkan dengan jenis embrio liar, sedangkan ekspresi Tbx6 benar-
67

benar dihapuskan (L). Wt: tipe liar; dalam jenis liar dan embrio mutan
tergantung pada E7.5. Ekspresi Snai1 pada embrio mutan (K) tidak berubah
dibandingkan dengan jenis embrio liar, sedangkan ekspresi Tbx6 benar-benar
dihapuskan (L). Wt: tipe liar; dalam jenis liar dan embrio mutan tergantung
pada E7.5. Ekspresi Snai1 pada embrio mutan (K) tidak berubah dibandingkan
dengan jenis embrio liar, sedangkan ekspresi Tbx6 benar-benar dihapuskan (L).
Wt: tipe liar;CKO: bersyarat knock-out; Fgf8- / -: Fgf8 nol mutan.
Garis putus-putus di panel B, C, dan F mewakili posisi
penampang ditampilkan di panel E, G dan J, masing-masing.
Fungsi Cripto mengatur aktivasi p38 MAP kinase di ektoderm embrio
Selama pencarian kami untuk gen yang bertanggung jawab untuk
kerusakan migrasi di Cripto embrio mutan bersyarat, kami menemukan
bahwa ekspresi Mesp1, sebuah streak- primitif dan mesoderm-
diekspresikan gen yang bertanggung jawab untuk migrasi sel mesoderm
jantung (Saga et al., 1999) Benar-benar dihapuskan pada tahap beruntun
di awal semua [CriptolacZ / fl sapi: Sox2-Cre] embrio diperiksa dengan
streak morfologi abnormal (n 4 10) (Gambar. 3A, B, E dan F). Secara
konsisten, kami menemukan bahwa ekspresi Mesp1 tidak terdeteksi di
Cripto embrio mutan null pada E6.5 (Gambar. 3C dan G), sedangkan
ekspresi penanda beruntun primitif lainnya seperti Fgf8, Lim1 dan
goosecoid masih dipertahankan, meskipun di ujung proksimal (Ding et
al., 1998), Sana- kedepan, Cripto diperlukan untuk ekspresi Mesp1 baik
di pra gastrulasi dan gastrulasi tahap. Kami kemudian meneliti ekspresi
Mesp1 di embrio mutan Fgf8-null untuk menentukan apakah ekspresi
Mesp1 adalah Fgf8 tergantung, dan menemukan bahwa Mesp1 adalah
sangat disajikan dalam embrio mutan pada E7.5 menunjukkan bahwa
ekspresi Mesp1 tidak tergantung pada jalur Fgf8-Fgfr1 (Gambar. 3D dan
H). Oleh karena itu, Cripto dapat berfungsi melalui jalur lain selain Fgf8-Fgfr1.
The p38 MAP kinase merupakan jalur utama lainnya dilaporkan memainkan peran
penting selama EMT dan migrasi sel mesoderm (Zohn et al., 2006).
Kehilangan p38 berinteraksi protein (p38IP) negatif mempengaruhi
68

aktivasi p38MAP kinase dalam embrio ektoderm dan mesoderm sel pada E7.5
dan mengarah ke cacat migrasi mesoderm dan keterlambatan dalam EMT (Zohn
et al., 2006). Kami menyelidiki aktivasi p38 MAP kinase dalam jenis
liar dan Cripto mutan bersyarat dengan pewarnaan immuno-
menggunakan phospho-p38 (P-p38) spesifik antibodi. Dalam E7.5 tipe
liar embrio, kami menemukan bahwa sinyal positif yang seragam hadir
di semua sel ektoderm embrio diperiksa oleh kedua lintas dan frontal
bagian (Gambar. 3I-K dan M-O). Namun, sinyal pada sel-sel mesoderm kurang
seragam dan bergantung posisi. Di wilayah proksimal, sebagian besar sel
mesoderm yang P-p38 positif dengan hanya beberapa sel negatif (Gambar. 3Saya
dan M). Sebaliknya sinyal tidak hadir dalam sel mesoderm di wilayah distal
(Gambar. 3J dan N). Hal ini sedikit berbeda dari laporan sebelumnya yang
menunjukkan aktivasi p38 seragam dalam sel mesoderm pada E7.5 (Zohn et al.,
2006). Kami percaya bahwa perbedaan ini mungkin karena perbedaan
tahap serta perbedaan posisi disebutkan di atas. Untuk lebih mengevaluasi
fungsi Cripto dalam mengaktifkan p38 MAK kinase dalam sel ektoderm embrio,
kami memeriksa aktivasi p38 pada embrio mutan Cripto-null pada E7.5. Jika
hilangnya fungsi Cripto memang mempengaruhi aktivasi p38 dalam sel ektoderm
embrio, harus lebih jelas dalam Cripto embrio nol mutan. Kami menemukan
bahwa di sebagian besar penampang Cripto nol bagian mutan embrio tidak
mengandung sel-sel positif P-p38 pada E7.5 (Gambar. 3L dan P). Secara
konsisten, bagian frontal menunjukkan bahwa sel-sel positif P-p38 hadir hanya di
daerah kecil di ujung distal, sedangkan sebagian besar wilayah sepanjang sumbu
distal proximal- itu tanpa P-p38 (Gambar. 3Q dan R). Oleh karena itu, hilangnya
fungsi Cripto dapat secara signifikan mempengaruhi aktivasi p38 MAP kinase,
setidaknya dalam sel ektoderm embrio. Aktivasi sisa p38 di Cripto mutan nol bisa
disebabkan kompensasi fungsional dari Cryptic (Chu dan Shen 2010). Kami juga
exam- INED ekspresi p38IP mRNA di Cripto embrio mutan dan menemukan tidak
ada perubahan dibandingkan dengan jenis embrio liar (data tidak ditampilkan).
69

Gambar. 3. Hilangnya fungsi Cripto menghapuskan ekspresi Mesp1 dan secara


dramatis mengurangi p38 aktivasi MAP kinase dalam ektoderm embrio. (A-H)
Dalam Situ hibridisasi menunjukkan ekspresi tinggi Mesp1 dalam jenis embrio
liar di E7.5 (A dan B) dan E6.5 (C) termasuk streak primitif (panah kepala di B)
dan mesoderm sel (panah di B ), sedangkan tidak ada ekspresi yang terdeteksi di
E7.5 embrio mutan bersyarat (E dan F) di streak primitif (panah kepala di F) dan
sel-sel mesoderm akumulasi (panah di F). Selain itu, ekspresi benar-benar
dihapuskan di E6.5 Cripto nol embrio mutan (G). Sebaliknya, Mesp1 masih
sangat disajikan dalam Fgf8 nol embrio mutan (panah di D dan H). (I-R)
Immunostaining menggunakan P-p38 spesifik antibodi menunjukkan p38 MAP
aktivasi kinase di E7.5 tipe liar (I-K dan M-O) dan Cripto mutan nol (L, P, Q, R)
embrio. Panel S adalah seluruh gunung pandangan dari embrio nol Cripto sesuai
70

dengan pewarnaan ditampilkan di panel Q dan R. Perhatikan bahwa ujung distal


embrio ini invaginated ke atas seperti yang ditunjukkan oleh garis. Garis putus-
putus menunjukkan posisi dan arah bagian Q dan R. Karena Cripto embrio nol
tidak membentuk mesoderm embrionik dan endoderm, jaringan yang ditampilkan
di sini adalah sel ektoderm embrio. Pada tipe embrio liar, seperti yang
ditunjukkan oleh kedua melintang (I, J, M, dan N) dan bagian frontal (K dan O),
sel-sel ektoderm embrio seragam positif bagi P-p38 (panah kepala di I-K dan M-
O ). Di beberapa daerah, sebagian besar sel-sel mesoderm yang positif bagi P-
p38 (panah di I dan M), tetapi beberapa sel mesoderm yang negatif (panah
pendek dalam I dan M). Di daerah distal, seluruh lapisan mesoderm adalah P-p38
negatif (J dan N). Dalam Cripto embrio nol mutan, (Panah di Q dan R),
kecuali untuk wilayah kecil di sekitar ektoderm pada ujung
distal (panah kepala di Q dan R). Wt: tipe liar; CKO: bersyarat
knock-out; Fgf8- / -: Fgf8 nol mutan; Null: Cripto nol mutan.
Garis putus-putus di panel A, D dan E mewakili posisi
penampang ditampilkan di panel B, H dan F masing-masing.
Catatan: Sejak invaginations selalu terjadi di ektoderm distal dari
E7.5 Cripto nol embrio mutan seperti yang dilaporkan
sebelumnya dan juga ditunjukkan oleh panah di (U), sumbu
proksimal-distal di (R, T) memang berorientasi pada top-bottom
cara, meskipun mereka terlihat seperti bottom-top.
Konsisten dengan pengamatan kami, sebuah penelitian terbaru mengungkapkan
bahwa nodal mempengaruhi diferensiasi AVE dengan mengaktifkan p38 MAP
kinase di endoderm visceral sebelum gastrulasi (Clements et al., 2011). Peneliti
ini juga melihat bahwa P-p38 tidak terdeteksi dalam endoderm visceral dari
Cripto nol embrio mutan oleh immunostaining pada E5.5 (Clements et
al.,2011), Menunjukkan bahwa Cripto dapat mempengaruhi
aktivasi p38 di endoderm visceral.

Gambar. 4. Hilangnya fungsi Cripto mempengaruhi definitif alokasi sel


endoderm selama gastrulasi. (A dan D) seluruh gunung pandangan liar (A) dan
Cripto mutan bersyarat (D) embrio pada E8.5 menunjukkan ekspresi Otx2
(panah), Meox-1 (panah), Shh (panah pendek) dan Mlc2a ( merah). (B dan E)
bagian Salib (A) dan (D) menunjukkan Meox-1 positif jaringan paraksial
mesoderm, somit (panah pendek), Shh struktur aksial garis tengah positif,
notochord (panah) dan sel endoderm foregut mengekspresikan Shh (panah). (C
dan F) seluruh gunung pandangan yang menunjukkan Sox17-mengekspresikan

71
72

sel endoderm membentuk sebuah patch dalam jenis embrio liar di E7.5 awal
termasuk daerah sesuai dengan foregut ventral masa depan (panah di C),
sedangkan Sox17-mengekspresikan sel yang hadir dalam E7.5 Cripto mutan
bersyarat embrio (panah kepala di F), tapi yang hilang dari daerah sesuai dengan
usus ventral masa depan (panah di F). (G-L) Mixl1 sangat disajikan dalam E7.5
jenis embrio liar (G) termasuk streak primitif (panah pusat di H) dan sel-sel
mesendoderm yang berdekatan (panah di H). Untuk terpengaruh E7.5 Cripto
embrio mutan bersyarat yang tidak memiliki primitif beruntun dan
mesendoderm sel, ekspresi Mixl1 hanya ditemukan di wilayah ekstra-embrio
proksimal (panah di I), dan untuk embrio kurang parah yang melakukan bentuk
lapisan mesendoderm (panah di J), hanya tingkat jejak ekspresi Mixl1
ditemukan di streak primitif (panah kepala di K) dan tidak ada sinyal yang
ditemukan di mesendoderm yang berdekatan (panah di K). Hanya wilayah
ekstra-embrio (panah pendek dalam J) dan daerah dekat tepi wilayah embrio
(panah pusat di J) menunjukkan sinyal positif dalam sel mesendoderm (panah di
L). Wt: tipe liar; CKO: bersyarat knock-out. Garis putus-putus di panel A, D, G
dan J mewakili posisi penampang ditampilkan di panel B, E, H dan (L, K),
masing-masing.

Cripto diperlukan untuk pengembangan endoderm embrio

Selain mesoderm, sel-sel yang bermigrasi keluar dari streak primitif juga
membentuk definitif lapisan endoderm yang penting bagi banyak organ seperti
usus (Lawson et al., 1991; Nagy, 2003; Tam et al., 2007; Tam dan Loebel 2007).
Beberapa Cripto embrio mutan bersyarat selamat ke tahap akhir dan
ditampilkan cardia bi fi da, di mana nenek moyang jantung gagal untuk
bermigrasi ke arah garis tengah untuk membentuk tabung jantung
linear, cacat juga terlihat di zebra ikan OEP embrio mutan (Grif fi n
dan Kimelman 2002) (Gambar. 4A, B, D, dan E). Untuk memastikan bahwa
embrio mutan menjalani gastrulasi, perlu untuk memeriksa kardia bi fi da dalam
kaitannya dengan AP pembentukan polaritas, mesoderm dan pembentukan
endoderm. Oleh karena itu kami dilakukan hibridisasi in situ analisis
menggunakan empat probe secara bersamaan: Mlc2a untuk miosit; Shh untuk
mesoderm aksial, garis tengah ventral dan endoderm; Meox1 untuk mesoderm
73

paraksial; dan Otx2 untuk jaringan saraf anterior. Ekspresi Mlc2a ditampilkan
dalam warna merah dan tiga lainnya adalah ungu gelap. Seperti ditunjukkan
dalamGambar. 4, Embrio mutan di E8.5 bernoda positif untuk semua empat gen
penanda, menunjukkan bahwa mereka menjalani gastrulasi dan mesoderm untuk-
mation, meskipun ekspresi Otx2 menunjukkan cacat garis tengah di wilayah
anterior (Gambar. 4A, B, D, dan E). Mirip dengan apa yang terjadi pada Zebra
ikan OEP mutan, kardia bi fi da di mutan itu mungkin disebabkan oleh cacat
foregut endoderm, cacat khususnya di penutupan ventral foregut (Gambar. 4E).
Pada E7.5 awal, embrio mutan bersyarat menyatakan Sox17, sebuah gen
regulator kunci dalam pembentukan sel endoderm (Kanai-Azuma et al., 2002;
Seguin et al., 2008), Menunjukkan pembentukan sel-sel endoderm.
Namun, sel Sox17-mengekspresikan hilang di wilayah yang sesuai
dengan daerah garis tengah ventral termasuk usus depan (Tam et al.,

2007) (Gambar. 4C dan F). Oleh karena itu, sel-sel endoderm terbentuk di
embrio mutan, tapi alokasi daerah itu terganggu, khususnya yang berkaitan
dengan wilayah usus masa depan. Ini alokasi sel endoderm cacat bisa langsung
disebabkan oleh cacat migrasi sel di lapisan primitif. Secara konsisten, kami
menemukan bahwa ekspresi Mixl1 telah diubah dalam embrio mutan. Mixl1
sangat disajikan dalam streak primitif dan sel-sel mesendoderm yang berdekatan
(Gambar. 4G dan H). Namun, dalam mutan parah yang menyerupai mutan
Cripto-nol tanpa tanda-tanda streak primitif dan mesendoderm embrio, ekspresi
Mixl1 secara eksklusif ditemukan di wilayah ekstra-embrio (Gambar. 4SAYA).
Dalam embrio yang membentuk lapisan primitif abnormal dan mesendoderm,
tidak ada ekspresi Mixl1 ditemukan di wilayah beruntun primitif dan
mesoendoderm berdekatan kecuali untuk sebuah band yang sempit di dekat
wilayah ekstra embrionik (Gambar. 4K dan L). Mengingat pentingnya Mixl1
dalam pembentukan dan alokasi sel endoderm (Hart et al., 2002; Tam et al.,
2007), Ini salah ekspresi Mixl1 mungkin bertanggung jawab untuk
cacat endoderm ditemukan di Cripto embrio mutan bersyarat.
Pentingnya OEP di Zebra formasi ikan endoderm telah
didokumentasikan dengan baik (Grif fi n dan Kimelman 2002; Schier
et al., 1997), Dan penelitian sebelumnya telah melaporkan fungsi Cripto
74

pada tikus anterior definitif pembentukan endoderm (Chu et al., 2005). The
Temuan yang dilaporkan di sini memperpanjang studi sebelumnya dan
mengungkapkan peran dilestarikan gen EGF-CFC di endoderm umum
mengembangkan- ment, terutama alokasi daerah sel endoderm.

Diskusi

Selama pembentukan mesoderm, sel epiblast epitel menjalani


EMT dan sel mesenchymal yang dihasilkan bermigrasi keluar dari
wilayah beruntun primitif. Telah menunjukkan bahwa Snai1 sangat
penting untuk EMT selama gastrulasi tikus (Carver et al., 2001).
Snai1 embrio tikus mutan menampilkan cacat pada EMT dan sel-sel yang berasal
dari lapisan primitif lebih epitel dari mesenchymal dalam karakter dan
mempertahankan ekspresi E-Cadherin (Carver et al., 2001). Anehnya, sel-sel
epitel tidak menumpuk di sekitar area beruntun primitif, tapi bermigrasi keluar
dan membentuk lapisan sel intervensi antara epiblast dan endoderm visceral
(Carver et al., 2001). Oleh karena itu, tampak bahwa cacat EMT tidak mencukupi
untuk menyebabkan kegagalan migrasi sel. Dalam Fgfr1 dan Fgf8 mutan, sel-sel
akumulasi sekitar area beruntun primitif dan mempertahankan ekspresi E-
Cadherin, menunjukkan cacat di kedua EMT dan mesoderm migrasi sel (Ciruna
dan Rossant, 2001; Deng et al., 1994; Sun et al., 1999). Sejak cacat EMT tidak
mencukupi untuk menyebabkan akumulasi sel di sekitar streak primitif seperti
yang ditunjukkan oleh mutan Snai1 (Carver et al., 2001), Cacat migrasi sel di
Fgf8 dan Fgfr1 mutan mungkin tidak disebabkan oleh cacat EMT. Snai1 dan
Tbx6 adalah dua target hilir jalur Fgf8- Fgfr1 selama gastrulasi, dan down-
regulasi ekspresi Snai1 bertanggung jawab atas cacat EMT di Fgfr1 dan Fgf8
mutan (Ciruna dan Rossant 2001; Sun et al., 1999).
Dalam studi ini, kami meneliti fungsi Cripto selama gastrulasi mouse dengan
penghapusan bersyarat dari Cripto alel menggunakan Sox2-Cre. Sox2-Cre drive
Cre ekspresi gen seluruh epiblast, dan yang dihasilkan tersebut [CriptolacZ / fl
sapi: Sox2-Cre] embrio harus, pada prinsipnya, menampilkan pra-gastrulasi cacat
seperti Cripto embrio mutan null. Namun, kami memperoleh hanya [Cripto
beberapalacZ / fl sapi: Sox2-Cre] embrio yang terlihat seperti embrio mutan null,
mayoritas [CriptolacZ / fl sapi; Sox2-Cre] embrio ditampilkan akhir fenotip atau
75

tidak ada fenotipe. Hal ini mungkin karena variasi kegiatan Cre antara
[CriptolacZ / fl sapi: Sox2-Cre] embrio dan non-sel sifat mous autono- fungsi
tikus Cripto (Chu et al., 2005). Analisis yang dihasilkan [CriptolacZ / fl sapi:
Sox2-Cre] mengungkapkan bahwa tivation ketidak bersyarat dari fungsi Cripto
selama gastrulasi disebabkan sel menumpuk di sekitar area beruntun primitif.
Berbeda dengan Fgf8 dan Fgfr1 mutan, sel-sel akumulasi adalah sel
mesenchymal khas morfologi, dengan adhesi sel sel yang longgar dan tidak ada
ekspresi E-Cadherin, menunjukkan EMT terjadi biasanya di Cripto mutan tional
menderita penyakit. Selain itu, studi sebelumnya mengungkapkan bahwa Cripto
embrio mutan nol masih dapat membentuk sel-sel mesoderm mesenchymal di
wilayah ekstra-embrio (Ding et al., 1998; Kimura et al., 2001), Dan kami juga
menemukan pembentukan sel darah luas di Cripto embrio nol mutan (data tidak
ditunjukkan), menunjukkan proses EMT tidak terpengaruh bahkan oleh
hilangnya lengkap fungsi Cripto. Kami juga menemukan bahwa ekspresi Fgfr1
itu turun-diatur dalam sel Derm / mesenchymal meso di Cripto embrio mutan
bersyarat. Selain itu, ekspresi Tbx6, target dari jalur Fgf8-Fgfr1, dihapuskan di
Cripto mutan bersyarat, sedangkan ekspresi Snai1, target lain dari jalur Fgf8-
Fgfr1 tidak terpengaruh. Selain itu, kami menunjukkan bahwa ekspresi Snai1
dipertahankan di Cripto embrio nol mutan, lanjut con fi rming yang kehilangan
Cripto tidak down-mengatur ekspresi Snai1. Oleh karena itu, jalur Fgf8-Fgfr1
sebagian dipengaruhi oleh hilangnya fungsi Cripto.
Selain jalur Fgf8-Fgfr1, hasil kami menunjukkan bahwa hilangnya fungsi Cripto
mempengaruhi aktivasi p38 MAP kinase, dan aktivasi p38 sangat penting untuk
migrasi sel mesoderm selama gastrulasi tikus (Zohn et al., 2006). Menariknya,
laporan terbaru menunjukkan bahwa aktivasi p38 di endoderm visceral oleh
Nodal diperlukan untuk anterior diferensiasi endoderm visceral dan migrasi
(Clements et al., 2011). AVE adalah pertama dispesifikasikan di ujung distal
sebelum migrasi ke ujung anterior (Thomas et al., 1998). Clements dan rekan
menunjukkan bahwa proses ini membutuhkan Nodal dirangsang aktivasi p38 di
endoderm visceral pada E5.5 (Clements et al., 2011). Mereka juga menemukan
bahwa aktivasi p38 di endoderm visceral tidak terdeteksi di Cripto
embrio nol mutan yang ditentukan oleh P-p38 immunostaining,
76

menunjukkan bahwa fungsi Cripto diperlukan untuk aktivasi p38 di


endoderm visceral pada tahap pra-gastrulasi (Clements et al., 2011).
Namun, dalam Cripto embrio mutan null, AVE masih ditentukan
dalam ujung distal, tapi gagal untuk bermigrasi ke anterior akhir (Ding
et al., 1998). Karena diferensiasi AVE masih terjadi di Cripto embrio nol
mutan, harus ada tingkat basal aktivasi p38 terus mempertahankan
dalam endoderm visceral dari Cripto embrio mutan null. Ada
kemungkinan bahwa di Cripto embrio nol mutan, aktivasi p38 dalam
endoderm visceral adalah secara signifikan berkurang ke tingkat bawah
sensitivitas P-p38 immunostaining, tapi mencukupi untuk
mempromosikan diferensiasi AVE di akhir distal. Dalam kata lain,
entiation berbeda- dari AVE memerlukan tingkat rendah aktivasi p38,
sedangkan migrasi AVE dari ujung distal ke daerah anterior
membutuhkan tingkat yang lebih tinggi dari aktivasi p38, dan Cripto
diperlukan hanya untuk aktivasi tingkat tinggi p38 di endoderm
visceral. Situasi ini mungkin juga berlaku untuk epiblast atau ektoderm
embrio, mana hilangnya fungsi Cripto mengarah ke tingkat rendah
aktivasi p38 mencukupi hanya untuk EMT, proses diferensiasi sel,
tetapi tidak memadai untuk mempromosikan migrasi sel mesoderm
berikutnya. Dalam p38IP embrio mutan, aktivasi p38 dapat dikurangi
untuk sebagian besar daripada di mutan Cripto dan mengarah ke cacat
di kedua EMT dan sel migrasi seperti yang dilaporkan (Zohn et al.,
2006). Oleh karena itu, Cripto berinteraksi dengan baik Fgf8-Fgfr1 dan
p38 jalur MAP kinase untuk mengatur migrasi mesoderm selama

gastrulasi. Fenotip dijelaskan di sini menyerupai Nodal nr / nr embrio,


sebuah Nodal hypomorphic embrio mutan yang parah, yang
menampilkan mas- sive akumulasi sel-sel mesoderm
mengekspresikan Snai1 dalam wilayah yang lebih luas dan lebih
pendek (Ben-Haim et al., 2006). Hal ini konsisten dengan gagasan
bahwa Cripto bertindak sebagai co-faktor untuk Nodal selama
embriogenesis awal (Chu dan Shen 2010; Shen dan Schier, 2000).
77

Selama gastrulasi mouse, sel-sel dari lapisan primitif juga


berkontribusi pada definitif endoderm (Lawson et al., 1991; Nagy,
2003; Tam et al., 2007; Tam dan Loebel 2007). Cacat pada migrasi sel lapisan
primitif harus, pada prinsipnya, mempengaruhi pembentukan endoderm
embrio. Secara konsisten, kami mengamati bahwa sebagian besar
Cripto embrio mutan bersyarat yang selamat ke tahap akhir
ditampilkan cacat pada penutupan usaha dari foregut endoderm.
Menariknya, ini embrio mutan juga menderita cardia bi fi da, cacat
disebabkan oleh kegagalan migrasi ventral dari sel progenitor jantung.
Hal ini diketahui bahwa Mesp1 diperlukan untuk proses ini (Saga et al.,
1999), Dan fungsi Cripto diperlukan untuk ekspresi seperti yang
ditunjukkan oleh studi saat ini. Oleh karena itu, malformasi jantung
diamati di sini bisa disebabkan oleh cacat langsung di migrasi sel
progenitor jantung. Selain itu, pembentukan tabung jantung linear
sepanjang garis tengah ventral juga tergantung pada perkembangan
foregut ventral, yang terganggu di mutan. Oleh karena itu, kardia bi
fi da bisa disebabkan beberapa mekanisme.

Kesimpulan
Sebagai kesimpulan, Cripto memainkan peran penting selama gastrulasi
tikus, terutama dalam pembentukan mesoderm dan endoderm. Fungsi Cripto ini
sebagian dimediasi melalui jalur yang melibatkan Fgf reseptor 1 dan p38 MAP
kinase (Jin & Ding, 2013).
BAB IV
PENUTUP

4.1 Kesimpulan

Kesimpulan pada makalah ini adalah:

1. Organogenesis merupakan pembentukan organ atau alat tubuh.

Pertumbuhan ini diawali dari pembentukan embrio (bentuk primitif)

menjadi fetus (bentuk definitif) kemudian berdiferensiasi menjadi

memiliki bentuk dan rupa yang spesifik bagi keluarga hewan dalam

satu species

2. Tahap-tahap organogenesis ada dua yaitu Periode Pertumbuhan akhir

adalah periode penyelesaian bentuk definitif menjadi suatu bentuk

individu pertumbuhan jenis kelamin, roman / wajah yang khas bagi

suatu individu. (Dan Periode pertumbuhan antara adalah periode ini

terjadi transformasi dan diferensiasi bagian – bagian tubuh embrio

sehingga menjadi bentuk yang definitif, yang khas bagi suatu spesies.

3. Turunan endoderm akan membentuk lapisan epitel seluruh saluran

pencernaan. Kelenjar-kelenjar pencernaan misalnya hepar, pancreas.

Serta saluran pernapasan seperti paru-paru dan trakea.

4. Kelainan yang terjadi pada lapisan endoderm meliputi Gastroschisis,

Sindrom respiratory distress (RDS), Esophageal stenosis, Extrahepatic

biliary atresia, Pankreas annular, Imperforate anus dan Omphalocele.

78
DAFTAR PUSTAKA

Campbell, R., & Mitchell, L. . (2004). Biologi Jilid III. Jakarta: Erlangga.

Han, S., Tan, C., Ding, J., Wang, J., Ma, A., & Gouon-evans, V. (2018).
Endothelial cells instruct liver speci fi cation of embryonic stem cell-derived
endoderm through endothelial VEGFR2 signaling and endoderm epigenetic
modi fi cations. Stem Cell Research, 30(March), 163–170.

Jin, J., & Ding, J. (2013). Cripto is required for mesoderm and endoderm cell
allocation during mouse gastrulation. Developmental Biology, 381(1), 170–
178.

Parenti, A., Halbisen, M. A., Wang, K., Latham, K., & Ralston, A. (2016). OSKM
Induce Extraembryonic Endoderm Stem Cells in Parallel to Induced
Pluripotent Stem Cells. Stem Cell Reports, 6(4), 447–455.

Wibowo, D., & W, P. (2009). Anatomi Tubuh Manusia. Yogyakarta: Graha Ilmu.

79