LAPORAN PRAKTIUM INSTRUMENTASI 3

HPLC (High Performance Liquid Chromatography)

Nama : prita supriono putri

NIM : P27834118039
Dosen : Christ Kartika Rahayu Ningsih,ST, M.Si

 HPLC merupakan kromatografi dengan teknik pemisahan dengan sistem partisi.

 Memiliki tekanan 6000-9000 Psi
1 PSI = 0,689476 Bar
Sama dengan 413,7-620,5 bar
 Bagian-bagian HPLC 1 bar = 14500 PSI
1. Fase gerak (eluent)

o Merupakan botol-botol yang diisi dengan fase gerak.

o Terdiri dari 4 botol, yaitu 3 botol bening dan 1 botol coklat.
o Botol bening digunakan oleh asam-asam organik yang kuat cahaya,
contoh : aseton dan metanol
o Botol coklat digunakan oleh reagen yang tidak kuat cahaya. Contoh :
larutan buffer
o Mengapa larutan buffer? Karena agar menjaga keseimbangan Ph
tetap netral.
o Pelarut nya memiliki beberapa ketentuan, yaitu organik, netral, dan
nonkation. Contoh : aquabides
o Mengapa harus netral? Karena jika tidak netral maka di kromatogram
akan timbul noise

.
o Mengapa tidak menggunakan pelarut air saja? Karena air tidak netral,
dan juga akan mengakibatkan timbulnya jamur dan alga
o Bagaimana jika terlanjur memakai air? Kita dapat menggunakan
corong pemisah untuk mengeluarkan air dan gas nya.
 o Didasar botol, terdapat alat bernama, digeser
o Digeser berfungsi merubah gas menjadi zat terlarut. Zat yang tidak
terlarut, seperti 𝐻2 dan 𝑂2
o Jika gas tidak dirubah menjadi gas terlarut, maka kromatogramnya
tidak sempurna.
2. Pompa

o Satu kesatuan dari tiga tersebut, disebut sebagai POMPA

o Fungsi dari pompa adalahmenarik fase gerak dari botol-botol menuju
ke kolom.
o Memiliki ideal aliran 0,5-10 mL/menit. tetapi rata-rata biasanya 1
mL/menit.
o Selang Fase Gerak, merupakan tempat dimana hanya fase gerak
lewat saja di selang-selang tersebut.
 o Terdapat 4 selang, yaitu A,B,C, dan D
o Karena botol coklat selalu dipakai ketika menggunakan eluent, maka
biasanya botol coklat dihubungkan dengan A atau D. Dan botol
bening lainnya harus menempati A atau D dahulu baru boleh yang
lain.
o Mengapa A dan D harus terisi terlebih dahulu? Karena untuk
menghindari kebocoran.jika terjadi kebocoran, maka lampu indikator
akan otomatis berwarna merah, yang menunjukkan bahwa terdapat
gangguan didalam pompa.
o Tanda masuk dan keluar diatas adalah ketika pompa menarik fase
gerak eluent maka ia akan masuk ke dalam tanda masuk tersebut,
dan akan keluar melalui tanda keluar tersebut.
o Setelah itu, akan masuk kedalam Pompa Pencampur yang berada di
tengah.
o Setelah itu, masuk kedalam Heat Pump. Berfungsi sebagai pengatur
tekanan secara manual. Juga ketika ada gelembung di selang, kita
juga bisa mengaturnya dengan menggunakan heat pump.
o Notes : adanya gelembung di selang, juga dapat mengganggu
3. Injection port
 o Jika tutup merah pada gambar diatas dibuka, terlihat lingkaran yang
disebut sampel lup. Berfungsi untuk menginjeksikan sampel.
o Menginjaksikan sampel menuju ke sampel lup harus menggunakan
alat yang disebut jarum syringe.
o Jarum syringe memiliki kapasitas volume 10-250 µL
o Tetapi, dalam menginjeksikan menggunakan volume 20µL dengan 4-5
kali injeksi. Jika kita lupa, mungkin kelebihan, maka sampel yang
berlebih akan otomatis dibuang sebagai limbah
o Notes : dalam penginjeksian, harus memperhatikan pengaturan suhu,
dan tidak boleh ada gelembung udara.

o Alat yang berada di belakang smpel lup tersebut, disebut Auto

Sampler
o Berfungsi ketika sampel yang dimasukkan banyak, dapat
menggunakannya juga untuk memasukkan sampel.
Skema Ketika Menginjeksikan Sampel

sampel

Fase Gerak

Jika dalam kondisi tidak menginjeksikan sampel, maka tutup yang berwarna
merah akan terbuka, dan fase gerak mengalir begitu saja. Teapi, jika dalam
kondisi menginjeksikan sampel, maka pegangan berwarna hitang yang
menempel pada injection port tersebut harus dinaikkan. Mengapa? Karena
berfungsi untuk menutup pintu merah tersebut agar sampel tidak
terkontaminasi dengan fase gerak. Jadi, fase gerak akan terus mengalir
meskipun ketika sampel dimasukkan. Jika penginjeksian sampel telah
selesai, maka pegangan tersebut dapat diturunkan ke bawah kembali.
 Pegangan Hitam
Yang Menempel
Pada Injection Port

4. Kolom analitik

Guard

Kolom

o Sebelum menuju kolom analitik, terlebih dahulu menuju guard kolom.

Guard kolom ini berfungsi sebagai penyaring partikel-partikel
pengganggu yang sudah masuk.
o Suhu pada kolom, minimal 40°C dan suhu maksimum 60°C
o Salah satu kolom yang sering digunakan adalah C18, mengapa?
Karena ia memiliki kemampuan pemisahan dari tingkat kepolaran
rendah hingga tinggi
Prinsip Yang Terjadi Di Kolom Analitik
o Kepolaran fase diam dan sampel harus saling terbalik
o Komponen yang mempunyai sifat kepolaran sama, maka terikat lebih
kuat
o Komponen yang tidak sama, terikat lemah dan akhirnya lebih dulu
lepas dengan fase gerak menuju detektor
o Jadi, pig pada kromatogram yang keluar pertama yaitu yang
mempunyai kepolaran tidak sama dengan fase gerak, pig selanjutnya
a/ senyawa yg memiliki sifat kepolaran yg sama dg fase diam.
5. Detektor

o Detektor berfungsi untuk mengidentifikasi senyawa-senyawa yang

keluar dari kolom. Kemudian dikirim ke sistem data berupa
kromatogram yang memiliki puncak (pig)
 o Detektor ada bermacam-macam, contohnya : UV vis, indeks bias,
inframerah, florens
o Biasanya yang sering digunakan adalah UV Vis, mengapa? Karena
detektor ini dapat menganalisa konsentrasi sampai yang kecil. Dibalik
kelebihannya, tentu ada kekurangan juga. Detektor ini memiliki
kekurangan pada absorbsi Ph larutan.
6. Sistem data

o Sistem data diatas menampilkan bagian bawah kotak panjang

tersebut merupakan kromatogram, tempat pig akan mucul
o Sedangkan 3 kotak diatasnya tersebut, menunjukkan kondisi alat,
yaitu dari kiri merupakan pompa, kolom, dan detektor
o Pada kotak pompa, pengaturan datanya, kita mencentang kolom yang
diisi fase gerak oleh kita. Misal, yang diisi botol A dan D saja, maka
kolom yang dicentang hanya kolom A dan D saja. Disamping nya
terdapat nama untuk menulis reagen apa yang kita gunakan sebagai
fase gerak. Juga terdapat tekanan yang sudah otomatis diset oleh
data.
o Pada kotak kolom, kita mengatur suhunya. Jika terdapat hanya satu
kolom, maka yang di setting suhunya hanya yang satu itu. Kolom
memiliki suhu minimal 40°C dan maksimum 60°C
 Sistem operasional
o NPLC (normal phase liquid chromatography)
Fase gerak : nonpolar, fase diam : polar
o RPLC (referse phase lisuid chromatography)
Fase gerak : polar, fase diam : nonpolar
o Isokratik : berdasarkan komposisi fase gerak
o Gradien aliran fase geraknya dapat di rubah-rubah, jikalau komposisinya
tepat
 Pengoperasionalan
 o Disetiap bagian, pompa, kolom, dan detektor, memiliki tombol on/off nya
sendiri. (lingkaran merah)
o Pada lingkaran kuning, itu merupakan lampu indikator, juga berada di setiap
bagian, yaitu pompa, kolom, dan detektor.
o Jika lampu indikator berwarna oranye, maka alat sedang dipanaskan ±30
menit
o Jika lampu indikator berwarna kuning, maka sedang dilakukanm proses
analisis
o Jika lampu indikator berwarna merah, maka ada indikator yang menggangu
atau ada kerusakan
o Jika lampu mati, maka ia siap untuk proses injeksi
o Jika lampu berwarna hijau, maka dalam kondisi baik ketika sudah di on kan
dalam sistem data
 Notes : untuk pengawetan, pada saat pemanasan dapat membilas dengan
menggunakan pelarutnya, seperti halnya dalam keadaan titrasi pada buret.