Strategi yang efisien untuk membentuk jenis

tuli sensorineural pada tikus

Long Ma,1,# Hai-jin Yi,2,# Fen-qian Yuan,3 Wei-wei Guo, M.D., Ph.D.,4,* and Shi-
ming Yang, M.D., Ph.D.4,*
1
The Second Artillery General Hospital of Chinese PLA, Beijing, China
2
Department of Otolaryngology-Head & Neck Surgery, Beijing Tiantan Hospital,
Capital Medical University, Beijing, China
3
Department of Head and Neck Surgery, Jiangxi Cancer Hospital, Nanchang,
Jiangxi Province, China
4
Department of Otolaryngology, Head & Neck Surgery, Institute of
Otolaryngology, Chinese PLA General Hospital, Beijing, China
*
Correspondence to: Shi-ming Yang or Wei-wei Guo, ten.362@103msgnay or
moc.361@100tnewg.
#
These authors contributed equally to this work.
Author contributions: SMY and WWG designed the study; LM and HJY
performed experiments; FQY analyzed the data; SMY and LM wrote the paper.
All authors approved the final version of the paper.
Accepted 2015 Jun 4.

1. Abstrak
Obat-obatan Ototoksik dapat digunakan untuk menghasilkan hilangnya sel-
sel rambut koklea untuk menciptakan model-model tuli pada hewan. Namun,
sepengetahuan kami, tidak ada laporan tentang pembentukan model tuli tikus
melalui aplikasi gabungan aminoglikosida dan loop diuretik. Tujuan dari
penelitian ini adalah untuk menggunakan administrasi furosemide dan kanamycin
sulfat tunggal atau gabungan untuk menetapkan model tikus tuli. Tikus menerima
suntikan intravena dari dosis yang berbeda dari furosemid dan / atau suntikan
intramuskular dari kanamisin sulfat. Respon batang otak pendengaran diukur
untuk menentukan ambang pendengaran setelah aplikasi obat.
Immunocytochemistry dan confocal microscopy dilakukan untuk mengevaluasi
morfologi telinga bagian dalam. Pada kelompok yang menerima kombinasi
furosemide dan kanamycin, ambang respon batang otak pendengaran
menunjukkan peningkatan yang signifikan 3 hari setelah pemberian, lebih tinggi
dari yang dihasilkan oleh furosemid atau kanamisin saja. Sel-sel rambut
menunjukkan berbagai tingkat cedera, dari belokan apikal ke pergantian basal dari
koklea dan dari sel-sel rambut luar ke sel-sel rambut bagian dalam. Sel-sel

1
ganglion spiral mempertahankan morfologi normal selama minggu pertama
setelah sel-sel rambut benar-benar menghilang, dan kemudian berangsur-angsur
merosot. Setelah 2 bulan, sebagian besar sel ganglion spiral menghilang, tetapi
beberapa tetap. Temuan ini menunjukkan bahwa pemberian kombinasi furosemide
dan kanamycin memiliki efek ototoksik yang sinergis, dan bahwa obat-obatan ini
dapat menyebabkan hilangnya sel rambut dan kehilangan pendengaran pada tikus.
Temuan ini menunjukkan bahwa bahkan pada pasien dengan tuli berat, implan
koklea elektronik dapat mengembalikan sebagian pendengaran.
Kata kunci: regenerasi saraf, tuli sensorineural, kanamisin, furosemid, obat
ototoksik, sel ganglion spiral, sel rambut, regenerasi saraf.

2. Pengantar
Hewan model tuli adalah alat penting untuk mempelajari patogenesis tuli
dan untuk mengevaluasi strategi terapi untuk memulihkan pendengaran. Tuli
dapat dicapai melalui paparan kebisingan (Yang et al., 2012), pemberian obat
ototoksik (Ding et al., 2010) dan mutasi gen (Yang et al., 2009a). Pemberian obat
lebih sering digunakan daripada dua pendekatan lainnya karena dapat
mengakibatkan penghapusan lengkap dari sel-sel rambut pendengaran. Sampai
saat ini, banyak metode yang menggunakan obat-obatan ototoksik telah digunakan
untuk menginduksi tuli, seperti aplikasi lokal carboplatin dan cisplatin, infiltrasi
neomisin melalui membran jendela bundar (He et al., 2009; Zhou et al., 2009),
dan injeksi intramuskular kanamisin, gentamisin dan amikasin (Staecker et al.,
2007). Namun demikian, metode ini mungkin memiliki efek samping yang parah.
Sebagai contoh, administrasi lokal obat-obatan ototoksik dapat menyebabkan
infeksi dan kerusakan mekanis dari telinga bagian dalam, dan administrasi
sistemik dari aminoglikosida dapat menyebabkan disfungsi ginjal yang parah dan
kematian. Oleh karena itu, metode pemberian obat yang lebih aman dan lebih
efektif perlu dieksplorasi. Untungnya, aplikasi gabungan aminoglikosida dan loop
diuretik, seperti kanamycin dan furosemide, telah terbukti menyebabkan cedera
sel rambut dalam cara yang relatif cepat dan aman (West et al., 1973; Xu et al.,
1993; Liberman et al. ., 2002; Nourski et al., 2004). Ini mengilhami kami untuk

2
mengeksplorasi metode baru untuk memproduksi model hewan tuli. Dalam
penelitian ini, kami meneliti efek kanamisin dan furosemid pada koklea tikus.
Untuk yang terbaik dari pengetahuan kami, ini adalah laporan pertama
tentang pembentukan model tuli tikus melalui aplikasi gabungan aminoglikosida
dan loop diuretik.

3. Bahan dan Metode

 Pemberian Obat
Sembilan puluh tikus Sprague-Dawley berusia 4 minggu yang sehat, dengan
berat 100-110 g, secara acak dibagi menjadi enam kelompok, dengan 15 hewan di
setiap kelompok. Tikus-tikus ini dibius dengan injeksi intraperitoneal 10% chloral
hidrat (0,45 mL / 100 g). Furosemide diperoleh dari Tianjin Jin Yao Amino Acid
Co., Ltd., Tianjin, China (batch No. 0606191). Kanamycin sulfate (produk No.
K4000) diperoleh dari Sigma (St. Louis, MO, USA). Solusi furosemide untuk
injeksi intravena baru disiapkan dengan saline sebelum digunakan. Vena jugularis
kiri terpapar dan disuntik dengan furosemid, sedangkan kanamisin sulfat
disuntikkan secara intramuskular ke paha seperti yang dijelaskan sebelumnya
(West et al., 1973). Kelompok kontrol tidak menerima perawatan apa pun.
Kelompok Furosemide 200 mg / kg dan Kanamycin 1.000 mg / kg diinjeksi
dengan furosemid dan kanamisin saja dengan dosis masing-masing 200 mg / kg
dan 1.000 mg / kg. Furosemide 100 mg / kg + Kanamycin 500 mg / kg,
Furosemide 100 mg / kg + Kanamycin 1.000 mg / kg dan Furosemide 200 mg / kg
+ Kanamycin 100 mg / kg kelompok diberikan kedua obat pada dosis yang
diindikasikan. Semua tikus menunjukkan perilaku normal dan makan setelah
pemberian obat, dan tidak ada tanda-tanda fungsi vestibular abnormal yang
diamati. Perawatan dan penggunaan hewan disetujui oleh Komite Perawatan dan
Penggunaan Hewan Institusional Rumah Sakit Umum PLA Cina, Cina.
 Pengukuran batang otak auditori (ABR).
Pengukuran ABR dilakukan seperti yang dijelaskan sebelumnya (Liberman
et al., 2002). Secara singkat, tikus dibius dengan injeksi intramuskular xylazine
(0,1 mg / kg) dan ketamin (30 mg / kg). Elektroda rekaman disisipkan pada titik
dan pinna. ABR dibangkitkan dengan klik dan / atau 5-ms tone pips (0,5 ms naik /

3
turun dengan durasi 2 ms) pada frekuensi 4, 8, 16 dan 32 kHz. Sinyal diperkuat,
disaring, dan dirata-ratakan menggunakan sistem Smart EP (Sistem Pendengaran
Cerdas, Miami, FL, USA). Tingkat suara dinaikkan dalam langkah 20 dan / atau
5-dB. Di setiap tingkat, 1.024 tanggapan dirata-ratakan. Kedua telinga diukur.
 Immunocytochemistry dan scanning electron microscopy (SEM)
Koklea disempurnakan dengan formaldehida 4,0% dan dibedah dalam 0,01
M PBS. Dinding tulang dan ligamentum spiral dilepas dengan hati-hati, dan organ
korti dipisahkan dari modiolus dan disimpan dalam PBS. Corti yang dibedah
diobati dengan 0,2% Triton X-100 / PBS. Serum kambing (10%) digunakan untuk
memblokir pengikatan non spesifik. Jaringan kemudian diinkubasi dengan ayam
anti-200 kDa Neurofilament Heavy polyclonal (diencerkan 1: 200; Abcam,
Cambridge, MA, USA) selama 48 jam pada pengocok pada 4 ° C. Sampel dicuci
dengan PBS, diikuti dengan inkubasi selama 1 jam pada 37 ° C dengan antibodi
sekunder anti-ayam kelinci (Alexa Fluor 488; Invitrogen, Grand Island, NY,
USA). Untuk noda nuklei, jaringan diinkubasi dengan pewarna Hoechst spesifik
DNA (10 mg / mL; Polysciences) selama 1 jam pada suhu kamar, seperti yang
dijelaskan sebelumnya (Yang et al., 2009b). Sampel dipasang pada slide kaca
dengan larutan antifade (Prolong Antifade Kit, Molecular Probe) dan diperiksa
menggunakan sistem pemindaian confocal (LSM 510 META, Zeiss, Oberkochen,
Jerman).
Untuk SEM, koklea difiksasi dengan glutaraldehid 2,5% dalam 0,1 M buffer
natrium cacodylate (pH 7,4) yang mengandung 2 mM CaCl2, dicuci dalam PBS,
dan dipasang setelah 15 menit dengan 1% OsO4 dalam buffer yang sama.
Jaringan mengalami dehidrasi dalam serangkaian etanol, pengeringan titik kritis
menggunakan CO2, sputter-dilapisi dengan emas, dan kemudian diperiksa
menggunakan mikroskop elektron scanning Hitachi S-3700N (Hitachi, Tokyo,
Jepang).
 Pewarnaan Hematoxylin-eosin (HE)
Tikus dari masing-masing kelompok sangat dibius dengan uretana (1,5 g /
kg, secara intraperitoneal), diikuti oleh perfusi transkapal dengan garam fisiologis
dan fiksatif paraformaldehid 4%. Setelah koklea dikeluarkan dari tulang temporal,
ia disempurnakan lagi dengan 4% fiksasi paraformaldehida dalam 10 mM PBS.

4
Cochleae didekalsifikasi dengan 10% ethylenediamine tetraacetic acid semalam
pada 4 ° C dalam lemari es. Semua koklea dibilas di PBS dan dicuci selama 30
menit dengan rotasi 20% sukrosa pada suhu kamar dan dipertahankan semalam
pada 4 ° C dalam larutan sukrosa 20%. Cochleae ditempatkan di cryomold di
bawah mikroskop bedah dan diisi setengahnya dengan OCT. Cochleae
ditempatkan di OCT dan berorientasi dengan menyelaraskan pesawat imajiner
melalui paralel modiolus ke bagian bawah cetakan embedding. Cetakan kemudian
segera ditempatkan dalam bak mandi es / etanol kering. Bagian delapan mikron
dipotong dengan Leica Cryomicrotome 2800 (Leica Microsystems, Heidelberg,
Germany). Bagian dipasang di Fisherbrand Superfrost plus slide. Pewarnaan HE
dilakukan seperti yang dijelaskan sebelumnya (Llewellyn, 2009).
 Sel ganglion spiral, sel rambut, sel rambut bagian dalam, dan sel
rambut bagian luar.
Jumlah neuron ganglion spiral ditentukan seperti yang dijelaskan
sebelumnya (Murillo-Cuesta, 2010). Secara singkat, neuron dihitung dalam 3
putaran pada sisi yang sama dari modiolus. Di setiap bagian, semua neuron yang
mengandung nukleus dengan ukuran soma lebih besar dari 20 μm dihitung. Kami
menghitung jumlah bundel dari tiga lokasi koklea (masing-masing 1-mm panjang)
dari enam cochleae normal (kelompok kontrol) sebagai referensi. Enam cochleae
dari Furosemide 200 mg / kg, Kanamycin 1.000 mg / kg, Furosemide 100 mg / kg
+ Kanamycin 500 mg / kg, Furosemide 100 mg / kg + Kanamycin 1.000 mg / kg,
dan Furosemide 200 mg / kg + Kanamycin 100 mg / Kelompok kg juga diperiksa.
Ketiga situs tersebut adalah 14,5–15,5, 10,5–11,5 dan 4,0–5,0 mm dari ujung
basal membran basilar. Status bundel ditentukan oleh inspeksi visual bundel di
bawah mikroskop elektron scanning (Hitachi S-3700N).
 Analisis statistik
Semua data disajikan sebagai mean ± SD dan dianalisis menggunakan perangkat
lunak statistik STATA7.0 (StataCorp LP, College Station, TX, USA). Student's t-
test digunakan, dan nilai P <0,05 dianggap signifikan.

5
4. Hasil
 Efek Ototoksik dari furosemide dan kanamycin pada pengukuran ABR
Pengukuran ABR dilakukan pada tiga titik waktu (3 hari, 1 minggu dan 2
bulan) setelah pemberian obat untuk menguji apakah pemberian kombinasi
furosemide dan kanamycin mampu menginduksi kehilangan pendengaran jangka
panjang yang stabil. Gambar 1 menunjukkan ambang ABR rata-rata untuk setiap
kelompok yang diukur pada empat frekuensi (4, 8, 16 dan 32 kHz). Dibandingkan
dengan kelompok kontrol pada setiap titik waktu, ambang ABR dari kelompok
yang menerima kanamisin atau furosemida saja (Furosemide 200 mg / kg dan
Kanamycin 1.000 mg / kg kelompok) tidak menunjukkan perubahan signifikan
pada salah satu dari empat frekuensi (Gambar 1; P> 0,05). Sebaliknya, pada
kelompok yang menerima kedua obat (Furosemide 100 mg / kg + Kanamycin 500
mg / kg, Furosemide 100 mg / kg + Kanamycin 1.000 mg / kg dan Furosemide
200 mg / kg + Kanamycin 100 mg / kg kelompok), ABR ambang batas secara
signifikan meningkat dibandingkan dengan kelompok kontrol atau kelompok
Furosemide 200 mg / kg pada masing-masing dari empat frekuensi yang berbeda
(P <0,01). Dosis tinggi kanamisin menyebabkan gangguan pendengaran yang
lebih parah, yang ditunjukkan oleh peningkatan yang lebih besar dalam ambang
ABR di Furosemide 100 mg / kg + Kanamycin 1.000 mg / kg kelompok
dibandingkan dengan kelompok Furamemide 200 mg / kg + Kanamycin 100 mg /
kg. Anehnya, ambang ABR terlalu tinggi untuk dideteksi bahkan ketika intensitas
stimulus terbesar (110 dB SPL) diberikan. Pada 3, 7 dan 30 hari, nilai ambang
ABR di antara kelompok yang berbeda dibandingkan, dan tidak ada perbedaan
signifikan yang diamati.
 Efek Ototoksik dari furosemide dan kanamycin pada sel-sel rambut
pendengaran
Untuk memeriksa efek ototoksik dari furosemide dan kanamycin pada sel-
sel rambut pendengaran, kami melakukan SEM dalam membran basilar pada 1
minggu setelah pemberian obat. Pada kelompok yang diobati dengan furosemid
atau kanamisin saja (kelompok Furosemide 200 mg / kg dan Kanamycin 1.000 mg
/ kg), stereocilia sel rambut dalam dan sel rambut luar pada lempeng kutikuler
menunjukkan bentuk dan organisasi yang normal (Gambar 2) , seperti yang

6
terlihat pada kelompok kontrol (Gambar 2). Dalam kelompok Furosemide 100 mg
/ kg + Kanamycin 500 mg / kg, bagaimanapun, stereocilia dari sel-sel rambut luar
benar-benar habis dalam putaran basal sementara tetap utuh di belokan apikal dan
tengah (Gambar 2). Stereosilia sel-sel rambut bagian dalam tetap utuh di seluruh
membran basilar. Pengamatan serupa dilakukan di Furosemide 100 mg / kg +
Kanamycin 1.000 mg / kg kelompok, di mana stereocilia sel-sel rambut luar
benar-benar hilang dalam membran basilar, sedangkan stereocilia dari sel-sel
rambut bagian dalam tetap utuh di belokan apikal dan secara sporadis hadir di
belokan tengah, tetapi benar-benar hilang dalam putaran basal. Sebagai
perbandingan, penipisan menyeluruh stereocilia dari kedua sel rambut bagian
dalam dan sel rambut luar diamati di seluruh membran basilar dalam kelompok
Furosemide 200 mg / kg + Kanamycin 100 mg / kg. Jaringan parut pada membran
basilar juga diamati.
Untuk mengukur kerusakan bundel yang disebabkan oleh furosemide dan
kanamycin sulfate, jumlah total bundel sel rambut dalam dan sel rambut luar
dihitung (Gambar 3A,, B) .B). Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 3, injeksi
gabungan furosemide dan kanamycin sulfate menyebabkan penurunan yang
signifikan dalam jumlah bundel sel rambut dalam dan luar dalam Furosemide 100
mg / kg + Kanamycin 500 mg / kg, Furosemide 100 mg / kg + Kanamycin 1.000
mg / kg dan Furosemide 200 mg / kg + Ka- namycin 100 mg / kg kelompok
dibandingkan dengan kelompok kontrol (P <0,01 untuk kedua sel rambut dalam
dan luar, Student's t-test). Namun, pemberian tunggal furosemide atau kanamycin
sulfate menyebabkan kerusakan kurang, dan tidak ada perbedaan yang signifikan
antara kelompok kontrol dan Furosemide 200 mg / kg kelompok atau Kanamycin
1.000 mg / kg kelompok diamati (P> 0,05).
 Perubahan jumlah sel ganglion spiral setelah hilangnya sel-sel rambut
Sel ganglion spiral di Furosemide 200 mg / kg + Kanamycin 100 mg / kg
kelompok dihitung pada titik waktu yang berbeda setelah pemberian obat. Seperti
yang ditunjukkan pada Gambar 5, 3 hari setelah pemberian obat, sel-sel rambut
hampir menghilang, tetapi kerangka organ Corti tampak utuh. Beberapa sel
rambut tetap ada, dan sel pendukung dan sel ganglion spiral tampak tidak
terpengaruh (Gambar 4). Munculnya sel ganglion spiral adalah serupa 7 hari

7
setelah pemberian obat dalam kelompok ini. Namun, 1 bulan setelah pemberian
obat, sel-sel rambut telah benar-benar hilang, dan kerangka organ Corti telah
runtuh. Beberapa sel basal diamati, tetapi sebagian besar sel ganglion spiral
hilang. Dua bulan setelah pemberian obat, kerusakan sel ganglion spiral lebih
parah dibandingkan dengan titik waktu lainnya. Tidak ada perbedaan yang
signifikan dalam jumlah sel ganglion spiral antara Furosemide 200 mg / kg +
Kanamycin 100 mg / kg kelompok (92,9 ± 0,5 pada 3 hari, 90,7 ± 0,8 pada 7 hari)
dan kelompok kontrol (99,1 ± 0,7, P> 0,05; Gambar 4). Namun, 1 dan 2 bulan
setelah pemberian obat, jumlah sel ganglion spiral secara signifikan lebih rendah
pada kelompok Furosemide 200 mg / kg + Kanamycin 100 mg / kg (31,2 ± 0,9,
28,0 ± 0,9) dibandingkan pada kelompok kontrol (99,1 ± 0,7, P <0,01; Gambar 4).
 Keracunan sinergis dari furosemide dan kanamycin pada neurofilamen
dan sel ganglion spiral.
Pewarnaan immunofluorescence mengungkapkan bahwa, pada kelompok
kontrol pada 7 hari, neurofilamen (dalam warna hijau) dan sel-sel rambut dalam
dan sel-sel rambut luar (merah) pada membran basilar dari koklea terorganisasi
dengan baik (Gambar 5A). Sebaliknya, dalam kelompok Furosemide 200 mg / kg
+ Kanamycin 100 mg / kg, sel-sel rambut diselesaikan tidak teratur dan
neurofilamen pecah 7 hari setelah pemberian obat (Gambar 5B). Di bidang fokus
yang sama, tidak ada kerusakan nuklir yang jelas pada sel ganglion spiral.

5. Diskusi
Tikus Sprague-Dawley digunakan dalam penelitian ini karena mereka lebih
cocok daripada spesies hewan pengerat lainnya untuk pembentukan model
ketulian. Pertama, biaya tikus kurang untuk berkembang biak daripada babi
guinea. Kedua, tikus lebih bisa menerima operasi koklea karena mereka memiliki
ukuran tubuh yang lebih besar daripada tikus. Loop diuretik, seperti furosemid
dan asam ethacrynic, telah terbukti menyebabkan edema dan degenerasi kistik
dari vaskular stratiser koklea, penurunan besarnya potensial aksi koklea, inhibisi
K + -Na + -ATPase, dan induksi edema dari sel-sel rambut luar di organ korti
(Henly dan Rybak, 1995). Ototoksik antibiotik aminoglikosida, seperti kanamisin,
terutama terhadap sel-sel rambut koklea, dan menghasilkan gangguan

8
pendengaran yang tidak dapat diubah (Wastrotrom dan Bredberg, 1986). Dalam
percobaan hewan, suntikan tunggal dari dosis konvensional loop diuretik, seperti
furosemide, dapat menyebabkan gangguan pendengaran yang reversibel karena
gangguan sementara mikrosirkulasi dari vaskular stria koklea. Sebagai
perbandingan, suntikan tunggal dosis konvensional antibiotik aminoglikosida,
seperti kanamisin, sering tidak menyebabkan disfungsi telinga bagian dalam atau
perubahan patologis. Hanya setelah beberapa suntikan, nekrosis besar sel-sel
rambut dapat terjadi karena akumulasi konsentrasi tinggi kanamisin dalam cairan
perilymph dan ekskresi yang tertunda (Alam et al., 1998; Murillo-Cuesta et al.,
2010). Dalam penelitian ini, kami menemukan bahwa suntikan tunggal kanamisin
atau furosemid tidak menyebabkan peningkatan ambang ABR atau kehilangan sel
rambut pada tikus. Kami berspekulasi bahwa kurangnya efek ini mungkin
disebabkan oleh titik waktu setelah pemberian obat yang ambang batas ABR
diukur. Karena efek loop diuretik pada vaskularis stria koklea bersifat sementara,
pendengaran mungkin telah pulih ke normal 3 hari setelah pemberian obat (ketika
tes ABR pertama dilakukan). Penelitian lain menunjukkan bahwa pemberian
antibiotik dosis rendah tidak menyebabkan perubahan signifikan pada epitel
sensoris koklear (Murillo-Cuesta et al., 2010).
Penelitian sebelumnya telah menunjukkan bahwa loop diuretik dan
aminoglikosida mungkin saling memperkuat ototoksitas (Brummett et al., 1979).
Yamane dkk. (1988) melaporkan bahwa furosemide dapat mendorong masuknya
kanamisin ke dalam getah telinga bagian dalam, meningkatkan ototoksisitas
kanamisin. Penelitian kami juga menunjukkan bahwa furosemide dan kanamycin
memiliki efek ototoksik yang sinergis. Furosemide merusak sawar darah-labirin,
menyebabkan perubahan permeabilitas, yang menyebabkan masuknya kanamisin
ke telinga bagian dalam meningkat. Furosemide juga dapat merusak fungsi
ekskretoris vaskular stria koklear, menyebabkan ekskresi lebih lambat,
menghasilkan akumulasi kanamisin yang lebih besar di telinga bagian dalam.
Ketika furosemide diberikan pada dosis rendah 100 mg / kg, elevasi ambang ABR
berkorelasi positif dengan dosis kanamycin (dalam kisaran tertentu). Injeksi
gabungan furosemide (100 mg / kg) dan kanamycin (500 mg / kg) menyebabkan
sedikit peningkatan pada ambang ABR. Injeksi kanamisin pada dosis tinggi

9
(1.000 mg / kg) menyebabkan peningkatan ambang ABR yang signifikan. Ketika
dosis tinggi furosemide diberikan (200 mg / kg), dosis kanamisin yang sangat
kecil (100 mg / kg) cukup untuk meningkatkan ambang ABR menjadi> 110 dB
SPL pada setiap frekuensi. Hasil SEM konsisten dengan ambang ABR. Ketika
dosis rendah furosemide (100 mg / kg) diberikan, hilangnya sel rambut koklea
berkorelasi positif dengan dosis kanamisin dalam kisaran tertentu. Ketika dosis
tinggi furosemide diberikan (200 mg / kg), dosis kanamisin yang sangat kecil (100
mg / kg) cukup untuk menyebabkan hilangnya semua sel rambut dalam dan luar di
koklea. Kami berspekulasi bahwa sementara dosis rendah furosemide (100 mg /
kg) hanya menyebabkan kerusakan ringan pada vaskularis stria, penghalang
darah-labirin sebagian dan sementara terganggu, memungkinkan kanamisin untuk
perlahan-lahan terakumulasi di getah bening. Oleh karena itu, dosis besar
kanamisin (1.000 mg / kg) dapat menyebabkan cedera parah pada sel rambut
koklea. Ketika dosis besar furosemide (200 mg / kg) diberikan, itu menyebabkan
kerusakan yang lebih besar pada vaskularis stria, kemungkinan mengganggu
penghalang labirin darah untuk jangka waktu yang lama, memungkinkan
kanamisin untuk memasuki getah bening dengan cepat. Russell dkk. (1979)
menyimpulkan bahwa perbedaan ototoksitas pada hewan yang berbeda mungkin
disebabkan perbedaan dalam tingkat clearance kanamycin dan asam ethacrynic,
dan bahwa efek racun dari aplikasi gabungan terutama tergantung pada dosis asam
ethacrynic. Studi kami juga menunjukkan bahwa ketika dosis asam ethacrynic
rendah, bahkan dosis tinggi kanamisin hanya bisa mencapai 53,3% sel rambut
rontok. Ketika dosis asam ethacrynic tinggi, kanamisin dosis rendah
menyebabkan hilangnya sel rambut lengkap.
Tuli yang disebabkan oleh aplikasi gabungan furosemide dan kanamycin
pada tikus adalah simetris bilateral dan gangguan pendengaran terjadi 3 hari
setelah pemberian obat. Studi patologi pada koklea tikus dengan tuli menemukan
bahwa kerusakan sel rambut koklea selalu berangsur-angsur mengembang dari
putaran basal koklea ke belokan apikal, dan kerusakan pada sel-sel rambut luar
selalu mendahului sel-sel rambut bagian dalam. Sel-sel rambut luar mungkin
memiliki kapasitas yang lebih besar untuk mengakumulasi kanamycin, dan sel-sel
rambut pada putaran basal mungkin memiliki kemampuan yang lebih besar

10
daripada sel-sel rambut pada belokan apikal. Kami berspekulasi bahwa sel-sel
rambut di lokasi yang berbeda mungkin memiliki kapasitas pengambilan obat
yang berbeda terkait dengan distribusi transporter obat pada membran sel (Ding et
al., 2007). Sel-sel rambut pada putaran basal juga memiliki lebih banyak saluran
stereocilia dan transduksi. Penelitian telah menunjukkan bahwa setelah suntikan
intramuskular kanamisin, degenerasi sel pendukung terjadi jauh lebih lambat
daripada sel-sel rambut, dan bahwa degenerasi sel ganglion spiral dan serabut
saraf terjadi jauh kemudian. Oleh karena itu, diduga bahwa kerusakan pada sel
indera telinga bagian dalam adalah akar penyebab gangguan pendengaran
kanamisin (Alam et al., 1998). Hasil kami konsisten dengan penelitian
sebelumnya ini. Namun, kami menemukan bahwa penggunaan gabungan
furosemide dan kanamycin tidak hanya menyebabkan kerusakan pada epitel
sensorik telinga bagian dalam (Gambar 2,, 5), 5), itu juga menyebabkan cedera
pada serabut saraf pendengaran.
Nourski dkk. (2004) menemukan bahwa asam ethacrynic dan kanamycin
menghasilkan cedera sel rambut tanpa menyebabkan penghambatan signifikan
dari respon saraf pendengaran. Perbedaan antara temuan mereka dan temuan kami
mungkin karena perbedaan titik waktu pengamatan. Titik waktu pengamatan
berada dalam 10 jam setelah pemberian obat dalam penelitian Nourski, sementara
pengamatan kami dilakukan antara 3 hari dan 2 bulan setelah pemberian obat. Ada
kemungkinan bahwa serabut saraf pendengaran tidak rusak dalam 10 jam setelah
pemberian obat, dan kerusakan dapat terjadi secara perlahan. Furosemide adalah
loop diuretik, dan studi tentang ototoksitas (Rybak et al., 1992) telah
menunjukkan bahwa furosemide dapat menyebabkan perubahan patologis dalam
sel perbatasan dari vaskularis stria, dan tingkat edema dalam sel perbatasan
merupakan indikator utama ototoksitas yang disebabkan oleh loop diuretik.
Vaskularis stria memainkan peran penting dalam menjaga lingkungan mikro
telinga bagian dalam, yang diperlukan untuk fungsi normal dan kelangsungan
hidup sel-sel rambut (Patuzzi, 2011).
Degenerasi sel ganglion spiral setelah trauma koklea adalah sekunder akibat
hilangnya sel-sel rambut bagian dalam (Sugawara et al., 2005). Diperkirakan

11
bahwa hilangnya stimulasi dari sel-sel rambut bagian dalam memainkan peran
kunci dalam proses degeneratif.
Singkatnya, kami menetapkan model tuli tikus melalui administrasi tunggal
furosemide atau kanamisin serta dengan administrasi gabungan. Kami
menemukan bahwa hanya kombinasi pemberian kanamisin dan furosemid yang
mengakibatkan gangguan pendengaran yang parah. Selanjutnya, cedera sel rambut
luar koklea lebih parah daripada cedera pada sel-sel rambut bagian dalam.
Mayoritas sel pendukung tidak rusak. Kerusakan sel ganglion spiral tidak tampak
jelas setelah pemberian obat, tetapi kerusakan pada serabut saraf pendengaran
terlihat. Tidak ada regenerasi sel rambut yang diamati. Ketika dosis tinggi
furosemide digunakan, bahkan dosis kanamisin yang rendah menyebabkan
kerusakan parah pada koklea. Injeksi tunggal furosemide atau kanamisin
menghasilkan sedikit atau tidak ada kerusakan koklea.

6. Catatan kaki
Pendanaan: Penelitian ini didukung oleh hibah dari Program Nasional pada
Proyek Penelitian Dasar Utama China (973 Program), No. 2011CBA01000,
2012CB967900.
Konflik kepentingan: Tidak ada yang dinyatakan.
Disalin oleh Barry P, Raye W, Li CH, Lagu LP, Zhao M.

12
Referensi

Alam SA, Ikeda K, Kawase T, Kikuchi T, Katori Y, Watanabe K, Takasaka T.

Acute effects of combined administration of kanamycin and furosemide on the
stria vascularis studied by distortion product otoacoustic emission and
transmission electron microscopy. Tohoku J Exp Med. 1998;186:79–86.
[PubMed: 10223612]

Brummett RE, Brown RT, Himes DL. Quantitative relationships of the ototoxic
interaction of kanamycin and ethacrynic acid. Arch Otolaryngol. 1979;105:240–
246. [PubMed: 435146]

Ding D, Jiang H, Salvi RJ. Mechanisms of rapid sensory hair-cell death following
co-administration of gentamicin and ethacrynic acid. Hear Res. 2010;259:16–23.
[PMCID: PMC2814920] [PubMed: 19715747]

Ding D, Jiang H, Wang P, Salvi R. Cell death after co-administration of cisplatin

and ethacrynic acid. Hear Res. 2007;226:129–139. [PubMed: 16978814]

He J, Yin S, Wang J, Ding D, Jiang H. Effectiveness of different approaches for

establishing cisplatin-induced cochlear lesions in mice. Acta Otolaryngol.
2009;129:1359–1367. [PubMed: 19922082]

Henley CM, Rybak LP. Ototoxicity in developing mammals. Brain Res Brain Res
Rev. 1995;20:68–90. [PubMed: 7711768]

Liberman MC, Gao J, He DZ, Wu X, Jia S, Zuo J. Prestin is required for

electromotility of the outer hair cell and for the cochlear amplifier. Nature.
2002;419:300–304. [PubMed: 12239568]

Llewellyn BD. Nuclear staining with alum hematoxylin. Biotech Histochem.

2009;84:159–177. [PubMed: 19579146]

Murillo-Cuesta S, Contreras J, Cediel R, Varela-Nieto I. Comparison of different

aminoglycoside antibiotic treatments to refine ototoxicity studies in adult mice.
Lab Anim. 2010;44:124–131. [PubMed: 19858169]

13
Nourski KV, Miller CA, Hu N, Abbas PJ. Co-administration of kanamycin and
ethacrynic acid as a deafening method for acute animal experiments. Hear Res.
2004;187:131–133. [PubMed: 14698094]

Patuzzi R. Ion flow in stria vascularis and the production and regulation of
cochlear endolymph and the endolymphatic potential. Hear Res. 2011;277:4–19.
[PubMed: 21329750]

Russell NJ, Fox KE, Brummett RE. Ototoxic effects of the interaction between
kanamycin and ethacrynic acid. Cochlear ultrastructure correlated with cochlear
potentials and kanamycin levels. Acta Otolaryngol. 1979;88:369–381. [PubMed:
532612]

Rybak LP, Whitworth C, Weberg A, Scott V. Effects of organic acids on the

edema of the stria vascularis induced by furosemide. Hear Res. 1992;59:75–84.
[PubMed: 1629050]

Staecker H, Praetorius M, Baker K, Brough DE. Vestibular hair cell regeneration

and restoration of balance function induced by math1 gene transfer. Otol
Neurotol. 2007;28:223–231. [PubMed: 17255891]

Sugawara M, Corfas G, Liberman MC. Influence of supporting cells on neuronal

degeneration after hair cell loss. J Assoc Res Otolaryngol. 2005;6:136–147.
[PMCID: PMC2538335] [PubMed: 15952050]

Wästerström SA, Bredberg G. Ototoxicity of kanamycin in albino and pigmented

guinea pigs. II. A scanning electron microscopic study. Am J Otol. 1986;7:19–24.
[PubMed: 3946576]

West BA, Brummett RE, Himes DL. Interaction of kanamycin and ethacrynic
acid. Severe cochlear damage in guinea pigs. Arch Otolaryngol. 1973;98:32–37.
[PubMed: 4713139]

Xu SA, Shepherd RK, Chen Y, Clark GM. Profound hearing loss in the cat
following the single co-administration of kanamycin and ethacrynic acid. Hear
Res. 1993;70:205–215. [PubMed: 8294265]

14
Yamane H, Nakai Y, Konishi K. Furosemide-induced alteration of drug pathway
to cochlea. Acta Otolaryngol Suppl. 1998;447:28–35. [PubMed: 3055805]

Yang SM, Chen W, Guo WW, Jia S, Sun JH, Liu HZ, Young WY, He DZ.
Regeneration of stereocilia of hair cells by forced Atoh1 expression in the adult
mammalian cochlea. PLoS One. 2012;7:e46355. [PMCID: PMC3459923]
[PubMed: 23029493]

Yang SM, Hou ZH, Yang G, Zhang JS, Hu YY, Sun JH, Guo WW, He Dz, Han
DY, Young WY, Yang X. Chondrocyte-specific Smad4 gene conditional
knockout results in hearing loss and inner ear malformation in mice. Dev Dyn.
2009a;238:1897–1908. [PubMed: 19582869]

Yang SM, Guo WW, Hu YY, Sun YX, Hou ZH, Sun JH, Wang X, He DZ, Zhai
SQ, Young WY, Han DY, Yang X. Smad 5 haploinsufficiency leads to hair cell
and hearing loss. Dev Neurobiol. 2009b;69:153–161. [PubMed: 19067324]

Zhou Y, Ding D, Kraus KS, Yu D, Salvi RJ. Functional and structural changes in
the chinchilla cochlea and vestibular system following round window application
of carboplatin. Audiol Med. 2009;7:189–199. [PMCID: PMC2800309] [PubMed:
20046821]

15
Gambar dan Tabel

Gambar 1

Auditory brainstem response (ABR) ambang tikus diukur pada 3 dan 7 hari
dan 2 bulan setelah suntikan furosemide dan / atau kanamycin sulfate.
Dalam kelompok yang menerima obat (Furosemide 100 mg / kg +
Kanamycin 500 mg / kg, Furosemide 100 mg / kg + Kanamycin 1.000 mg / kg,
Furosemide 200 mg / kg + Kanamycin 100 mg / kg), ambang ABR meningkat
secara signifikan dibandingkan dengan kelompok kontrol atau dengan kelompok
Furosemide 200 mg / kg pada semua frekuensi yang diuji (P <0,01). Data
dinyatakan sebagai mean ± SD dari 15 tikus di setiap kelompok dan dianalisis
menggunakan Student's t-test.

16
Gambar 2

Scanning mikroskop electron untuk mengevaluasi toksisitas koklea suntikan

furosemide dan / atau kanamisin sulfat pada tikus 1 minggu setelah pemberian
obat.
A1-A3, B1-B3 dan C1-C3 menunjukkan putaran basal, tengah dan apikal
dari koklea tikus dalam kontrol, Furosemide 200 mg / kg dan Kanamycin 1.000
mg / kg, masing-masing. Satu baris sel-sel rambut dalam (IHCs) dan tiga baris sel
rambut luar (OHCs) diamati. D1 – D3 menunjukkan putaran basal, tengah dan
apikal dalam kelompok Furosemide 100 mg / kg + Kanamycin 500 mg / kg. Pada
belokan apikal dan tengah, satu baris IHC dan tiga baris OHC dapat diamati. The
IHCs utuh di giliran basal, sedangkan OHCs benar-benar hilang. E1-E3

17
menunjukkan putaran basal, tengah dan apikal dalam kelompok Furosemide 100
mg / kg + Kanamycin 100 mg / kg. Di belokan apikal, IHCs masih utuh,
sementara OHC benar-benar hilang. Di belokan tengah, IHCs secara ekstensif
hilang, sementara OHC hilang sepenuhnya. Di belokan basal, baik IHCs dan OHC
benar-benar hilang. F1 – F3 menunjukkan putaran basal, tengah dan apikal dalam
kelompok Furosemide 200 mg / kg + Kanamycin 100 mg / kg. IHC dan OHC di
seluruh rumah siput hilang. Batang skala: 10 μm.

Gambar 3

Jumlah stereocilia dalam jumlah yang normal (tanpa injeksi) dan suntikan
koklea pada 1 minggu setelah pemberian obat.
(A, B) Jumlah sel-sel rambut dalam (A) dan bundel sel rambut luar (B).
Data disajikan sebagai mean ± standar deviasi (SD) dari enam cochleae di
masing-masing kelompok. Status bundel ditentukan oleh inspeksi visual dari
bundel di bawah mikroskop elektron scanning. Rambut bundel tanpa tanda-tanda
yang jelas dari trungsi, fusi atau lipat dimasukkan dalam jumlah bundel. Student t-
test digunakan untuk analisis statistik. ** P <0,05, *** P <0,01. Kotak berwarna
pada setiap histogram dari kiri ke kanan menunjukkan enam kelompok, yaitu
kontrol, Furosemide 200 mg / kg, Kanamycin 1.000 mg / kg, Furosemide 100 mg
/ kg + Kanamycin 500 mg / kg, Furosemide 100 mg / kg + Kanamycin 1.000 mg /
kg dan Furosemide 200 mg / kg + Kanamycin 100 mg / kg, masing-masing.

18
Gambar 4

Pewarnaan Hematoxylin-eosin bagian beku dari koklea (A-E) dan spiral

ganglion (SG) jumlah sel (F) pada tikus yang tidak diobati dan pada tikus
diberikan suntikan furosemide dan kanamycin sulfate (Furosemide 200 mg / kg +
Kanamycin 100 mg / kelompok kg) pada 3 dan 7 hari dan 1 dan 2 bulan setelah
pemberian obat.
Morfologi koklea pada kelompok kontrol (A) dan di Furosemide 200 mg /
kg + Kanamycin 100 mg / kg kelompok (B-E). Sel-sel rambut (HCs) hampir
menghilang sepenuhnya, tetapi sel SG utuh pada 3 dan 7 hari setelah pemberian
obat. HCs benar-benar tidak ada, dan sebagian besar sel SG hilang pada 1 dan 2
bulan setelah pemberian obat. Batang skala: 20 μm. (F) Jumlah sel SG dalam
kontrol dan Furosemide 200 mg / kg + Kanamycin 100 mg / kg kelompok pada 3
dan 7 hari dan 1 dan 2 bulan setelah pemberian obat. Data dinyatakan sebagai
mean ± SD (n = 6). *** P <0,001, ** P <0,01, * P <0,05.

19
Gambar 5

Pewarnaan immunofluorescence seluruh persiapan membran basilar koklea

dalam kelompok kontrol (A) dan Furosemide 200 mg / kg + Kanamycin 100 mg /
kg kelompok (B) 7 hari setelah pemberian obat.
Jumlah serabut saraf pendengaran di Furosemide 200 mg / kg + Kanamycin
100 mg / kg kelompok berkurang dibandingkan dengan kelompok kontrol. Dalam
kelompok kontrol, barisan lengkap IHC dan tiga baris OHC terlihat. Panah
menunjuk ke kontak antara HCs dan serabut saraf. Setelah cedera, serabut saraf
rusak. Fluoresensi hijau menunjukkan serabut saraf dan sel SG diwarnai dengan
neurofilamen-spesifik antibodi, dan fluoresensi biru menunjukkan nuklei inti
Hoechststained. Batang skala: 20 μm. IHC: Sel rambut bagian dalam; OHC: sel
rambut luar; HC: sel rambut; SG: ganglion spiral.

20