Perkiraan Variasi Secara Elektroforetik

Teknik elektroforesis pertama diterapkan untuk menaksir variasi genetik di populasi alami
pada tahun 1966. Ketika tiga studi dipublikasikan satu penelitian manusia dan 2 pada
Drosophilla. Banyak populasi dari organisme dapat diselidiki mulai saat itu, dan banyak lagi
dipelajari tiap tahun. Dua studi akan diulas disini.
Tabel 22.9 menunjukkan daftar 20 lokus variable dari 71 lokus sampel pada populasi dari
orang Eropa. Simbol digunakan untuk menunjukkan lokus, enzim dikode oleh lokus dan
frekuensi dari heterozigositas individu pada lokus diberikan untuk setiap 20 lokus variabel.
Heterozigositas dari populasi adalah jumlah dari penyusun heterozigositas pada 20 lokus
variabel dibagi dengan total dari lokus sampel = 4,73/71 = 0,067.
Tabel di bawah ini menggambarkan heterozigositas pada 20 variabel gen loci yang keluar
dari 71 loci sampel dalam populasi dari Eropa yang dihasilkan dengan elektroforesis.
Lokus gen Enzim yang dikode Heterozigositas
ACP1 Acid phosphatase 0,52
PGM1 Phosphoglucomutase-1 0,36
PGM2 Phosphoglucomutase-2 0,38

AK Adenylate kinase 0,09

PEPA Peptidase-A 0,37
PEPC Peptidase-C 0,02
PEPD Peptidase-D 0,02
ADA Adenosine deaminase 0,11
PGD Phosphogluconate dehydrogenase 0,05
ACP2 Alkaline phosphatase (placental) 0,53
AMY2 α-amilase (prancreatic) 0,09
GPT Glutamate-pyvurate transaminase 0,50
GOT Glutamate-oxaloacetate transaminase 0,03
GALT Galactose-1-phosphat uridyltransferase 0,11

ADH2 Alcohol dehydrogenase-2 0,07

ADH3 Alcohol dehydrogenase-3 0,48
PG Pepsinogen 0,47
ACE Acetylcholinesterase 0,23
ME Malic enzyme 0,30
 HK Hexokinase (white-cell) 0,05
Rata-rata heterozigositas (termasuk 51 loci invarian) 0,067

Total 39 lokus gen yang mengkode enzim telah dipelajari dalam populasi ikan marin air
panas (Phillum pharanida) phacanopsis viridis dari Bodega Bay, California. Tabel di bawah
ini memberi symbol yang digunakan unt uk mewakili 27 lokus yang padanya tidak
ditemukan 2 alel. Tabel ini menunjukkan observasi dan menunjukkan heterozigositas
sebagaimana lokus yang polimorfik ketika kriteria polimorfisme pada frekuensi alel yang
paling umum tidak lebih besar dari 0,95. Dengan kriteria 28,2% dari 39 lokus yang dipelajari
adalah polimorfik. Bagaimanapun dengan menggunakan 0,99 kriteria polimorfisme 20 dari
39 lokus atau 51,2% adalah polimorfik. Heterozigositas yang diobservasi adalah 7,2%
berkemungkinan lebih sedikit dari pada heterozigositas 9,4%. Perbedaan ini mungkin terjadi
pada keakuratan dan fertilisasi sendiri karena P.viridis adalah hewan hermaprodit.
Tabel di bawah ini menggambarkan frekuensi alela pada 27 variabel loci dalam 120 individu
cacing lautPhoromopsis viridis. Angka digunakan untuk menunjukkan alela (1, 2, 3 dan
seterusnya) yang mengindikasikan peningkatan mobilitas dalam elektrik medium dari protein
yang dikode oleh beberapa alela.

Lokus Frekuensi alela Heterozigot Polimorfik

gen <1
1 2 3 4 5 6 Yg Yg
Diamati Diharapkan

Acph- 0,095 0,005 0,010 0,010 Tidak

1

Acph- 0,009 0,066 0,882 0,014 0,005 0,024 0,160 0,217 Ya

2
Adk-1 0,472 0,528 0,224 0,496 Ya
Est-2 0,008 0,992 0,017 0,017 Tidak
Est-3 0,076 0,924 0,151 0,140 Ya
Est-5 0,483 0,396 0,122 0,443 0,596 Ya
Est-6 0,010 0,979 0,012 0,025 0,041 Tidak
Est-7 0,010 0,990 0,021 0,021 Tidak
Fum 0,986 0,014 0,028 0,028 Tidak
αGpd 0,005 0,995 0,010 0,010 Tidak

G3pd- 0,040 0,915 0,017 0,011 0,011 0,006 0,159 0,161 Ya

1
G6pd 0,043 0,900 0,057 0,130 0,185 Ya
Hk-1 0,996 0,004 0,008 0,008 Tidak
Hk-2 0,005 0,978 0,016 0,043 0,043 Tidak

Idk 0,992 0,008 0,017 0,017 Tidak

Lap-3 0,038 0,962 0,077 0,074 Tidak
Lap-4 0,014 0,986 0,028 0,027 Tidak
Lap-5 0,004 0,551 0,326 0,119 0,542 0,576 Ya
Mdh 0,008 0,987 0,004 0,025 0,025 Tidak
Me-2 0,979 0,021 0,042 0,041 Tidak
Me-3 0,017 0,824 0,159 0,125 0,296 Ya
Odh-1 0,992 0,008 0,017 0,017 Tidak
Pgi 0,995 0,005 0,010 0,010 Tidak
Pgm-1 0,159 0,827 0,013 0,221 0,290 Ya
Pgm-3 0,038 0,874 0,071 0,017 0,185 0,229 Ya

Tpi-1 0,929 0,071 0,000 0,133 Ya

Tpi-2 0,008 0,004 0,962 0,013 0,013 0,076 0,074 Tidak
Rata-rata (termasuk 12 invarian loci)
Heterozigot 0,072 0,094
Polimorfisme 11/9=0,282

Tabel di atas juga menunjukkan frekuensi alel pada 27 lokus variabel. Jumlah alel per lokus
berkisar hanya 1 (pada 12 lokus varian) sampai 6 (pada lokus Acph-2 dan G3pd-10. Lokus
dengan jumlah alel yang lebih besar tidak selalu mempunyai heterozigositas yang lebih besar.
Sebagai contoh, observasi dan penelitian heterozigositas pada lokus Acph-2 adalah masing-
masing 0,16 dan 0,17 sedangkan pada lokus Adk-1 hanya mempunyai 2 alel dengan
heterozigositas 0,222 dan o,496.
Gambar di bawah ini menunjukkan distribusi heterozigot diantara 180 studi loci dalam 6
hubungan spesiesDrosophilla. Karakteristiknya, distribusi penyebarannya luas (jarak H dari
O sampai 0,6 s) dan semuanya tidak menyerupai distribusi normal.
Penelitian dengan elektroforesis mengindikasikan bahwa sekitar 20 gen loci sampel
biasanya cukup, perkiraan heterozigositas biasanya berubah sedikit pada jumlah gen loci
sampel yang lebih dari 20. Misalnya, nilai H = 0,072 yang diperoleh dari manusia yang
menggunakan 26 gen loci sampel. Ketika sampel total sampai 71 loci, maka perkiraan
menjadi H = 0,067.

Gambar 2. Distribusi heterozigisitas diantara 180 gen loci yang dipelajari melalui
elektroforesis dalam 6 spesies kelompok Drosophilla willistoni. Rata-rata heterozigositas
untuk 180 loci adalah 0.177.

Variasi Genetik pada Populasi Alami

Umumnya, inventebrata mempunyai lebih banyak variasi genetic dari pada vertebrata.
Pada kebanyakan manusia, dengan 6,7% keheterozigotannya dapat terdeteksi dengan
elektrophoresis. Jika diasumsikan terdapat 30000 lokus gen structural pada manusia,
keheterozigotannya seseorang menjadi 30000 x 0,067 = 2010 lokus. Individu secara teoritis
dapat menghasilkan 22010 = 10403
Penghitungan mengindikasikan bahwa dua gamet manusia adalah tidak sama atau
identik dan tidak ada dua individu manusia yang sekarang, telah ada sebelumnya atau ada di
waktu yang akan datang terlihat identik pada gen-gen.
Teknik elektroforesis telah membuat ini mungkin untuk memperkirakan variasi
genetic pada populasi alami. Ada dua hal untuk membuat perkiraan yang baik dari variasi
genetic:
a) Bahwa sampel secara acak dari semua lokus gen dipelihara
b) Bahwa semua alela terdeteksi pada setiap lokus
Beberapa metode digunakan untuk mendeteksi perbedaan muatan protein yang tidak dikenali
dengan teknik standart elektrophoresis. Salah satu metodenya adalah elektrophoresis sekuen
terdiri dari elektrophoresis dari sampel yang sama pada berbagai kondisi. Metode lain adalah
sampel jaringan atau enzim untuk temperatur yang tinggi. Teknik lain adalah pemetaan
protein atau sidik jari protein setelah mencerna tripsin atau beberapa enzim lain yang
menghidrolisis polipeptida ke sejumlah kecil peptide yang disubjekkan ke dua kromatograpi
dimensional atau kromatograpy pada satu dimensi dan elektroporesis yang lain.
Berdasarkan pengamatan diperoleh ringkasan hasil yang didapatkan dengan elektroporesis
sekuan dan dua metode denaturasi. Rata-rata keheterozigotan adalah 0,04 dengan
elektrophoresis sekuen dan sekitar 0,08 dengan metode denaturasi atau meningkat pada
variasi jumlah 25%. Metode ini digunakan untuk membuka dan menutupnya variasi cryptic
ketika sampel lokus adalah 0,81 hingga 0,410 yang dilihat pada populasi Drosophila, ketika
sampel acak dari lokus yang diuji.
Jumlah variasi mutan yang dideteksi pada lokus adalah dari Drosophila melanogaster dengan
tiga metode yang berbeda. Pemetaan protein yang mendeteksi lebih banyak variasi cryptic
dari pada teknik yang lain. Jika kita mengasumsikan harga 20% untuk mendeteksi perkiraan
dari sejumlah variasi protein cryptic, kita dapat menghitung varisi protein yang ditentukan
secara genetic dalam populasi alami. Dengan standart elektrophresis H=0,134 untuk
invertebrate nc= 1/1 (1-0,134)=1,15 dan nc’= 1,2x 1,15=1,38 dimana H’=0,28. Untuk
vertebrata nc=1,28 dan H’=0,22 dan untuk tanaman nc’= 1,37 dan H’=0,22 dan untuk
tanaman nc’=1,37 dan H’=0,27. Rata-rata keheterozigotan menjadi hampir dua kali untuk
invertebrate dan tanaman serta tiga kali untuk vertebrata.

DNA Polymorphisme
Sebagian kecil dari semua perbedaan pada rangkaian DNA yang digambarkan dalam variasi
protein. Perbedaan antara codon synonymous tidak mengubah asam amino yang dikodekan,
dan 90% atau lebih dari DNA menjadi tidak diterjemahkan ke dalam protein. DNA yang
tidak diterjemahkan termasuk mencampuri antara rangkaian (intron-intron) dan daerah
pengkode (exon-exon) seperti rangkaian intergenik yang memisahkan satu gen dari gen
berikutnya. Kita mungkin bertanya berapa banyak variasi genetic (perbedaan pada rangkaian
DNA) yang ada melebihi yang mempengaruhi rangkaian asam amino dari protein (meskipun
banyak dari variasi DNA yang ditambahkan mungkin sedikit yang mempunyai sifat adaptive
yang signifikan dari variasi yang berasal dari rangkaian DNA yang dimodifikasi). Batasan
analisis endonuklease dan rangkaian DNA telah diungkap untuk menyelidiki masalah ini.
Gambar 22.14 menunjukkan perbedaan antara 2 alela, berasal dari 2 kromosom homolog dari
sebuah individu tunggal dari gen ^γ globin pda manusia. Ada 13 substitusi dari satu
nukleotida oleh yang lain dan 3 segmen dihapus pada slah satu dari alela (atau diinsersi
kedalam yang lain). Tidak ada substitusi yang terjadi didalam exons, hampir (9) dipusatkan
pada ujung 5’ sepanjang intron. 2 delesi yang mesing-masing panjangnya 4 np (posisi 741-
744 dan 791-794 dari rangkaian); yang ketiga terdiri dari 18 pasang nukleotida yang
berdekatan (mulai pada posisi 1080).
Jiga gen ^γ adalah tipe contohnya, ini kelihatan seperti tingkatan dari rangkaian DNA setiap
individu yang disilangkan akan menjadi heterozigot mendekati semua, jika tidak semua, loci
–ini, jika rangkaian nonkoding ditulis dalam catatan. Pertanyaan dari kebutuhan
heterozigot menjadi diformulasikan pada akhir dari proporsi dari perbedaan nukleotida, yang
mungkin disebut heterozigot nukleotida atau keanekaragaman nukleotida. Mencoba
menjawab pertanyaan ini, kita menemui beberapa hal ambigu. Jika hanya substitusi yang
dipertimbangkan, heterozigosity nukleotida dari ^γ adalah 13/1647 = 0.008. tetapi jika delesi
juga ditulis dalam catatan, berapa banyak yang dijumlahkan? Jika masing-masing segmen
yang dihapus dijumlahkan sebagai satu perbedaan yang tidak terikat (independen) dari
panjangnya, ada 3 tambahan perbedaan antara 2 alela dan heterozigositasnya adalah 16/1647
= 0.010; jika masing-masing nukleotida yang dihapus dijumlahkan sebagai satu perbedaan,
heterozygosity adalah 39/1647 = 0.024 (tabel 22.15).
Heterozigositas nukelotida pada gen yang lain untuk 2 alela yang tidak terikat telah dirangkai
pada tabel 22.15. 3 gen (Adh pada Drosophila, C pada tikus, dan ^γ pada manusia)
mempunyai substitusi heterozigosity mendekati 1% atau beberapa lebih tinggi. Rangkaian
DNA dari Adh dan C termasuk hanya pada daerah koding, dan kemudian tidak ada delesi
yang diamati. Untuk gen insulin substitusi heterozigosity hanya 1.003, tetapi daerah sisi 5’
berisi sebuah delesi/insersi dari 467 pasangan nukleotida yang berdekatan, yang didalamnya
sebuah rangkaian yang tinggi berulang.
Daerah konstan pada rantai berat dari immunoglobulin tikus terdiri dari 8 protein. Salah
satunya, γ2a, diketahui berbeda secara luas dari satu strain tikus yang dikawinkan sesama
jenis dari yang lain. Gen IgG2a,mengkode untuk protein ini telah dirangkai dalam 2 strain.
Dari 1108 rangkaian basa , 111 (10%) berbeda. Hanya 18 (16.2 %) dari substitusi nukleotida
adalah diam; hasil yang lain asam amino berbeda pada 15% dari tempatnya. Ada alasan yang
mengira bahwa variasi yang diobservasi pada gen IgG2a tikus mungkin bukan menjadi tipe
dari loci yang structural. Gen immunoglobulin adalah sangat polymorphic; 2 alela dirangkai
datang dari 2 strain yang kawin sesama bangsa, disbanding dengan dari individu yang kawin
berbeda bangsa, 2 protein telah diketahui menjadi sangat berbeda sebelum DNA dirangkai.
Tentu saja frekuensi dari perbedaan asam amino antara produk 2 alela adalah satu pesanan
dari jarak terbesar daripada rata-rata diobservasi pada jenis lain dari protein.
Perkiraan dari heterozigosity nukleotida telah dihasilkan pada 4 spesies urchin laut oleh
denaturasi DNA diikuti dengan gabungan yang competitive (hibridisasi). Teknik ini tidak
tepat tetapi keuntungannya yaitu untuk menguji kadar logam pada genom komplit dari suatu
organisme. Akibat dari copy DNA tunggal disimpulkan pada tabel 22.16. Diperkirakan
frekuensi dari substitusi nukleotida sekitar 2-4%.
Setelah koreksi selama substitusi diam, 2-4% substitusi nukleotida pada terjemahan DNA
menghasilkan 5-9% perbedaan asam amino. Pada studi electrophoretic dari sistem enzim
pada S.intermedius telah memberikan sebuah perkiraan heterozigosity 0.18, yang sangat tidak
berbeda dari rata-rata nilai untuk invertebrate (lihat tabel 22.11). Jika kita memperkirakan
bahwa H= 0.18 kurang lebih koresponden untuk perbedaan asam amino per 5 protein, dan
bahwa rata-rata panjang dari protein adalam 300 asam amino, data electrophoretic harus
direfleksikan jadi satu substitusi per 1500 asam amino. Nilai heterozigosity dihasilkan dari
data gabungan sekitar 100 kali lebih besar (5-9% substitusi asam amino sekitar I dalam 15).
Perbedaan mungkin pada bagian ketidakmampuan untuk mendeteksi semua substitusi asam
amino dengan electrophoresis. Tetapi itu kelihatan seperti proporsi terluas dari
keanekaragaman nukleotida diobservasi dengan gabungan yang meliputi DNA yang tidak
mengkode untuk asam amino. Pada banyak kasus, yang pantas menerima peringatan tentang
frekuensi dari heterozigosity nukleotida diobservasi dengan hibridisasi DNA (2-4%) tidak
sangat berbeda dari nilai 1-2% dihasilkan dengan merangkai genAdh, C , dan ^γ.
Kita bisa menyimpulkan, dengan cara dari sebuah perkiraan sementara sampai data lebih
tersedia, yang rata-rata heterozigositas nukleotida untuk gen structural dan rangkaian DNA
tunggal yang lain dari makhluk hidup eukariot sekitar 1 atau 2%.