BAB V

PERHITUNGAN MIKROBA

5.1 Tujuan Percobaan

- Menghitung jumlah koloni mikroorganisme dalam sampel dengan metode
cawan sebar.
- Menghitung jumlah koloni mikroorganisme dalam sampel dengan metode
cawan tuang.
- Menghitung jumlah koloni mikroorganisme dalam sampel dengan metode
MPN.
5.2 Teori Dasar
Jumlah mikroba pada suatu bahan dapat ditentukan dengan berbagai macam
cara. Pada umumnya ada 3 cara pengitungan jumlah mikroba, yakni perhitungan jumlah
sel, perhitungan massa sel secara langsung, dan perhitungan massa sel secara tidak
langsung.
A. Perhitungan jumlah sel
Pengukuran kuantitatif populasi mikroba sering diperlukan dalam berbagai
penelaahan mikrobiologi. Pengukuran dasar populasi mikroba dengan perhitungan
jumlah sel (untuk mikroba bersel tunggal) dan perhitungan massa sel (untuk mikroba
bersel tunggal dan mikroba berfilamen seperti jamur).
1. Hitungan Mikroskopik Langsung
Penghitungan mikroba secara lansung dapat untuk menentukan jumlah
mikroba secara keseluruhan, baik yang mati maupun hidup. Cara ini secara
keseluruhan menggunahkan counting chamber. Alat atau metode dapat
menggunakan colony counter, bacteria colony, dan lain-lainnya.
Beberapa cara pengitungan mikrosokopik langsung:
a. Metode Petroff-Hausser
Hitungan mikroskopik merupakan metode yang cepat dan murah, tetapi
mempunyai kelemahan, sebagai berikut:
- Sel-sel mikroba yang telah mati tidak dapat dibedakan dari sel yang hidup.
Karena itu keduanya terhitung.
- Sel-sel yang berukuran kecil sukar dilihat dibawah mikroskop, sehingga kalau
tidak teliti tidak terhitung.
- Tidak dapat digunakan untuk menghitung sel mikroba di dalam bahan yang
mengandung debris atau ekstrak makanan, karena hal tersebut akan
mengganggu dalam perhitungan sel. [2]
b. Metode Breed
Metode ini sering digunakan untuk menganalisis susu yang mengandung
bakteri dalam jumlah tinggi.
Kelebihan metode ini:
 - Cara ini merupakan suatu cara cepat, yaitu menghitung bakteri langsung
dengan menggunakan mikroskop.
Kelemahan metode ini:
- Tidak dapat dilakukan terhadap susu yang dipasteurisasi karena tidak dapat
dibedakan antar sel bakteri yang hidup atau yang telah mati. [2]
2. Metode Cawan
Hal yang perlu dikuasai dalam hal ini adalah teknik pengenceran. Prinsip
dari metode hitungan cawan adalah bila sel mikroba yang masih hidup ditumbuhkan
pada medium, maka mikroba tersebut akan berkembang biak dan membentuk koloni
yang dapat dilihat langsung, dan kemudian dihitung tanpa menggunakan mikroskop.
a. Metode tuang
Pada metode tuang sejumlah sampel (1 ml atau 0,1 ml) dari pengenceran
yang dikehendaki dimasukkan ke dalam cawan petri, kemudian ditambah agar-
agar cair steril yang telah di dinginkan (45-50o) sebanyak 15-20 ml dan
digoyangkan supaya sampelnya menyebar. Jumlah koloni dalam sampel dapat
dihitung dengan sebagai berikut:
1
Jumlah koloni = jumlahkoloni per cawan ×
faktor pengencera n
Laporan hasil hitungan dengan cara hitungan cawan menggunakan
Standard Plate Counts :
- Cawan yang dihitung adalah yang mengandung jumlah koloni antara 30-300.
- Beberapa koloni yang bergabung menjadi satu merupakan satu kumpulan
koloni yang besar dimana jumlah koloninya diragukan dapat dihitung sebagai
koloni.
- Satu deretan rantai koloni yang terlihat sebagai suatu garis tebal dihitung
sebagai satu koloni.
- Tidak ada koloni yang menutup lebih besar dari setengah luas petri disk.
Koloni tersebut disebut spreader.
- Perbandingan jumlah bakteri hasil pengenceran yang berturut-turut antar
pengenceran yang lebih besar dengan pengenceran sebelumya. Jika sama atau
lebih kecil dari 2 hasilnya di rata-rata. Tetapi jika lebih besar dari 2 yang
dipakai jumlah mikroba dari hasil pengenceran sebelumnya.
b. Metode Sebar
- Mengencerkan 3 tabung PCA (Plate Count Agar) dalam air mendidih.
- Mendinginkan agar dalam penangas air (50oC) selama 5-10 menit.
- Menuangkan agar ke cawan petri dan membiarkan membeku (10-15 menit).
Tandai cawan dengan kode dan tingkat pengenceran.
- Membuat pengeceran dari sampel, mulai dari kecil sampai besar.
- Gunakan alat penyebar untuk meratakan suspensi di atas permukaan
lempengan agar.
- Cawan petri dibalik dan dimasukkan almari pengeram dengan suhu tertentu
 selama 24-48 jam.
- Menghitung koloni pada cawan yang mempunyai jumlah 30-300 koloni.
- Menghitung jumlah mikroba hidup dengan mengalikan faktor pengenceran
yang digunakan dikalikan 10 karena hanya 0,1 ml suspensi yang digunakan
memperoleh CFU/ml (Colony Forming Units).
3. Metode MPN (Most Probable Number)
Metode hitungan cawan dengan menggunakan medium padat, tetapi pada
metode MPN dengan menggunakan medium cair di dalam tabung reaksi.
Perhitungan MPN berdasarkan pada jumlah tabung reaksi yang positif, yakni dengan
ditumbuhi oleh mikroba setelah inkubasi pada suhu dan waktu tertentu. Pengamatan
tabung yang positif dapat dilihat dengan mengamati timbulnya kekeruhan atau
terbentuknya gas di dalam tabung kecil (tabung durham) yang diletakkan pada posisi
terbalik, yaitu jasad renik yang membentuk gas. Nilai MPN dapat dihitung dengan
rumus sebagai berikut: [2]
1
MPN sampel = nilai MPN 
pengencera n tabung tengah
Metode MPN dapat digunakan untuk menghitung jumlah mikroba tertentu
yang terdapat diantara campuran mikroba lain. Misalnya jika digunakan medium
kaldu laktosa, ditunjukkan dengan terbentuknya gas dalam tabung durham. Cara ini
dapat digunakan untuk menentukan MPN kelompok bakteri koliform, termasuk juga
bakteri-bakteri yang dapat memfermentasikan laktosa. [1]
Tabel MPN adalah sebagai berikut:
Jumlah tabung positif
MPN
Seri A Seri B Seri C

0 0 0 0,03
0 0 1 0,03
0 0 2 0,06
0 0 3 0,09
0 1 0 0,03
0 1 1 0,61
0 1 2 0,092
0 1 3 0,12
0 2 0 0,62
0 2 1 0,93
0 2 2 0,12
0 2 3 0,16
0 3 0 0,094
0 3 1 0,13
0 3 2 0,16
0 3 3 0,19
1 0 0 0,036
1 0 1 0,072
1 0 2 0,11
1 0 3 0,15
1 1 0 0,073
1 1 1 0,11
1 1 2 0,15
1 1 3 0,19
1 2 0 0,11
1 2 1 0,15
1 2 2 0,20
1 2 3 0,24
1 3 0 0,16
1 3 1 0,20
1 3 2 0,24
1 3 3 0,29
2 0 0 0,091
2 0 1 0,14
2 0 2 0,20
2 0 3 0,26
2 1 0 0,15
2 1 1 0,20
2 1 2 0,27
2 1 3 0,34
 2 2 0 0,21
2 2 1 0,28
2 2 2 0,35
2 2 3 0,42
2 3 0 0,29
2 3 1 0,36
2 3 2 0,44
2 3 3 0,53
3 0 0 0,23
3 0 1 0,39
3 0 2 0,64
3 0 3 0,95
3 1 0 0,43
3 1 1 0,75
3 1 2 0,20
3 1 3 0,60
3 2 0 0,93
3 2 1 1,50
3 2 2 2,10
3 2 3 2,90
3 3 0 2,40
3 3 1 4,60
3 3 2 11,00
3 3 3 24,00

4. Perhitungan Massa Sel Secara Tidak Langsung

a. Analisis komponen sel (protein, ADN, ATP, dan sebagainya).
b. Analisis produk katabolisme (metabolit primer dan sekunder, panas).
c. Analisis komposisi nutrisi (karbon, nitrogen, oksigen, asam amino, mineral, dan
sebagainya). [2]
Perhitungan massa sel secara tidak langsung sering digunakan dalam
mengamati pertumbuhan sel selama proses fermentasi, di mana komponen substrata
tau bahan yang difermentasi dapat diamati dan diukur. [1]
5. Perhitungan Masa Sel Secara Langsung
a. Cara volumetrik
b. Cara gravimetrik
c. Turbidimetri (kekeruhan)
Dalam perhitungan massa sel secara langsung, jumlah mikroorganisme
dapat dihitung jika medium pertumbuhanya tidak mengganggu pengukuran. Metode
volumetrik dan gravimetrik, pengukuran volume dan berat sel dilakukan terlebih
dahulu dengan menyaring mikroorganisme tersebut. Oleh karena itu, bila substrat
tempat tumbuhnya banyak mengandung padatan, misalnya bahan pangan, sel
mikroorganisme tidak dapat diukur dengan menggunakan metode volumetrik
maupun dengan turbidimetri. [1]
5.3 Alat dan Bahan
Alat: Bahan:
 Bunsen  air Laboratorium Kimia Analis
 cawan petri  kaldu nutrisi
 Colony counter  KFL (Kaldu Fermentasi Laktosa)
 Deckglass  nutrisi agar
 gelas ukur
 inkubator
 karet penghisap
 kawat ose
 mikroskop
 pipet tetes
 pipet volume
 preparat
 rak tabung reaksi
 spatel bengkok
 tabung durham

5.4 Prosedur percobaan

A. Tahap Pengenceran
- Ambil 1 mL air sampel dan tambahkan dengan 99 mL kaldu nutrisi steril, di sebut
pengenceran 10-2
- Ambil 1 mL dari pengenceran 10-2 dan tambahkan dengan 99 mL kaldu nutrisi
steril, disebut pengenceran 10-3
- Ulangi percobaan seperti di atas sampai pengenceran 10-7
B. Metode Cawan Sebar
- Ambil media nutrisi agar steril secukpunya dan tuang ke dalam cawan petri dan
biarkan sampai dingin
- Setelah media dingin dan padat masukkan 1 mL air sampel dari pengenceran 10-4
- Ratakan dengan spatel bengkok yang telah disterilkan secara aseptic
- Setelah padat inkubasi dengan posisi terbalik selama 24-48 jam pada suhu 37°C
- Hitung jumlah koloni dengan Colony Counter.
C. Metode Cawan Tuang
- Ambil 1 mL sampel dari pengenceran 10-4 dan tuang ke dalam cawan petri
bersamaan dengan media nutrisi agar steril (kondisi panas)
- Tutup dan biarkan hingga dingin dan padat
- Inkubasi dengan posisi terbalik selama 24-48 jam pada suhu 37°C
- Hitung jumlah koloni dengan Colony Counter
D. Metode MPN
- Siapkan 9 tabung reaksi
- 3 tabung reaksi seri A, 3 tabung reaksi seri B, dan 3 tabung reaksi seri c.
- Masukkan 1mL air sampel dari pengenceran 10-5, 10-6, 10-7 untuk masing-masing
tabung seri A, B, C
- Masukkan tabung durham pada semua tabung reaksi dengan posisi mulut tabung
dibawah
- Isi semua tabung reaksi dengan 9 mL KFL
- Tutup tabung reaksi dengan kapas/ tissue
- Inkubasi selama 24-48 jam pada suhu 37°C
- Amati perubahan pada tabung durham dan hitung jumlah tabunh positif untuk
masing-masing seri tabung
- Gunakan tabel MPN untuk perhitungan
METODE CAWAN
1
Jumlahkoloni = jumlahkoloni per cawan ×
faktor pengencera n
METODE MPN
1
Jumlahkoloni = nilai MPN ×
angka pengencera n tabung tengah
5.5 Data Pengamatan
Tabel 5.5.1. Data Pengamatan Perhitungan Mikroba

No Perlakuan Pengamatan
1 Metode cawan sebar
Penganceran 10-4 pada
sampel
a. Setelah inokulasi Warna : Putih bening
Pertumbuhan mikroba : Menyebar
b. Setelah inkubasi Makro
24-48 jam - Warna : Putih tulang
- Jumlah koloni : 1018
Mikro
- Warna : Hitam
- Bentuk : Batang Panjang
- Lensa Objektif :4
- Lensa Okuler : 10 x
- Perbesaran : 40 x
- Gambar :

2 Metode cawan tuang

Pengecetan 10-4 pada
sampel
a. Setelah inokulasi
Warna : Putih langsat
Pertumbuhan mikroba : Banyak yang berkoloni
b. Setelah inkubasi Pengamata makro
24-48 jam - Warna : Putih agak keruh
- Jumlah koloni : 258
Pengamatan mikro
- Warna : Hitam
- Bentuk : Batang panjang
 - Lensa Objektif :4x
- Lensa Okuler : 10 x
- Perbesaran : 45 x
Gambar :

3 Metode MPN pada 1. Pengenceran 10-5

sampel
- Warna : Putih
a. Setelah inokulasi
- Keadaan larutan : Bening
2. Pengenceran 10-6
- Warna : Putih
- Keadaan larutan : Bening
3. Pengenceran 10-7
- Warna : Putih
- Keadaan larutan : Bening

1. Pengenceran 10-5
b. Setelah inkubasi - Warna :Bening
24-48 jam - Keadaan larutan : Ada gelembung
- Tabung positif :3
- Tabung negatif : -
Mikro
- Warna : Hitam
- Bentuk : Batang panjang
- Gambar : (bacilus)
2. Pengenceran 10-6
- Warna : Bening
- Keadaan larutan : Ada gelembung
- Tabung positif :1
- Tabung negatif : 2
Mikro
- Warna : Hitam
- Bentuk : Batang panjang
- Gambar : (bacilus)

3. Pengenceran 10-7
- Warna : Bening
- Keadaan larutan : Ada gelembung, ada
sedikit endapan putih
- Tabung positif :1
- Tabung negatif : 2
Mikro
- Warna : Hitam
- Bentuk : Spiral, batang panjang
- Gambar :
5.6. Perhitungan
A. Metode Cawan Sebar
Diketahui: jumlah koloni pada cawan sebar adalah 1018
1
Jumlah koloni per cawan = jumlah koloni per cawan×
faktor pengencera n

1
= 1018 
10  4
= 1018× 104
= 10.180.000 koloni/ml
B. Metode Cawan Tuang
Diketahui: jumlah koloni pada cawan tuang adalah 258
1
Jumlah koloni per cawan = jumlahkoloni per cawan×
faktor pengencera n
1
= 258 
10 4
= 258× 104
= 2.580.000 koloni/ml
C. Metode MPN
Jumlah tabung positif dari pengenceran 10-5 (A) adalah 3
Jumlah tabung positif dari pengenceran 10-6 (B) adalah 1
Jumlah tabung positif dari pengenceran 10-7 (C) adalah 1
Untuk mengetahui nilai MPN-nya dapat dilihat pada keterangan table angka MPN
untuk 9 tabung yaitu 0,75.
1
Jumlah koloni per cawan = nilai MPN 
pengencera n tabung tengah
1
= 0,75
10 6

= 0,75 × 106

= 75 x 104

= 750.000 koloni/ml

5.6 Pembahasan
 - Pengenceran dilakukan dengan tujuan untuk memisahkan sel-sel yang
bergabung menjadi satu (berkoloni) sehingga mempermudah pengamatan.
- Semakin tinggi pengenceran maka semakin kecil jumlah koloni bakteri.
Dengan kata lain tingkat pengenceran berbanding terbalik jumlah koloni
bakteri.
- Pada kedua metode, yaitu metode cawan sebar dan metode cawan tuang di
berikan pengenceran 10-4 karena pada pengenceran ini konsentrasinya stabil
dan tidak terlalu pekat serta tidak terlalu encer sehingga keberadaan mikroba
sangat mungkin terjadi.
- Pada saat diinkubasi posisi cawan petri harus dibalik. Hal itu dilakukan agar
uap atau air yang timbul dari penguapan media tidak jatuh ke mikroba sehingga
tidak mengakibatkan kontaminasi, karena air merupakan media utama mikroba
untuk tumbuh.
5.7 Kesimpulan
- Hasil perhitungan yang menggunakan metode cawan sebar 1018 x 104
koloni/mL.
- Hasil perhitungan yang menggunakan metode cawan tuang 258 x 104
koloni/mL.
- Hasil perhitungan yang menggunakan MPN 75 x 104 koloni/mL.
5.8 Saran
- Dalam praktikum, saat kita melakukan pengenceran. Ketika pengambilan air
sampel atau pemipetan harus kita lakukan dengan seteliti mungkin, karena jika
dalam pemipetan terjadi kesalahan teknis maka kesempatan mikroba yang
tersebar secara acak dalam pelarut terambil dengan tidak merata. Hal tersebut
berpengaruh besar terhadap hasil yang diperoleh.
- Saat melakukan inkubasi, penempatan cawan petri harus tepat, yaitu dengan
posisi terbalik.
- Kita harus teliti saat melakukan perhitungan mengunahkan colony counter,
karena banyak kesalahan terjadi dalam perhitungan jumlah koloni akibat
kurang telitinya kita saat mengamati.
 DAFTAR PUSTAKA

1. Waluyo, Lud. 2007. Mikrobiologi Umum. UMM Press. Malang

2. Waluyo, Lud. 2008. Teknik Metode Dasar Mikrobiologi. Malang
3. www.damandiri.or.id/file/asmikaharnalinsimarmataipblampiran1.pdf