Setosphaeria turcica (anamorph Exserohilum turcicum dan sebelumnya dikenal

sebagai Helminthosporium turcicum) adalah jamur patogen tanaman yang

menyebabkan hawar daun jagung utara (NCLB). Ini adalah penyakit daun yang parah
dan ada di mana-mana yang semakin menjadi masalah di seluruh dunia . Patogen S.
turcica ditandai dengan variasi dan diferensiasi fisiologis yang signifikan .
Pertumbuhan, perkembangan, dan patogenisitas jamur patogen tanaman diatur
oleh jalur transduksi sinyal ekstraseluler [6]. Secara khusus, tiga jalur pensinyalan
utama mungkin ada dalam jamur patogen, yaitu, Ca2 +, siklik adenosin monofosfat
(cAMP), dan jalur mitogen-activated protein kinase (MAPK). Dalam beberapa tahun
terakhir, studi tentang Jalur transduksi sinyal MAPK, yang mengatur pertumbuhan,
perkembangan, patogenisitas, dan respons stres pada patogen jamur tanaman, telah
menjadi fokus dalam bidang penelitian transduksi sinyal sel [7,8,9,10]. Studi terbaru
telah melaporkan bahwa jalur kaskade HOG-MAPK, FUS3 / KSS1-MAPK, dan CWI-
MAPK, yang berbagi homologi tinggi dengan bentuk MAPK yang sesuai dalam
Saccharomyces cerevisiae, juga diidentifikasi dalam jamur patogen tanaman [13,14,15
, 16]. Penelitian sebelumnya mengungkapkan bahwa Msn2 terlibat dalam regulasi
respon stres osmotik dan oksidatif, konstruksi dinding sel, dan proses patogenetik pada
beberapa jamur patogen . Namun, sedikit yang diketahui tentang StMsn2 di S. turcica.
Dalam penelitian ini, StMSN2 dari S. turcica dikloning, diekspresikan, dan
dimurnikan dalam E. coli BL21 (DE3). Selanjutnya, antibodi poliklonal terhadap
StMsn2 disiapkan untuk mengidentifikasi StMsn2 di S. turcica. Studi ini tidak hanya
akan memberikan wawasan baru untuk memahami mekanisme regulasi StMsn2 tetapi
juga meletakkan dasar untuk menemukan target obat baru dan mengembangkan
pendekatan yang efektif untuk mencegah penyakit jamur.

Bahan dan Metode : Bahan, vektor, dan kondisi kultur regangan

Strain jamur yang digunakan dalam penelitian ini adalah S. turcica wild-type (WT)
strain 01-23, yang dikultur pada medium PDA (Potato Dextrose Agar, 20% kentang,
2% dekstrosa, dan 1,5% agar) dan diinkubasi pada 25 ° C selama 7 hari [29]. Total
RNA dari S. turcica diekstraksi menggunakan UNIQ-10 kolom Trizol total RNA
Extraction Kit (Tiangen, China) mengikuti instruksi pabrik. Kit pereaksi PrimeScript
™ RT dengan gDNA Eraser (Tiangen, China) digunakan untuk transkripsi balik cDNA
pertama. E. coli DH5α dan BL21 (DE3) (Transgene, China) yang kompeten disiapkan
untuk konstruksi vektor dan ekspresi protein. Strain E. coli yang mengandung plasmid
pET-28a dan plasmid pET-28a-StMSN2 yang direkonstruksi ditanam dalam medium
LB (Luria-Bertani, triptone 1,0%, ekstrak ragi 0,5%, ekstrak ragi 0,5%, dan 1,0%
natrium klorida) dengan 100 μg ml-1 kanamisin pada suhu 37 ° C.
Tahapan – tahapan penelitian sebagai berikut:
 Kloning cDNA full-length StMSN
 Ekspresi prokariotik dan pemurnian StMsn2 rekombinan
 Analisis Western blot untuk StMsn2 rekombinan-Nya
 Karakterisasi StMSN2
 Konstruksi dan identifikasi vektor rekombinan pET-28a-StMSN2
 Ekspresi StMSN2 dalam E. coli BL21 (DE3)
 Purifikasi dan verifikasi protein rekombinan
 Analisis epitop antigen dan identifikasi antibodi poliklonal StMsn2

Gambar. 2. Konstruksi vektor pET-28a-StMSN2. (A) Diagram skematis dari vektor

pET-sample-StMSN2; (B) Gambar gel mengkonfirmasikan vektor rekombinan pET-
28a-StMSN2, dicerna dengan EcoRI dan HindIII. Jalur 1 mewakili sampel, dan M
menunjukkan penanda DNA DL2503.
Gambar 5. Konfirmasi spesifik antibodi poliklonal terhadap StMsn2. (A) Deteksi
tingkat ekspresi StMsn2 endogen di S. turcica oleh Western blotting. Jalur M: penanda
massa molekul protein; Jalur 1: serum nonimun (pengenceran 1: 2000) bereaksi dengan
sel lisat yang berasal dari sel S. turcica; Jalur 2. (B) Antibodi poliklonal mengikat
protein StMsn2 eksogen, yang diekspresikan dalam E. coli BL21 (DE3). Jalur 1: Serum
nonimun yang bereaksi dengan sel lisat yang berasal dari sel E. coli BL21 (DE3); Jalur
2: serum imun (antibodi Msn2-2, pengenceran 1: 100) bereaksi dengan sel lisat yang
berasal dari sel E. coli BL21 (DE3).

Diskusi
Sistem ekspresi prokariotik, yang menguntungkan karena manipulasi yang sederhana
dan cepat, biaya rendah, dan produksi protein yang tinggi, telah banyak digunakan
dalam mengekspresikan gen heterolog. Namun, ia juga memiliki dua kelemahan utama.
Pertama, ia memiliki lingkungan yang sangat sangat reduktif dalam cytosol E. coli,
yang membuatnya tidak dapat melakukan modifikasi pasca-translasi eukariotik dan
biasanya menghasilkan pembentukan protein yang tidak larut [31,32]. Kedua, konversi
protein dari tubuh inklusi menjadi protein larut adalah proses yang sangat sulit dan
rumit. Oleh karena itu, banyak faktor harus dipertimbangkan sebelum protein heterolog
diekspresikan dalam sistem prokariotik [33,34]. Dalam penelitian ini, berhasil
memperoleh StMsn2 dalam sistem prokariotik, dan tingkat ekspresinya meningkat
dengan meningkatnya waktu menggunakan metode konvensional. Dalam kondisi
induksi 1 mM IPTG, pada 37 ° C, protein target terdeteksi setelah 10 menit, dan
sejumlah besar StMsn2 terdeteksi setelah 4 jam, yang dapat memenuhi kebutuhan
percobaan berikutnya. Faktor paling penting yang dipertimbangkan ketika kita
mengoptimalkan ekspresi gen heterolog dalam sistem prokariotik adalah analisis pra-
ekspresi termasuk situs inisiasi transkripsi, konten GC, ukuran protein, hidrofobik, dan
struktur sekunder [31]. Kemudian, ini diikuti oleh optimasi kodon ke gen target, yang
memastikan bahwa protein larut dinyatakan dalam E. coli. Mendapatkan sejumlah
besar protein StMsn2 sangat penting untuk mempelajari lebih lanjut fungsi dan
mekanismenya, karena penelitian StMsn2 di S. turcica masih dalam tahap awal. Lebih
lanjut, gen target yang menyatu dengan tag secara heterologis diekspresikan dalam E.
coli adalah metode yang paling disukai untuk mendeteksi dan memurnikan protein.
Teknik persiapan antibodi, yang merupakan alat penting dalam penelitian ilmu
kehidupan modern, memainkan peran yang sangat diperlukan dalam studi fungsi gen
dan diagnosis imunologis pada manusia, hewan, dan tumbuhan. Antigen protein utuh
atau peptida sintetik biasanya digunakan untuk mengimunisasi hewan untuk
mendapatkan antibodi menggunakan metode tradisional, yang memakan waktu dan
melelahkan [35]. Namun, sel-sel kekebalan biasanya tidak mengenali seluruh molekul
antigen dan hanya membedakan bagian tertentu dari antigen, yang disebut penentu
antigenik epitop [36]. Dalam penelitian ini, antibodi poliklonal StMsn2 disiapkan
menggunakan epitop antigen metode, yang lebih efektif, nyaman, dan hemat waktu.
Antibodi dapat digunakan sebagai bahan penting dalam percobaan lain seperti
kromatin imunopresipitasi, untuk menentukan gen target hilir yang diatur oleh StMsn2.
Protein StMsn2 eksogen yang diekspresikan dalam sel prokariotik juga dapat
digunakan sebagai bahan penting untuk percobaan retardasi gel untuk memverifikasi
gen target yang diatur oleh StMsn2 in vitro. Oleh karena itu, protein heterolog yang
diekspresikan dalam sistem ekspresi prokariotik dapat digunakan secara luas, terutama
dalam mengungkap fungsi dan mekanisme faktor transkripsi pada eukariota.
 Ekspresi dan pemurnian faktor transkripsi StMsn2 dari
Setosphaeria turcica di Escherichia coli

Resume jurnal disusun untuk memenuhi tugas dasar – dasar

Bioteknologi yang diampu oleh Dr. Wijanarka, M.Si

DISUSUN OLEH

ADI BUDI UTOMO (24020117120036)

DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS SAINS DAN MATEMATIKA
UNIVERSITAS DIPONEGORO
SEMARANG
2019