PHYSIOLOGIA plantarum 79: 206-209.

Copenhagen 1990

transformasi tanaman Biolistic

John C. Sanford

Sanford, J. C, 1990. Biolistic transformasi tanaman. - Physiol. Menanam.

79: 206-209.

Proses Biolistic merupakan pendekatan yang sama sekali baru untuk

masalah bagaimana untuk memberikan DNA ke dalam sel utuh dan
jaringan. microprojectiles kecepatan tinggi digunakan untuk
membawa DNA atau zat lain dinding sel dan membran masa lalu.
Karena DNA sedang 'ditembak' ke dalam sel, itu merupakan jenis
balistik biologis, maka istilah "bioiistics".
Ada beberapa keuntungan mendasar untuk proses Biolistic lebih teknik
transformasi tanaman lainnya. Proses Biolistic tampaknya efektif
terlepas dari spesies atau jenis jaringan, itu adalah prosedur yang cepat
dan sangat sederhana, dan itu harus memfasilitasi transformasi
langsung dari jaringan totipoten seperti serbuk sari, embrio, meristem
dan kultur sel morphogenic. Selain itu, proses Biolistic tampaknya
unik cocok untuk transformasi organel.
Kelemahan dari proses Biolistic adalah bahwa hal itu memerlukan
instrumentasi khusus, dan masih dalam tahap awal perkembangannya.
Akibatnya, efisiensi pengiriman masih tidak setinggi dapat dicapai
dalam sistem transformasi yang sangat optimal seperti elektroporasi
atau agrobacterial-infeksi tembakau. Selanjutnya, pengguna potensial
harus siap untuk menghabiskan beberapa waktu beradaptasi protokol
yang ada untuk spesies tertentu atau jaringan bunga.
Kata kunci - pengiriman gen, gen gun, mikroproyektil, percepatan
partikel, pistol partikel.

J. C, Sanford, Departemen Ilmu Hortikultura, Cornell Univ. Jenewa, NY 14456, USA.

mikroproyektil dapat didefinisikan sebagai setiap partikel

pengantar
Ada sejumlah besar potensi tanaman mekanisme
Transforma-tion. Beberapa ini adalah sudah baik pem-
lished, dan untuk aplikasi tertentu telah menjadi rou-tine.
Mekanisme lain adalah spekulatif, atau nilai mereka
belum tegas terbukti, Beberapa mekanisme telah
didokumentasikan dengan baik, tapi menderita kendala
berat dalam hal luasnya utilitas atau kepraktisan. Sebuah
teknologi transformasi tanaman yang ideal akan
diterapkan secara luas, sangat efektif, handal, dan sangat
praktis - yaitu cepat dan sederhana.
Untuk memahami manfaat relatif dan kelemahan dari
proses Biolistic, kita perlu beberapa definisi. Proses Biolistic
telah dijelaskan di tempat lain secara lebih rinci (Klein et al.
1987, Sanford et al, 1987, Sanford 1988), Proses dapat
didefinisikan sebagai masuknya zat-zat ke dalam sel utuh
dan jaringan melalui penggunaan microprojectiles-
kecepatan tinggi . Hal ini terutama mech-anism untuk
melanggar dinding sel dan membran sel, yang merupakan
hambatan utama untuk pengiriman DNA. SEBUAH
yang koheren kecil mampu menjadi dipercepat,
sedemikian rupa sehingga pene-trates sel dan jaringan, A
mikroproyektil harus cukup kecil untuk memasukkan sel
atau jaringan dengan cara non-mematikan, dan harus
mampu membawa DNA di permukaan atau di bagian
dalamnya. Biasanya microprojectiles terbuat dari logam
high-density seperti tungsten atau emas, lebih-atau-
kurang bulat, dan 0,4-2,0 \ i di Diame-ter. Saat ini, DNA
dilakukan pada permukaan partikel seperti, daripada di
dalam interior mereka, Perangkat Biolistic dapat
didefinisikan sebagai perangkat yang digunakan untuk
mempercepat microprojectiles dengan kecepatan tinggi,
sehingga mereka menembus ke dalam sel dan jaringan.
Saat ini, perangkat Biolistic terutama mempekerjakan
macroprojectiles sebagai sarana untuk mempercepat
microprojectiles. Macroprojectiles dapat didefinisikan
sebagai setiap objek makroskopik yang dapat Accel-
erated dengan kecepatan tinggi, yang dengan demikian
dapat mempercepat microprojectiles diinginkan
ditempatkan di permukaannya. Biasanya
macroprojectiles mengambil bentuk silinder plastik
seperti peluru atau film metalisasi disk seperti, Target
Biolistic dapat didefinisikan sebagai setiap organel, sel,
atau jaringan ke
Menerima 9 Juni; direvisi Oktober 1989 18

206 Physiol.
Menanam. 79. 1990
yang substansi adalah untuk dikirimkan melalui- ukuran partikel, kecepatan partikel, dll tran-Sient GUS
kecepatan tinggi mikroproyektil. Biasanya, sel-sel atau ekspresi terbaik yang telah kita lihat sejauh ini adalah ca
jaringan yang confi-gured untuk menyediakan jumlah 1 000-
maksimal luas permukaan untuk pemboman, lebih dari
satu ca daerah diameter 5 cm.
singkatan - GUS, / -? Glucuronidase.

Penilaian teknik bioiistics

Berbagai aplikasi
Bagaimana luas berlaku adalah proses Biolistic? Salah
satu fitur yang paling penting dari proses Biolistic
adalah bahwa hal itu jelas dari utilitas yang luas, dan
mungkin terbukti menjadi sesuatu dari mekanisme
pengiriman gen 'universal'. Dalam dua tahun terakhir,
pengiriman gen Biolistic telah dem-onstrated dalam
rentang yang sangat beragam organisme. Ini termasuk
jamur seperti ragi, alga seperti Chlamydo-Monas, dan
sel-sel hewan (tidak dipublikasikan). Pada tumbuhan,
DNA telah disampaikan dan dinyatakan dalam bawang
(Klein et al, 1987), jagung (Klein et al, 1988a, b,
McCabe et al, 1988a), tembakau (Klein et al, 1988c),
beras, gandum dan kedelai (Wang et al. 1988), dan
kedelai (Christou et al, 1988, McCabe et al. 1988b).
Kami juga telah melihat ekspresi gen berikut pemboman
kacang, petunia dan spesies Brassica (tidak
dipublikasikan). Tidak ada perbedaan jelas dalam
efisiensi transformasi Biolistic dari monokotil vs
dicotyledons. Kita telah melihat ekspresi gen di
dasarnya semua spesies tanaman yang telah kita
dibombardir.
Sejauh ini, sudah ada beberapa 'sulit' jaringan, yang
telah terbukti tahan terhadap penetrasi partikel, seperti
rumah kaca tumbuh tembakau jaringan daun dan elon-
gating hypoctyls bunga matahari. Namun, jaringan
target yang paling impor-tant telah terbukti biolistically
trans-formable, termasuk suspensi embriogenik sel
(Klein et al, 1988a, b, c, Wang et al, 1988, Daniell et al,
1989), meristem (McCabe et al, 1988b), embrio (Cao et
al. 1988), dan serbuk sari (McCabe et al, 1988a), Karena
semua ini telah berkembang dalam dua tahun terakhir,
tampaknya masuk akal untuk mengasumsikan bahwa
dengan pengembangan lebih lanjut dari teknologi,
setiap jaringan spesies tanaman setiap mungkin
transformable oleh proses Biolistic.
Organel juga telah biolistically berubah. Proses
Biolistic tampaknya satu-satunya cara untuk
reproducibly mengubah mitokondria, seperti yang
ditunjukkan dalam ragi (Johnston et al. 1988, Fox et al.
1988), dan satu-satunya cara reproducibly mengubah
kloroplas, seperti yang ditunjukkan pada
Chlamydomonas (Boynton et al, 1988, Blower et al,
1989), baru-baru ini, bukti telah diproduksi
menunjukkan bahwa kloroplas tembakau akan seperti-
bijaksana menjadi biolistically transformable (Daniell et
al, 1989),

TVansformation efliciency
Efisiensi transformasi Biolistic jelas akan bervariasi,
tergantung pada spesies, jaringan, kondisi fisiologis,
2000 bintik biru per piring Petri menggunakan sel
tanaman suspen-diskusi-(Klein et al, 1988a, b, c, Wang
et al, 1988), The assay biru-spot mungkin meremehkan
benar num-ber sel yang layak menerima DNA, karena
apa kita hitung sebagai tempat biru tunggal sering berisi
beberapa sel biru, dan karena beberapa sel berubah
rupanya gagal menjadi biru pada pewarnaan. Meskipun
demikian, angka ini trans-an untuk ca satu transforman
sementara per 10 ^ -10" sel. Tarif serupa telah diamati
pada tembakau dan jagung. Dalam kedua spesies, sekitar
2-5% dari transient trans-forman menjadi stabil berubah.
dalam sistem ini, laju transformasi yang stabil adalah
sekitar satu 2 x 10' * untuk 5 x IO '' sel. angka ini hanya
sedikit diterima, tetapi harus meningkatkan secara
substansial dengan optimasi proses, seperti dibahas di
bawah. dalam istilah praktis . angka ini memungkinkan
pemulihan dari beberapa transforman stabil per piring
Petri. Dalam jagung, rata-rata jumlah kalus stabil
berubah per piring Petri bisa setinggi 57 (Klein et al,
1989), Pemboman tembakau sel sus-pensiun dapat
menghasilkan lebih dari 20 transforman stabil per piring
Petri (Klein et al. 1988c) . Pemboman dari meristem
kedelai-kacang juga dapat menghasilkan beberapa tunas
chimeric per piring Petri, yang dapat menimbulkan non-
chimeric berubah bibit keturunan (McCabe et al, 1988b),
Sifat transforman
14 * Physiol. Phint. 79, I99
()
207
Proses Biolistic adalah metode transfer gen secara
langsung, dan dengan demikian tidak memiliki efek
langsung pada mekanisme integrasi kromosom. Sifat dari
acara integrasi yang timbul dari proses Biolistic akan
tergantung pada DNA yang disampaikan dan biologi dari
orga-NISM sedang berubah. Misalnya, non-replikasi
plasmid diperkenalkan ke ragi dengan metode apapun,
includ-ing metode Biolistic, mengintegrasikan ke dalam
kromosom oleh rekombinasi homolog (Armeleo et al,
1989), Demikian juga, semua transformasi Biolistic
organel sejauh dianalisis telah terlibat integrasi homolog
ke dalam kromosom organel (Boynton et al. 1988, John-
ston et al. 1988). Pada tumbuhan, transfer gen langsung
mengarah ke integrasi non-homolog ke dalam kromosom,
khas dengan beberapa salinan dan beberapa derajat
penataan ulang. Juga,
Ketika membombardir jaringan totipoten (kecuali
serbuk sari) proses Biolistic akan sering menimbulkan
tanaman chimeric, yang perlu diselesaikan dan stabil -
yang merupakan kerugian. Di sisi lain, transformasi
langsung dari jaringan totipoten harus meminimalkan
variasi somaklonal berikutnya. Jelas, setiap kali organel
diubah, tanaman yang dihasilkan akan memiliki
konstitusi genetik yang unik. Karena tanaman diubah
oleh proses Biolistic tidak akan terkena
untuk setiap vektor patogen, seharusnya tidak ada
masalah khusus dengan terkait vektor merusak
mempengaruhi, maupun masalah unik dengan badan
pengatur pemerintah.
Keandalan
Ada variabel Biolistic saat undefined, yang menyebabkan
fluktuasi yang signifikan dalam efisiensi dari hari ke hari
dan dari pemboman pemboman. fluktuasi ini membuat
frustasi dan membutuhkan ulangan dari semua perawatan
dalam percobaan, dan sering experi-KASIH perlu diulang.
fluktuasi ini telah menghambat, tetapi tidak dicegah,
kemajuan pesat dalam penelitian Biolistic selama dua tahun
terakhir. Sekarang ada 30 laboratorium yang saya sadar,
melakukan beberapa bentuk penelitian Biolistic. Sementara
efisiensi dapat bervariasi antara laboratorium, kemampuan
dasar tampaknya tidak bervariasi. Transformasi stabil inti
ragi, Chla-mydomonas inti, ragi mitokondria,
Chlamydomo-nas kloroplas, dan sel-sel tembakau, kedelai,
dan jagung semuanya telah dikonfirmasi oleh independen
laborato-luka. transformasi tersebut telah melibatkan
beberapa baris bukti untuk transformasi, termasuk bercak
selatan. Berbagai jenis transformasi Biolistic sekarang
sedang dilakukan secara rutin. Fluktuasi yang saat diamati
mungkin melibatkan variasi dalam beberapa hal berikut -
kemurnian DNA, lapisan partikel efi siensi-, aglomerasi
partikel, dispersi partikel pada peluncuran, kecepatan
partikel, negara selular pada saat dampak, kondisi seluler
berikut dampak.
Praktis
Konsep Biolistic sangat sederhana, yang keindahannya.
Protokol dasar yang sama digunakan terlepas dari apa
yang sedang berubah. protokol sederhana, cepat (kurang
dari 5 menit per piring Petri), menggunakan jumlah yang
sangat kecil dari DNA (kurang dari 1 [DNA ig per piring
Petri), memungkinkan banyak DNA yang berbeda
konstruksi untuk diputar cepat, umumnya tidak
memerlukan vektor perantara atau organisme, dan
umumnya tidak memerlukan sel rumit atau persiapan
jaringan. Proses Biolistic tidak muncul untuk meminta
genotipe tanaman tertentu untuk kebaikan ulang sults,
meskipun ada beberapa perbedaan relatif dalam respon
dari genotipe tanaman yang berbeda. Meskipun
pendekatan ini menunjukkan banyak janji, kelemahan
signifikan adalah bahwa ada belum prosedur rutin yang
tersedia 'dari rak, yang dapat diterapkan untuk semua
aplikasi po-tential beragam.
Prospek masa depan
Ada perbaikan besar yang harus dibuat dan dapat dibuat
dalam proses Biolistic. Ini adalah kelemahan dalam
bahwa teknologi ini saat ini tidak dioptimalkan dan akan
memerlukan eksperimen lebih lanjut. ini
keuntungan dalam bahwa kemajuan besar dapat
diharapkan di tahun-tahun mendatang. Ada beberapa
independen-aspek-proses Biolistic, yang jelas sub-
optimal dan membutuhkan pekerjaan. Partikel-partikel
saat ini digunakan sebagai microprojectiles tidak teratur
dalam bentuk dan sangat heterogen dalam ukuran.
Hanya sebagian kecil dari partikel-partikel ini mungkin
efektif. Mayoritas partikel yang terlalu kecil (gagal
menembus), atau terlalu besar (menyebabkan kematian
sel). Partikel yang diperlukan yang diproduksi dengan
ukuran dan bentuk yang tepat spesifikasi untuk setiap
aplikasi yang diberikan. Metode saat ini digunakan
DNA lapisan ke partikel tidak menyebabkan lapisan
seragam, tidak mengoptimalkan jumlah DNA per parti-
cle, dan menyebabkan aglomerasi dari partikel-partikel.
Semua ini memberikan kontribusi untuk hasil sub-
optimal dan variabel - menyerukan metode yang lebih
baik. Perangkat sekarang digunakan untuk
mempercepat partikel tidak neccesarily memproduksi
dispersi seragam partikel, seragam kecepatan distribu-
tions, atau kecepatan sama besar seperti yang
diinginkan. Faktor-faktor biologis yang mempengaruhi
penetrasi mikroproyektil ke dalam sel dan
kelangsungan hidup sel berikutnya tidak baik un-
derstood, dan pemahaman yang lebih baik dari variabel-
variabel biologis yang mempengaruhi penetrasi dan
kelangsungan hidup harus mengarah pada peningkatan
besar dalam efisiensi transformasi. Efisiensi mungkin
juga ditingkatkan dengan co-pengiriman protein dengan
DNA, yang mungkin meningkatkan transportasi ke inti
atau integrasi aktif ke dalam kromosom. Faktor-faktor
biologis yang mempengaruhi penetrasi mikroproyektil
ke dalam sel dan kelangsungan hidup sel berikutnya
tidak baik un-derstood, dan pemahaman yang lebih baik
dari variabel-variabel biologis yang mempengaruhi
penetrasi dan kelangsungan hidup harus mengarah pada
peningkatan besar dalam efisiensi transformasi.
Efisiensi mungkin juga ditingkatkan dengan co-
pengiriman protein dengan DNA, yang mungkin
meningkatkan transportasi ke inti atau integrasi aktif ke
dalam kromosom. Faktor-faktor biologis yang
mempengaruhi penetrasi mikroproyektil ke dalam sel
dan kelangsungan hidup sel berikutnya tidak baik un-
derstood, dan pemahaman yang lebih baik dari variabel-
variabel biologis yang mempengaruhi penetrasi dan
kelangsungan hidup harus mengarah pada peningkatan
besar dalam efisiensi transformasi. Efisiensi mungkin
juga ditingkatkan dengan co-pengiriman protein dengan
DNA, yang mungkin meningkatkan transportasi ke inti
atau integrasi aktif ke dalam kromosom.
Di masa depan mungkin akan ada lebih dari satu
tanaman teknologi transformasi digunakan. Misalnya,
ada mungkin tidak ada metode yang lebih baik untuk
memulihkan jumlah yang sangat besar dari peristiwa
transformasi independen (seperti yang akan diperlukan
untuk skrining perpustakaan gen), daripada metode
transformasi protoplas tanaman. Namun, proses
Biolistic jelas menjadi rutin untuk aplikasi numer-ous,
dan saat ini satu-satunya metode yang dapat diandalkan
untuk semua jenis transformasi organel. Menurut
pendapat saya, fleksibilitas dan praktis keuntungan dari
proses Biolistic cenderung akhirnya membuat teknologi
transformasi dominan untuk berbagai jenis aplikasi
tanaman.
Referensi
Armeleo, D., Ye, GN, Johnston, SA, Klein, TM, Shark, KB &
Sanford, JC 1990. Biolistic transformasi Saccharomyces
cerevisiae dan jamur lainnya. - Saat Genet-ics (in press).
Blower, AD, Bogarad, L., Shark, KB ,, Ye, GN & San-ford,
JC, 1989. Studi pada Chlamydomonas transformasi
208
Menanam. 79, 1990
kloroplas; DNA asing dapat stabil dipertahankan dalam
kromosom. - The Plant Cell 1; 123-132.
Boynton, JE, Gillham, NW, Harris, EH, Hosier, JP ,, Johnson,
AM, Jones, AR, Randolf-Anderson, BL ,, Robertson, D.,
Klein, TM, Shark, KB & Sanford, JC 1988. transformasi
kloroplas dari Chlamydomonas menggunakan
microprojectiles kecepatan tinggi. - Ilmu 240; 1534-1538.
Cao, J ,, Wang, Y. C, Klein, TM, Sanford, JC, & Wu, R. 1990.
Transformasi padi dan gandum menggunakan proses
Biolistic. - Pada Tanaman transfer Gene, UCLA
Simposium (Dalam press).
Christou, P., McCabe, DE & Swain, W. F 1988. Stabil
Physiol.
 transformasi kalus kedelai dengan emas par-ticles DNA
berlapis, - Platit Physiol. 87: 671-674.
Daniell, H., Vivekananda, J., Nielson, BL, Ye, GN, Te-wari,
KK & Sanford, JC 1990. Transient ekspresi gen asing di
kloroplas sel tembakau berbudaya tindak ing pengiriman
Biolistic vektor kloroplas. - Proc, Natl. Acad. Sci. USA
(Dalam press).
Fox, TD, Sanford, JC & McMullin, TW 1989. Plasmid secara
stabil dapat mengubah mitokondria ragi benar-benar
kurang en-dogenous mtDNA. - Proc. Natl. Acad. Sci. USA
85: 7288-7292.
Johnston, SA, Butow, R., Shark, KB & Sanford, JC 1988.
Transformasi mitokondria ragi dengan membombardir-
ment sel dengan microprojectiles. - Ilmu 240: 1538-1541.
Klein, TM, Wolf, ED, Wu, R. & Sanford, JC 1987.
microprojectiles-kecepatan tinggi untuk dehvering asam
nukleat ke dalam sel-sel hidup. - Nature 327: 70-73.
- Fromm, ME, Weissinger, A., Tomes, D., Schaaf, S., Sleeten,
M. & Sanford, JC 1988a. Transfer gen asing ke dalam sel
jagung utuh menggunakan kecepatan tinggi MicroPro-
jectiles. - Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 4305 ^ 309.
- Fromm, ME, Gradziel, T. & Sanford, JC 1988b. Fac-tor yang
mempengaruhi pengiriman gen ke dalam Zea mays sel
dengan microprojectiles-kecepatan tinggi, - Bio / Teknologi
6: 559-563.
Diedit oleh I. Potrykus
Physiol. Menanam. 79,
1990
209
- Harper, E. C, Svab, Z., Sanford, J. C, Fromm, ME &
Maliga, P. 1988c. transformasi genetik yang stabil dari sel
Nicotiana utuh oleh proses penembakan partikel. - Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 85: 8502-8505.
- , Kornstein, L., Sanford, JC & Fromm, ME 1990. Ge-
transformasi netic sel jagung oleh partikel
membombardir-ment dan pengaruh metilasi pada ekspresi
gen asing. - Asam Nukleat Penelitian (Dalam press).
McCabe, DE, Swain, WF & Martinell, BJ 1988a. Pollen-
dimediasi transformasi tanaman. Eropa paten tanaman ap-
lipatan No. 87.310.612,4. Diterbitkan 8 Juni 1988.
Bulletin 88/23,
- Martinell, BJ & Christou, P. 1988b. Stabil Transforma-tion
kedelai {Glycine max) tanaman. - Bio / Teknologi 87: 923-
926.
Sanford, JC 1988. Proses Biolistic - konsep baru dalam
transfer gen dan pengiriman bioligical. - Tren Biotechnol.
6: 229-302.
- Klein, TM, Wolf, ED & Allen, N. 1987. Pengiriman zat
ke dalam sel dan jaringan menggunakan proses
membombardir-ment partikel. - J. Part. Sci. Tech. 5: 27-
37.
Wang, Y. C, Klein, T. M, Fromm, M., Cao, J., Sanford, JC
& Wu, R. 1988. Transformasi beras, gandum, dan kedelai
dengan metode penembakan partikel. - Tanaman Mol.
Biol. 11: 433-439,