Anda di halaman 1dari 14

POLYMERASE CHAIN REACTION

(PCR)

MK. MIKROBIOLOGI AKUATIK

PROGRAM DIPLOMA

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

PCR adalah teknik yang digunakan untuk amplifikasi (penggandaan) secara eksponensial suatu sekuen nukleotida tertentu dengan cara in vitro . Pada setiap n siklus PCR akan diperoleh 2 n kali banyaknya DNA target

Dikembangkan oleh Kary Mullis tahun 1984 dan karenanya menerima hadiah Nobel tahun 1993

Jenis PCR : Simple PCR, Reverse-Transcription PCR (RT-PCR), Single

PCR, dan Nested PCR. Perbedaan dalam hal tingkat sensifitas dan spesifitasnya.

Kelebihan PCR :

Jumlah sampel sedikit

Cepat dan sederhana

Sangat sensitif

Aplikasi PCR di akuakultur

Rekayasa genetik dalam menghasilkan benih unggul

Alat untuk mendeteksi penyakit infeksi secara dini. Penyakit infeksi

(terutama yang disebabkan oleh virus) relatif sulit untuk diamati karena

umumnya baru menampakkan gejala-gejala klinis setelah tingkat infeksinya tinggi.

Alat untuk mengetahui keragaman genetik sehingga dapat digunakan

untuk diagnose penyakit

Tahapan PCR:

Ekstraksi DNA

Amplifikasi DNA target dengan thermal cycler

Pemisahaan DNA dengan elektroforesis

Visualisasi dengan UV transluminator

Untuk identifikasi atau deteksi bakteri pathogen pada ikan maka

harus mengamplifikasi gen spesifik untuk bakteri atau virulensi

dari bakteri tersebut. Identifikasi Vibrio sebagai penyebab utama penyakit vibriosis pada udang, menggunakan gen hemolisin sebagai gen targetnya

pada udang, menggunakan gen hemolisin sebagai gen targetnya Luminescent bacteria of Vibrio harveyi : a. in

Luminescent bacteria of Vibrio harveyi : a. in ponds, b. in culture medium

Ekstraksi DNA

Ekstraksi DNA dilakukan untuk memisahkan genom DNA dari

molekul-molekul lain di dalam satu jaringan yang dilarutkan

Tahapan ekstraksi :

1. Lisis sel. Menghancurkan sel menggunakan larutan deterjen

pekat seperti sodium dodecyl suphate (SDS)

2. Isolasi DNA. Memisahkan DNA dengan komponen lainnya

dimana phenol-chloroform berfungsi sebagai pelarut dari

senyawa organik dan komponen lipid. Pemisahan DNA dari bahan-bahan kontaminan seperti RNA dan protein dapat menggunakan enzim ribonuklease (RNase) dan enzim proteolitik (Proteinase K)

Ekstraksi DNA

3. Sentrifugasi

Memisahkan DNA dari komponen lainnya

Mengendapkan DNA menggunakan sodium acetat

komponen lainnya Mengendapkan DNA menggunakan sodium acetat • Untuk menghilangkan kontaminan seperti RNA dan protein,

Untuk menghilangkan kontaminan seperti RNA dan protein,

digunakan enzim ribonuklease (RNase) dan enzim proteolitik

(Proteinase K) pada larutan DNA

Amplifikasi DNA

Preparasi Bahan

DNA templet

Sekuen primer spesifik (forward dan reverse)

Taq polymerase

Nukleotida (dNTP)

Master mix dibuat ke dalam 0,2 ml thin-walled tabung PCR untuk memperbanyak gen penyandi hemolysin

Reagen

Volume 1 x (µl)

Volume 7x (µl)

dNTP

2,5

17,5

Buffer taq

2,5

17,5

Primer myhemo

1,0

7,0

Primer my hemo R1

1,0

7,0

ddH 2 O

17,5

122,5

Taq Polimerase

0,2

1,4

Amplifikasi DNA

Proses amplifikasi DNA

1. Denaturasi

Proses memisahkan DNA menjadi utas tunggal pada kisaran suhu

9295 oC . Predenaturasi selama 13 menit diperlukan untuk

meyakinkan bahwa DNA telah terdenaturasi menjadi untai tunggal

2. Annealing

Proses penempelan primer. Suhu diturunkan sampai mencapai ~55°C atau sesuai melting temperature (Tm) dari primer oligonukleotida

3. Ekstension

Pemanjangan primer lengkap untuk sintesis sebuah DNA utas

ganda dilakukan pada suhu 72 o C, yaitu suhu optimal untuk TaqDNA polymerase

Amplifikasi DNA

denaturasi yang tidak berlangsung secara sempurna dapat menyebabkan utas DNA

terputus dan tahap denaturasi yang terlalu lama dapat mengakibatkan hilangnya

aktivitas enzim polimerase.

Tahap annealing primer merupakan tahap terpenting karena jika ada sedikit saja kesalahan maka akan mempengaruhi kemurnian dan hasil akhir produk DNA yang

diinginkan. Faktor yang mempengaruhi suhu dan primer. Suhu annealing yang

terlalu rendah dapat mengakibatkan timbulnya pita elektroforesis yang tidak spesifik

Tahapan

Suhu ( 0 C)

Waktu (min)

Siklus

Predenaturasi

94

2

 

Denaturasi

94

1

Annealing Primer

50

1

35 siklus

Extensi/Elongasi

72

1

Final extension

72

2

Elektroforesis

Pembuatan Agarose Gel dengan melarutkan sebuk agarose ke dalam larutan Tris Boric Acid EDTA (TBE) atau TAE (Tris Acetat EDTA) konsentrasi 1%, kemudian dicetak

Pencampuran sampel hasil amplifikasi dengan loading dye.

campuran tersebut dimasukan ke dalam cetakan sumur-sumur

pada agarose gel.

Proses elektroforesis. Mesin elektroforesis dijalankan dengan

tegangan 250 V dan kuat arus 50-80 mA selama kurang lebih 25 menit atau setelah DNA bermigrasi dari kutub negatif ke kutub positif.

Visualisasi

Hasil elektroforesis DNA sampel dapat dilihat dengan menggunakan UV transluminator.

Jika DNA sampel teramplifikasi, maka pada agarose gel akan

terlihat potongan-potongan DNA yang berpendar.

Hasil ini dilihat melalui kamera polaroid.

Visualisasi

Visualisasi

Visualisasi

Visualisasi Marker yang digunakan a. Marker lambda DNA HindIII/EcoRI; b. Marker 100 bp Ladder (100-3000 bp);

Marker yang digunakan

a. Marker lambda DNA HindIII/EcoRI;

b. Marker 100 bp Ladder

(100-3000 bp);

c. Marker 100 bp Ladder

(100-1000 bp)

Kelemahan PCR

Perlu informasi sekuen DNA target

Amplifikasi gen berukuran kecil :

< 5 kb dapat diamplifikasi dengan mudah

< 40 kb dapat diamplfikasi dengan modifikasi

< 100 kb tidak dapat diamplifikasi