Kemajuan terbaru dalam sintesis kimia organik telah difasilitasi

tujuan akhir menghasilkan senyawa sel permeabel kecil

yang dapat secara efisien melabeli actin cytoskeleton dan melacaknya

sifat dinamis. Metode tradisional untuk memvisualisasikan F-aktin

dalam sel dan jaringan mengandalkan mikroinjeksi pra-label

protein aktin, berlabel phalloidin seperti fluorescently

molekul atau penggunaan konstruksi genetik yang mengkodekan untuk keduanya

GFP-aktin atau peptida protein pengikat GFP-aktin.

Jelas proses pelabelan

aktin dengan fluorophore (misalnya,

rhodamine) dan menyiapkan a

aparat microinjection adalah

proses yang memakan waktu,

tetapi bisa efisien jika

aktin berlabel dibeli dan

sistem microinjection

tersedia di fasilitas inti atau

laboratorium tetangga. Ini

teknik sangat cocok

baik untuk jenis sel besar semacam itu

sebagai Xenopus diameter 1 mm

oocytes yang memungkinkan metode injeksi yang relatif sederhana

dikembangkan, atau jenis sel yang sensitif terhadap transfeksi

reagen atau bandel untuk menyerap yang baru dikembangkan

Spirochrome

Keuntungan utama dari

pendekatan microinjection adalah) integrasi lengkap

aktin berlabel dengan sitoskeleton aktin karena tidak ada

halangan sterik dari label GFP yang besar atau penghambatan dinamis

sifat-sifat oleh molekul penstabil F-aktin faloidin, b)

observasi eksperimental cepat, biasanya dalam beberapa menit, setelah

dispersi penuh injeksi tercapai, dan c) fluoresensi

pemulihan setelah metode photobleaching (FRAP) dapat digunakan untuk

mengukur perputaran dinamis. Selain itu, otot dan non-otot

aktin pra-label tersedia secara komersial (Cat. # AR05 dan

APHR, masing-masing), yang memungkinkan operator untuk membuat penutupan

aktin isoform cocok dengan jenis sel yang dimaksud, yang meningkat

penyebaran label dan karenanya, visualisasi yang lebih lengkap.

Konstruksi genetik aktivin GFP telah banyak digunakan dalam beberapa tahun terakhir karena
kompatibilitasnya dengan DNA dan RNA yang sedang berlangsung

percobaan transfeksi. Oleh karena itu, penggabungan sederhana ke dalam

campuran pra-transfeksi oligonukleotida memungkinkan operator

untuk memvisualisasikan setelah inkubasi 24-48 jam. Peringatan adalah a) waktu

diperlukan untuk mengembangkan sinyal, b) heterogenitas dalam label

populasi sel karena transfeksi yang tidak konsisten, dan c) sterik

hambatan dari bagian GFP yang relatif besar yang menciptakan GFP

latar belakang dan terkadang pengecualian dari zona-zona dinamis tinggi

omset dekat pinggiran sel

Peptida pengikat aktin berlabel GFP juga banyak digunakan karena

manfaat yang sama yang dinyatakan di atas untuk GFP-aktin. Peptida berasal

dari protein pengikat aktin seperti ABP140 (Saccharomyces

cerervisiae), ABP120 (Dictyostelium discoideum), dan talin (Homo

sapiens) telah digunakan dengan berbagai tingkat kesuksesan. Kemampuan untuk mengikat semua
populasi F-actin dengan afinitas tinggi dan

menghasilkan latar belakang yang rendah adalah kunci untuk konstruksi ini, beberapa

yang tersedia secara komersial (mis., ABP140 dan ABP120)

sedangkan yang lain tersedia dari berbagai laboratorium akademis

Peringatan yang sama seperti GFP-aktin ada untuk konstruksi ini tetapi untuk

derajat yang berbeda tergantung pada tipe sel. Upaya untuk berkonversi

reagen menjadi peptida terkonjugasi fluorophore yang

sel-permeabel, yang akan menawarkan pelabelan yang jauh lebih sederhana

teknik, belum berhasil.

Reagen Spirochrome baru-baru ini melampaui banyak

peringatan dari sistem yang dijelaskan di atas. Dikembangkan oleh Lukinavicius dkk. pada tahun
2014

di laboratorium Drs. Johnsson, Neraka, dan Arndt, rhodaminebased silikon kecil ini

Molekul fluorogenik adalah sel-permeabel dan dianggap sebagai biosensor

perasaan bahwa fluoresensi mereka meningkat hingga 100X lipat ketika terikat ke F-aktin. Di

Selain itu, probe beroperasi dalam spektrum jauh-merah, mengurangi autofluorescence of

sampel dan menghindari kemungkinan efek fototoksik dari cahaya eksitasi. Ini adalah

sifat revolusioner karena itu berarti latar belakang jauh berkurang di

keadaan tak terikat di sitoplasma, sehingga afinitas mengikat ke F-aktin tidak perlu

menjadi sangat tinggi, yang memungkinkan molekul-molekul ini untuk mengikat tetapi tidak
mengganggu dinamika,

berbeda dengan molekul induk yang tidak berlabel (misalnya, phalloidin dan jasplakinolide).

Molekul induk seperti itu, antara lain, diuji selama pengembangan dan ditemukan

memiliki sifat yang berbeda, sedangkan turunan jaskplakinolide adalah yang terbaik

kombinasi permeabilitas sel dan pewarnaan F-actin yang tersebar luas

Banyak sel

jenis telah diberi label dengan sistem ini (lihat www.cytoskeleton.com/spirochrome)

dan terkadang yang menantang membutuhkan aditif permeabilitasi6

(misalnya.,

saponin) atau pompa penghabisan / Ca. penghambat saluran (misalnya, verapamil; lihat www.

cytoskeleton.com/spirochrome) untuk meningkatkan derajat pelabelan. Tekniknya adalah

cukup tambahkan pereaksi fluorogenik ke kultur sel dan inkubasi untuk waktu yang singkat

periode, biasanya hanya 1-4 jam. Reagen ini sekarang tersedia secara komersial

Cytoskeleton, Inc.

Sebagai kesimpulan, teknik memvisualisasikan F-aktin dalam sel hidup telah berevolusi dari

metode persiapan aktin, pelabelan, dan

microinjection, melalui proses transfeksi DNA yang lebih mudah, dan akhirnya untuk yang paling
banyak

pendekatan sederhana dan berlaku luas hanya menambahkan reagen ke budaya sel

medium. Arah masa depan jelas akan membawa teknik terbaru secara penuh

spektrum garis sel dan jaringan, dan membuat susunan fluorophores yang lebih luas.