LAPORAN PRAKTIKUM TEKNOLOGI ENZIM

ELEKTROFORESIS PROTEIN ENZIM

DISUSUN OLEH :

Tara Inastu K 31170090

Vina Evianti R 31170092

Matthew Linardi 31170099

PROGRAM STUDI BIOLOGI

FAKULTAS BIOTEKNOLOGI

UNIVERSITAS KRISTEN DUTA WACANA

YOGYAKARTA

2019
 BAB I

PENDAHULUAN

1.1.Latar Belakang
Organisme tersusun atas beberapa komponen salah satunya adalah protein. Protein
menyusun sekitar 50% dari massa kering sebagian sel, dimana protein memiliki peran yang
penting dalam suatu organisme. Protein berasal dari kata protos yang berarti utama, dimana
protein merupakan polimer yang terdiri dari monomer asam amino dan dihubungkan satu
sama lain dengan ikatan peptida. Protein merupakan senyawa organik dengan berat molekul
yang tinggi. Protein disusun dari atom C, H, O dan N serta unsur lainnya seperti P dan S yang
nantinya membentuk unit asam amino. Protein tersusun atas beberapa asam amino, dimana
urutan asam amino tersebut akan menentukan sifat dari protein.
Protein diperoleh dari hewan dan tumbuhan, dimana protein yang berasal dari hewan
disebut dengan protein hewani, sedangkan protein yang berasal dari tumbuhan disebut dengan
protein nabati. Protein merupakan komponen terbesar dalam tubuh manusia setelah air,
sehingga ketika kekurangan protein maka akan menyebabkan perunan daya tahan tubuh
terhadp paneyakit. Dalam tubuh manusia protein berfungsi sebagi pembangun struktur,
biokatalis, sumber energi, pegatur pH dan pembawa sifat. Salah satu bagian dalam tubuh
manusia yang mengandung protein adalah darah. Darah terdiri atas plasma dan sel-sel darah,
dimana protein dalam darah dapat berdasarkan ukuran berat molekul, muatan listrik atau sifat
yang lain. Salah satu teknik pemisahan protein berdasarkan berat molekul migrasi partikel
bermuatan listrik yaitu SDS-PAGE atau Sodium dodecyl sulfate-polyacrilamide gel
electrophoresis. Oleh karena itu, dilakukan praktikum ini untuk mengetahui metode yang
tepat dalam memberikan pemisahan darah yang baik.

1.2.Tujuan
1. Mengetahui prinsip dasar elektroforesis.
2. Menggunakan Teknik SDS-PAGE untuk memisahkan protein – protein darah.
3. Mengetahui metode yang tepat dalam pemisahan protein darah.
 BAB II
TINJAUAN PUSTAKA

Protein adalah senyawa organik kompleks berbobot molekul tinggi. Protein merupakan
polimer dari monomer-monomer asam amino yang terhubung dengan ikatan peptida. Molekul
protein mengandung karbon, hidrogen, oksigen, nitrogen, dan kadangkala sulfur dan fosfor. Semua
enzim dan banyak enzim merupakan protein atau turunannya (Champe et al., 2005).
Darah adalah jaringan cair yang terdiri atas dua bagian, yaitu plasma darah dan sel darah.
Darah tersusun atas cairan plasma, garam-garam, bahan kimia lainnya, eritrosit (sel darah merah),
dan leukosit (sel darah putih). Plasma darah terdiri atas protein (albumin, globulin dan fibrinogen),
lemak dalam bentuk kolesterol, fosfolpid, lemak netral, asam lemak,dan mineral anorganik
terutama kalsium, potasium dan iodium. Plasma darah terdiri dari air sebanyak 92% dan zat-zat
lain sebanyak 8%. Zat-zat lain itu 90% berupa protein dan 0,9% berupa bahan anorganik,
sedangkan sisanya adalah bahan organik yang bukan protein.
Tabel standar protein berdasarkan band yang terbentuk pada elektroforesis
Jenis Protein Jarak (cm) band Berat Molekul Protein (kD)
Myosin 0,7 200.000
β-Galaktosidase 1,2 116.250
Glycogen 1,7 97.400
Albumin 2,5 66.200
Ovalbumin 3 45.000
Carbonic Anhydrase 4,2 31.000
Trypsin 4,7 21.500
Lysozim 5 14.400
Aprotinin >5,6 6.500
(Frandson, 1992).
Uji pengendapan dengan garam merupakan pembentukan senyawa tak larut antara protein
dan ammonium sulfat, apabila terdapat garam anorganik dalam konsentrasi tinggi dalam larutan
protein, maka kelarutan protein akan berkurang sehingga terjadi pengendapan protein. Hal tersebut
terjadi karena ion garam mampu mengikat air sehingga berkompetisi dengan molekul protein
dalam mengikat air (Poedjiadi, 1994).
 Elektroforesis adalah suatu teknik pemisahan molekul selular berdasarkan atas ukurannya
dengan menggunakan medan listrik yang dialirkan pada suatu medium yang mengandung sampel
yang akan dipisahkan. Teknik ini dapat digunakan dengan memanfaatkan muatan listrik yang ada
pada makromolekul. Protein yang dielektroforesis dapat dianalisis dengan pengecatan
menggunakan Coomassie blue. Senyawa ini biasanya ditambahkan bersama-sama dengan sampel
(Yuwono, 2005).
Metode SDS-PAGE (SDS-Polyacrylamide gel electrophoresis) merupakan teknik untuk
memisahkan rantai polipeptida pada protein berdasarkan kemampuannya untuk bergerak dalam
arus listrik. SDS berfungsi untuk memberikan muatan negatif pada protein yang akan dianalisis,
selain itu SDS dapat mendenaturasi protein, mempermudah menyamakan kondisi, dan
menyederhanakan protein (bentuk, ukuran, dan muatan). Muatan negatif SDS akan
menghancurkan sebagian stuktur kompleks protein dan secara kuat tertarik ke arah anoda bila
ditempatkan pada suatu medan listrik (Hemes, 1998).
Fungsi akrilamid pada metode SDS-PAGE yaitu untuk mencegah difusi akibat timbulnya
panas pada arus listrik. Selain itu gel akrilamid sering dimanfaatkan untukmemisahkan molekul
protein yang kecil. Konsentrasi akrilamid total dalam gel dapatmempengaruhi migrasi protein.
Pada proses pembuatan gel, akrilamid akan berpolimerisasi secara spontan bila tidak ada oksigen
(Prihanto, 2011).
 BAB III
METODOLOGI
3.1.Alat
 Alat elektroforesis
 Alat mikrosentrifugasi
 Alat sentrifugasi
 Falcon tube
 Inkubator
 Kotak es
 Mikro pipet
 Microtube
 Pipet ukur
 Propipet
 Shaker
 Tip
 Vorteks
3.2. Bahan
 β-merkaptoetanol
 Buffer hemolysis
 Buffer sampel
 Coomassie Blue
 Darah ayam
 Etanol absolut
 Larutan destain
 (NH4)2SO4 jenuh
 Separating gel 12,5%
 Stacking gel 3%
3.3. Cara Kerja
3.3.1. Pemisahan sel-sel darah dan plasma darah

Sampel darah dimasukkan ke falcon tube sebanyak 5 ml

Disentrifugasi selama 15 menit dengan kecepatan 5000 rpm

Supernatan dibuang perlahan

Ditambahkan 6 ml buffer cuci

Divortex

Disentrifugasi selama 15 menit dengan kecepatan 5000 rpm

Supernatan dibuang perlahan

Ditambahkan 6 ml buffer cuci

Divortex

Disentrifugasi selama 15 menit dengan kecepatan 5000 rpm

Supernatan disimpan dalam microtube untuk menjadi sampel plasma darah

3.3.2. Isolasi sel darah dan plasma

Sampel darah dimasukkan ke falcon tube sebanyak 5 ml

Disentrifugasi selama 15 menit dengan kecepatan 5000 rpm

Supernatan dibuang perlahan

Ditambahkan 6 ml buffer cuci

Divortex

Disentrifugasi selama 15 menit dengan kecepatan 5000 rpm

Supernatan dibuang perlahan

Ditambahkan 6 ml buffer cuci

Divortex

Disentrifugasi selama 15 menit dengan kecepatan 5000 rpm

Supernatan dibuang perlahan

Ditambahkan 6 ml buffer cuci

Divortex

Disentrifugasi selama 15 menit dengan kecepatan 5000 rpm

3.3.2.1. Sampel protein sitoplasmik

Supernatan disimpan ke microtube baru untuk menjadi sampel protein sitoplasmik

3.3.2.2.Sampel protein membran

Supernatan dibuang sebanyak 5 ml

Ditambahkan buffer hemolysis sebanyak 7 ml

Divortex

Disentrifugasi selama 10 menit dengan kecepatan 5000 rpm

Supernatan disisakan sebanyak 2 ml

Sampel dipindah ke microtube

Disentrifugasi selama 35 menit dengan kecepatan 12000 rpm

Supernatan dibuang dan pelet disimpan sebagai sampel protein membran

3.3.3. Pengedapan dengan garam

Sampel darah dimasukkan ke falcon tube sebanyak 5 ml

Disentrifugasi selama 15 menit dengan kecepatan 5000 rpm

Supernatan dipindahkan ke dalam 2 microtube dengan masing-masing sebanyak 500µl

Masing-masing microtube ditambahkan 250 µl (NH4)2SO4 jenuh

Divortex

Inkubasi selama 5 menit dengan suhu 37oC

Disentrifugasi selama 5 menit dengan kecepatan 12000 rpm

 3.3.3.1. Sampel protein supernatan

Supernatan disimpan ke microtube baru untuk menjadi sampel protein supernatan

3.3.3.2. Sampel protein pengedapan

Supernatan dibuang

Ditambahkan (NH4)2SO4 50% sebanyak 1 ml

Divortex dengan pipet tetes

Disentrifugasi selama 5 menit dengan kecepatan 12000 rpm

Endapan dikeringkan dan disimpan sebagai protein pengendapan

3.3.4. Pengendapan dengan etanol

Sampel darah dimasukkan ke falcon tube sebanyak 5 ml

Disentrifugasi selama 15 menit dengan kecepatan 5000 rpm

Supernatan dipindahkan ke dalam 2 microtube dengan masing-masing sebanyak 500µl

Masing-masing microtube ditambahkan 250 µl etanol absolut

Divortex

Inkubasi selama 5 menit dengan suhu dingin

3.3.4.1.Sampel protein supernatan

Supernatan disimpan ke microtube baru untuk menjadi sampel protein supernatan

3.3.4.2.Sampel protein pengendapan

Supernatan dibuang

Ditambahkan etanol absolut sebanyak 1 ml

Divortex dengan pipet tetes

Disentrifugasi selama 5 menit dengan kecepatan 12000 rpm

Endapan dikeringkan dan disimpan sebagai protein pengendapan

3.3.5. Elektroforesis

Dibersihkan plat kaca dengan akuades dan etanol 70%

Disetting kaca dan spacer sesuai manual vertikal elektroforesis yang tersedia

Disiapkan SDS-PAGE linear slab gel dengan konsentrasi stacking gel 3% dan
separating gel 12,5% dengan komposisi seperti dibawah ini

Stacking gel (3%): Acry – Bisacr 450 µl; Tris HCl 1M pH 6,8 380 µl; 10% SDS segar
30 µl; 10 % APS segar 30 µl; TEMED 5 µl; dan Akuabides 2,11 ml

Separating gel (12,5%): Acry – Bisacr 3,125 ml; Tris HCl 1M pH 8,8 2,720 ml; 10%
SDS segar 75 µl; 10 % APS segar 75 µl; TEMED 6,25 µl; dan Akuabides 1,505 µl

Dituangkan separating gel dengan disisakan 3 cm dari sisi plat kaca bagian atas

Setelah separating gel terpolimerasi, dituangkan stacking gel ke atasnya dan di pasang
sisir plastik untuk dibentuk sumur sampel. Sisir dilepaskan ketika gel mengeras.

Masing-masing sampel diambil sebanyak 50 µl dan ditambahkan 450 µl buffer sampel

dan 25 µl β-merkaptoetanol

Ditutup microtube dan divorteks

Dimasukkan dalam inkubator dalam kondisi mendidih selama 5 menit

Disentrifugasi selama 3 menit dengan kecepatan tinggi

dimasukkan sampel ke dalam sumur yang terbentuk

Elektroforesis dijalankan salam 3 jam dengan voltage 120 mV dan ditambahkan

coomassie blue untuk pewarnaan gel

Gel direndam dalam larutan coomassie blue semalam sambil digojog dalam shaker

Dicuci dengan larutan destain beberapa kali hingga sambil digojog dengan shaker
hingga warna biru hilang
 BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1.Hasil

Gambar 1. Hasil elektroforesis protein

Ba
Sampe Ban Band
Band 1 Band 2 Band 3 Band 4 Band 5 Band 6 nd
l d7 8
9
11
20-23 6
bp kD
63-66 bp
a
Protein protein 97-99 bp
B-
PD soybean bovine phosphoryl
gal
trypsin serum ase B
akt
inhibito albumin
osi
r das
e
 REase
Bsp9BI
PS
25,0
kDa
30 -31
REase
kDa
Bsp9BI
PM Carbonic
25,0
Anhydras
kDa
e
20-23
kDa 63-66
kDa 200-
Protein 97 kDa
protein 212
PSG soybean phosphoryl
bovine kDa
trypsin ase B
serum Myosin
inhibito albumin
r
20-23 63-66 bp
bp protein 116 kDa B-
PEG Protein bovine galaktosida
soybean serum se
trypsin albumin

20-23 66,2 kDa

bp 97-99
protein
kDa
PSE Protein bovine
phosphor
soybean serum
ylase B
trypsin albumin

19,7/21, 63-66 bp 66,2 kDa 97-99 200-

4 kDa 116
protein protein kDa 212k
kDa B-
PEE Protein bovine bovine phosph Da
galakto
soybean serum serum orylase Myos
sidase
trypsin albumin albumin B in

Tabel 1. Hasil identifikasi protein dalam sampel

4.2.Pembahasan
Metode SDS-PAGE (SDS-Polyacrylamide gel electrophoresis) merupakan teknik untuk
memisahkan rantai polipeptida pada protein berdasarkan kemampuannya untuk bergerak
dalam arus listrik. Metode elektroforesis digunakan karena tidak mempengaruhi struktur
bipolimer dan sensitif terhadap bobot molekul yang cukup kecil. Protein dapat dipisahkan
berdasarkan ukuran molekulnya dengan elektroforesis gel poliakrilamid dengan sistem tegak.
Pada praktikum kali ini didapatkan hasil pita berwarna biru pada gel elektroforesis. Kemudian
untuk memudahkan dalam melihat hasilnya dibuat menjadi sketsa dari gel tersebut. Hal
Voltase yang digunakan pada elektroforesis ini sebesar 120 V selama 3 jam. Pada sumur 1-2
menggunakan sampel plasma darah dan protein sitoplasma (PS). Pada hasil yang didapatkan
untuk sampel plasma darah (PD) terdeteksi terkandung protein trypsin 21,4 kDa pada pita
pertama, pada pita ketiga terdeteksi mengandung protein Albumin 66,2 kDa, pada pita ke
empat terdeteksi mengandung protein Phosphorylase B 97,4 kDa, dan pita ke Sembilan yang
terdeteksi mengandung protein B-galaktosidase 116 kDa. Pada hasil sampel protein
sitoplasma (PS) pita yang dihasilakn hanya 1 yang terdeteksi sebagai protein REase Bsp9BI
25,0 kDa . Pada sampel protein membrane (PM) pita pertama terdeteksi sebagai protein REase
Bsp9BI 25,0 kDa, sedangkan pita kedua sebagai protein Carbonic Anhydrase 30 -31 kDa.
Pada Sampel Protein Supernatant Garam (PSG) pada pita petama terbentuk protein trypsin
21,4 kDa, pada pita kedua terbentuk protein albumin 66,2 kDa, pada pita keempat terbentuk
protein phosphorylase B 97,4 kDa, dan pada pita keenam terbentuk protein myosin 200-
212kDa. pada sampel Protein Endapan Garam (PEG) pada pita pertama terbentuk protein
trypsin 21,4 kDa, pada pita ketiga terbentuk protein albumin 66,2 kDa, dan pada pita keempat
terbentuk protein B-galaktosidase 116 kDa. Pada sampel Protein Supernatant Etanol (PSE)
pita pertama terbentuk protein trypsin 21,4 kDa, pita kedua terbentuk protein albumin 66,2
kDa, dan pita ketiga terbentuk protein phosphorylase B 97,4 kDa. Pada sampel terakhir yaitu
Protein Endapan Etanol (PEE) pada pita pertama terbentuk protein trypsin 21,4 kDa, pita
ketiga dan keempat terbentuk protein albumin 66,2 kDa, pita kelima terebentuk protein
phosphorylase B 97,4 kDa, pita keenam terbentuk protein B-galaktosidase 116 kDa, dan pita
kedelapan terbentuk protein myosin 200-212kDa. Dilihat dari analisis diatas maka dapat
dikatakan bahwa asal dan bahan yang digunakan dari protein yang akan diidentifikasi
mempengaruhi jenis protein yang didapatkan. Dapat dikatakan pula bahwa protein yang ada
pada darah memiliki jenis bermacam-macam tergantung dari mana sumber protein berasal.
Protein dalam darah dapat berasal dari sitoplasma, membran, dan plasma darah. Sehingga
dalam plasma darah juga pada bagian supernatan plasma darah dan endapan plasma darah
juga memiliki perbedaan jenis protein dipengaruhi oleh jenis perlakuan bahan.

Dari hasil elektroforesis dapat dilihat bahwa metode pemisahan protein yang berbeda
pada sampel yang berbeda juga akan didapatkan protein yang berbeda-beda. Meskipun ada
beberapa protein yang sama, tetapi masih ada banyak perbedaan yang ditemukan dari setiap
metode maupun jenis sampel. Perbedaan yang ditemukan bukan hanya dari segi jumlah
protein yang ditemukan tetapi jenis protein yang ditemukan juga berbeda.

Sebagai contoh pada protein sitoplasmuk hanya ditemukan 1 pita dengan berat
molekul 25 kDa yang terdeteksi sebagai protein REase Bsp9BI. Sedangkan pada protein
pengedapan dengan etanol didapatkan pita yang lebih banyak dan juga menghasilkan pita
yang lebih tebal dan terang dan terdeteksi 6 pita protein berbeda. Sedangkan pada plasma
darah yang menghasilkan jumlah pita yang cukup banyak juga tetapi hanya terdeteksi 4 pita
protein. Dari hasil ini dapat diketahui bahwa meski jumlah pita yang ditemukan pada gel
banyak, tetapi hanya beberapa pita yang dapat terdeteksi.

Pita yang dapat terdeteksi adalah pita yang memiliki kualitas baik. Kualitas pita protin
dapat dilihat dari ketebalan pita. Semakin tebal pita protein maka semakin tinggi konsentasi
protein. Semakin jelas pita protein yang terlihat, maka semakin tinggi tingkat kemurnian yang
didapatkan dari pemisahan protein. Maka dari teori ini dapat dikatakan bahwa hasil pemisahan
yang paling baik ditunjukkan oleh metode pengendapan protein dengan etanol karena berhasil
terdeteksi protein paling banyak dengan kualitas yang baik. Sedangkan hasil yang kurang baik
ditunjukkan oleh metode pemisahan dengan sentrifugasi pada protein sitoplasma karena
protein yang berhasil terdeteksi hanya 1.

Sehingga dapat disimpulkan bahwa metode terbaik untuk pemisahan protein adalah
pengendapan dengan etanol. Hal terjadi karena dengan penambahan etanol dapat menurunkan
kelarutan protein dalam air sehingga pengendapan yang terjadi lebih efektif. Penambahan
etanol menyebabkan pemisahan antara protein dengan air dan secara langsung protein akan
beragregasi dan mengendap.
 Berdasarkan hasil elektroforesis yang didapat, dapat dilihat bahwa metode pemisahan
protein paling baik ada metode pengendapan etanol, dimana dilihat dari sampel PEE (Protein
Endapan Etanol) bahwa teridentifikasi 6 protein yang terdapat pada sampel darah tersebut.
Protein tersebut antara lain pada berat molekul 19,7 - 21,4 kDa terdeteksi sebagai protein
soybean trypsin, pada berat molekul 66,2 kDa teridentifikasi sebagai protein bovine serum
albumin, berat molekul 63-66 kDa teridentifikasi sebagai protein bovine serum albumin, pada
band ke-6 dengan berat molekul 97-99 kDa teridentifikasi sebagai protein phosphorylase B,
pada berat molekul 116 kDa teridentifikasi sebagai protein B-galaktosidase, dan pada band 8
dengan berat molekul 200 - 212kDa teridentifikasi sebagai protein Myosin. Hal ini sejalan
dengan pernyataan oleh Frandson (1992) yang menyatakan bahwa dalam plasma darah
terdapat beberapa protein seperti myosin, β-Galaktosidase, Glycogen,albumin, ovalbumin,
Carbonic Anhydrase, Trypsin, Lysozim, dan Aprotinin dengan berat molekulnya masing –
masing, sehingga dengan demikian metode yang paling baik adalah metode pengendapan
etanol karena menghasilkan pemisahan protein yang baik dan banyak protein yang
teridentifikasi .
 BAB V
KESIMPULAN

1. Elektroforesis merupakan suatu Teknik pemisahan molekul berdasarkan ukurannya

menggunakan medan listrik yang dialirkan pada suatu medium yang mengandung sampel
yang akan dipisahkan. Prinsip elektroforesis ini adalah bergeraknya molekul dan partikel kea
rah elektroda yang memiliki muatan berlawanan dibawah pengaruh medan listrik.
2. Metode SDS-PAGE (SDS-Polyacrylamide gel electrophoresis) digunakan untuk pemisahan
protein berdasarkan kemampuannya bergerak dalam arus listrik, dimana dengan
menggunakan metode ini maka akan memberikan muatan negatif pada protein,
menyederhanakan protein, menyamakan kondisi protein dan mendenaturasi protein sehingga
akan lebih mudah dilakukan pemisahan protein. Dalam praktikum ini digunakan 3 metode
yaitu sentrifugasi, pengendapan garam dan pengendapan etanol.
3. Berdasarkan hasil praktikum metode yang paling baik dalam pemisahan protein adalah
metode pengendapan etanol, karena hasil yang didapatkan bahwa pengendapan etanol
memisahkan protein dalam darah paling baik diantara metode yang lain. Hal ini dapat dilihat
dari hasil protein yang teridentifikasi pada sampel PEE.
 DAFTAR PUSTAKA

Bachrudin Z. 1999. Petunjuk Laboratorium: Isolasi, Identifikasi, dan Pewarnaan Protein. PAU
Bioteknologi UGM: Yogyakarta
Champe, P. C., R. A. Harvey, & D.R. Ferrier. 2005. Biochemistry. 3rd Revised Edition. Lippincott
Wiliams dan Walkins, Philadelphia.
Dja’far AH. 1988. Gambaran Elektroforesis Plasma Protein Darah Sapi Peranakan Ongole dari
Rumah Potong Hewan Bogor. Skripsi. Program Sarjana. Fakultas Kedokteran Hewan.
Institut Pertanian Bogor. Bogor.
Frandson, R.D. 1992. Anatomi dan Fisiologi Ternak Edisi ke-4. Gadjah Mada University Press.
Yogyakarta.

Hemes, B.D.1998.Gel Electrophoresis of proteins. Oxford university press. New

York.
Poedjiadi, A. 1994 Dasar-dasar Biokimia. Universitas Indonesia. Jakarta
Triwibowo, Yuwono. 2005. Biologi Molekuler. Yogyakarta: Penerbit Erlangga.