APLIKASI KROMATOGRAFI HPLC UNTUK PENETAPAN KADAR

SEDIAAN OBAT

BAB 1 PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

HPLC merupakan suatu metode yang sensitif dan akurat untuk
penentuan, kuantitatif serta baik menguap seperti asam amino,
protein, peptisida dan lain-lain.
Salah satu metode yang dapat digunakan untuk memurnikan
sampel yaitu dengan menggunakan alat HPLC (High Performance
Liquid Chromatography). Metode ini memiliki kelebihan dibandingkan
metode lain misalnya mampu memisahkan molekul-molekul dari suatu
campuran, mudah melaksanakannya, epekaan yang tinggi, kolom
dapat digunakan kembali dan dapat dihindari terjadinya kerusakan
bahan yang dianalisis.
Metode ini menggunakan eluent sebagai fase gerak dan silica
gel sebagai fase diam. Fase gerak merupakan salah datu dari variable
yang memperngaruhi pemisahan, oleh karena itu solven yang
digunakan harus memiliki sifat yang murni (tidak terdapat
kontaminan), tidak bereaksi dengan wadah, melarutkan sampel,
sesuai dengan detektor dan memiliki viskositas yang rendah.
Dalam memurnikan suatu senyawa diperlukan metode yang
sesuai dan efisien terhadap bahan yang digunakan.Dalam
memurnikan suatu sampel diperlukan eluent dan silica gel yang
berfungsi sebagai fase diam dan fase gerak.
Karena metode analisis menggunakan HPLC memerlukan biaya
yang mahal maka jarang digunakan dalam skala laboratorium kecuali
dalam skala penelitian.Metode ini telah digunakan dalam uji kemurnian
lebih dari 277 bahan obat karena hasil analisis yang memiliki akurasi
dan presisi yang tinggi dan waktu analisis yang cepat.
Oleh karena itu, diskusi ini dilakukan agar praktikan mampu
mengetahui kelebihan dan kekurangan dari metode HPLC
dibandingkan dengan metode yang lain, selain itu agar praktikan juga

NURHIDAYA SAFITRI YSRAFIL

150 2014 0025
 APLIKASI KROMATOGRAFI HPLC UNTUK PENETAPAN KADAR
SEDIAAN OBAT

mampu memahami mekanisme kerja dan bagian-bagian penting dari

HPLC.
1.2 Maksud Praktikum
Adapun maksud dari praktikum ini yaitu untuk mengetahui cara
aplikasi kromatografi HPLC untuk penetapan kadar sediaan obat.
1.3 Tujuan Praktikum
Adapun tujuan dari praktikum ini adalah untuk mengetahui dan
memahami caraaplikasi kromatografi HPLC untuk penetapan kadar
sediaan obat.

NURHIDAYA SAFITRI YSRAFIL

150 2014 0025
 APLIKASI KROMATOGRAFI HPLC UNTUK PENETAPAN KADAR
SEDIAAN OBAT

BAB 2 TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Teori Umum

High Performance Liquid Chromatography (HPLC)
merupakan teknik kromatografi kolom yang paling sering
digunakan. Popularitasnya disebabkan oleh kekuatan pemisahannya
yang tinggi, selektifitasnya yang sangat baik, dan banyaknya solut
yang dapat dipisahkan dengan metode ini. Serupa dengan KLT,
pemisahan dengan HPLC dapat dilakukan baik pada fase normal
atau fase terbalik menggunakan fase diam silika atau silika fase
terikat. Meskipun demikian, berbeda dengan KLT yang banyak
menggunakan fase normal,kebanyakan HPLC menggunakan fase
terbalik untuk analisis solut. HPLC fase terbalik menggunakan
pelarut yang kurang toksik (air dan pelarut-pelarut yang dapat
campur dengan air) sehingga mengurangi polusi lingkungan
(Rohman, 2007).
High Performance Liquid Chromatgraphy (HPLC)
dikembangkan pada akhir tahun 1960-an awal tahun 1970-an. Saat ini
HPLC merupakan teknik pemisahan yang diterima secara luas
untuk analisis bahan obat, baik dalam bulk atau dalam sediaan
farmasetik, serta obat dalam cairan biologis (Rohman, 2009).
Maksud dan tujuan analisis dengan HPLC yaitu didapatnya
pemisahan yang baik dalam waktu yang relatif singkat. Untuk
tercapainya maksud dan tujuan analisis dengan HPLC di atas
maka diperlukan penatalaksanaan yang betul-betul sudah
dipersiapkan dan diperhitungkan, yang antara lain (Mulja, 2005) :
a. Dipilih pelarut pengembang atau pelarut pengembang campur
yang sesuai untuk komponen yang dipisahkan
b. Berkaitan dengan pemilihan pelarut pengembang (solven)
maka kolom yang dipakai juga harus diperhatikan
c. Detektor yang memadai

NURHIDAYA SAFITRI YSRAFIL

150 2014 0025
 APLIKASI KROMATOGRAFI HPLC UNTUK PENETAPAN KADAR
SEDIAAN OBAT

d. Pengetahuan dasar HPLC yang baik serta pengalaman dan

keterampilan kerja yang baik.
Metode High Performance Liquid Chromatography (HPLC),
merupakan teknik kromatografi cair kinerja tinggi yang berasal
dari kromatografi kolom klasik, dimana teknik kromatografi ini
bertambah maju setelah HPLC dikemas dengan bead yang sangat
kecil dan beroperasi pada tekanan tinggi (Putra, 2004).
Pada saat ini, HPLC merupakan metode kromatografi cair
yang pemakaiannya telah sangat berkembang, baik untuk analisis rutin
maupun untuk preparatif pada banyak laboratorium. Dibandingkan
dengan kromatografi gas, HPLC dioperasikan pada suhu kamar,
dimana senyawa yang tidak tahan panas dapat ditentukan dengan
mudah dan sifat fasa gerak dapat diubah dengan merubah
komposisi dari fasa gerak yang digunakan (Hendayana, 2006).
High Performance Liquid Chromatography (HPLC)
merupakan sistem pemisahan dengan kecepatan dan efisiensi
yang tinggi. Hal ini karena didukung oleh kemajuan dalam
teknologi kolom, sistem pompa tekanan tinggi, detektor yang
sangat sensitive dan beragam serta data sistem yang canggih
(Drenthe College, 2013). HPLC mampu menganalisa berbagai
cuplikan secara kualitatif maupun kuantitatif, baik dalam komponen
tunggal maupun campuran (Ditjen POM, 1995).
High Performance Liquid Chromatography (HPLC)
merupakan suatu metode pemisahan canggih dalam analisis
farmasi yang dapat digunakan sebagai uji identitas, uji kemurnian dan
penetapan kadar. Titik beratnya adalah untuk analisis senyawa-
senyawa yang tidak mudah menguap dan tidak stabil pada suhu
tinggi, yang tidak bisa dianalisis dengan kromatografi gas. Banyak
senyawa yang dapat dianalisis dengan HPLC mulai dari senyawa
ion anorganik sampai senyawa organik makromolekul (Putra, 2004).

NURHIDAYA SAFITRI YSRAFIL

150 2014 0025
 APLIKASI KROMATOGRAFI HPLC UNTUK PENETAPAN KADAR
SEDIAAN OBAT

Instrumentasi HPLC pada dasarnya terdiri atas : wadah fase

gerak, pompa, alat untuk memasukkan sampel (tempat injeksi), kolom,
detektor, wadah penampung buangan fase gerak, dan suatu
komputer atau integrator atau perekam (Rohman, 2009).

1. Wadah fase gerak dan fase gerak

Wadah fase gerak harus bersih dan lembam (inerf).
Wadah pelarut kosong ataupun labu laboratorium dapat
digunakan sebagai wadah fase gerak. Wadah ini biasanya dapat
menampung fase gerak antara 1 sampai 2 liter pelarut (Rohman,
2009).
Fase gerak atau eluen biasanya terdiri atas campuran
pelarut yang dapat bercampur yang secara keseluruhan berperan
dalam daya elusi dan resolusi. Daya esolusi dan resolusi ini
ditentukan oleh polaritas keseluruhan pelarut, polaritas fase
diam, dan sifat komponen-komponen sampel. Untuk fase
normal (fase diam lebih polar daripada fase gerak),
kemampuan elusi meningkat dengan meningkatnya polaritas
pelarut. Sementara untuk fase terbalik (fase diam kurang polar
daripada fase gerak), kemampuan elusi menurun dengan
meningkatnya polaritas pelarut (Rohman, 2009).
Fase gerak yang paling sering digunakan untuk
pemisahan dengan fase terbalik adalah campuran larutan buffer
dengan metanol atau campuran air dengan asetonitril. Untuk
pemisahan dengan fase normal, fase gerak yang paling sering

NURHIDAYA SAFITRI YSRAFIL

150 2014 0025
 APLIKASI KROMATOGRAFI HPLC UNTUK PENETAPAN KADAR
SEDIAAN OBAT

digunakan adalah campuran pelarut-pelarut hidrokarbon dengan

pelarut yang terklorisasi atau menggunakan pelarut-pelarut jenis
alkohol. Pemisahan dengan fase normal ini kurang umum
dibanding dengan fase terbalik (Rohman, 2009).
2. Pompa
Pompa yang cocok digunakan untuk HPLC adalah pompa
yang mempunyai syarat sebagaimana syarat wadah pelarut,
yakni pompa harus inert terhadap fase gerak. Bahan yang
umum dipakai untuk pompa adalah gelas, baja tahan karat, teflon
dan batu nilam (Rohman, 2009).
Tujuan penggunaan pompa atau sistem penghantaran
fase gerak adalah untuk menjamin proses penghantaran fase
gerak berlangsung secara tepat, reprodusibel, konstan, dan
bebas dari gangguan. Ada 2 jenis pompa dalam HPLC yaitu
pompa dengan tekanan konstan, dan pompa dengan aliran fase
gerak yang konstan. Tipe pompa dengan aliran fase gerak yang
konstan sejauh ini lebih umum dibandingkan dengan tipe
pompa dengan tekanan konstan (Rohman, 2009).
3. Tempat penyuntikan sampel
Sampel-sampel cair dan larutan disuntikkan secara
langsung kedalam fase gerak yang mengalir di bawah tekanan
menuju kolom menggunakan alat penyuntik yang terbuat dari
tembaga tahan karat dan katup teflon yang dilengkapi dengan
keluk sampel (sample loap) internal atau eksternal (Rohman, 2009).
4. Kolom
Ada 2 jenis kolom pada HPLC yaitu kolom konvensional
dan kolom mikrobor. Kolom merupakan bagian HPLC yang mana
terdapat fase diam untuk berlangsungnya proses pemisahan
solut/analit (Rohman, 2009).

NURHIDAYA SAFITRI YSRAFIL

150 2014 0025
 APLIKASI KROMATOGRAFI HPLC UNTUK PENETAPAN KADAR
SEDIAAN OBAT

5. Detektor
Detektor pada HPLC dikelompokkan menjadi 2 golongan
yaitu : detektor universal (yang mampu mendeteksi zat secara
umum, tidak bersifat spesifik, dan tidak bersifat selektif) seperti
detektor indeks bias dan detektor spektrometri massa dan
golongan detektor yang spesifik yang hanya akan mendeteksi
analit secara spesifik dan selektif, seperti detektor UV-VIS,
detektor flouresensi dan elektrokimia (Rohman, 2009).
Idealnya, suatu detektor harus mempunyai karakteristik sebagai
berikut : (1) mempunyai respon terhadap solut yang cepat dan
reprodusibel; (2) mempunyai sensitifitas yang tinggi, yakni mampu
mendeteksi solut pada kadar yang sangat kecil; (3) stabil dalam
pengoperasiannya; (4) mempunyai sel volume yang kecil sehingga
mampu meminimalkan pelebaran pita; (5) signal yang dihasilkan
berbanding lurus dengan konsentrasi solut pada kisaran yang
luas (kisaran dinamis linier); dan (6) tidak peka terhadap perubahan
suhu dan kecepatan air fase gerak (Rohman, 2009).
Idealnya profil setiap kromatogram HPLC merupak an suatu
garis tegak lurus bagi masing-masing linarut. Akan tetapi keadaan
demikian tidak akan dijumpai pada pelaksanaan analisis dengan
HPLC. Kromatogram HPLC merupakan hubungan antara waktu
sebagai absis dan tanggap detektor sebagai ordinat pada sistem
koordinat cartesian, dimana titik nol dinyatakan sebagai saat
dimulainya injeksi sampel. Molekul-molekul sampel yang
diinjeksikan menuju kolom analisis tidak langsung secara serempak
molekul-molekulnya berkumpul pada satu titik. Demikian pula tiap-tiap
molekul linarut akan mengalami hambatan fasa diam didalam kolom
dengan waktu yang berbeda. Oleh karena itu semua molekul linarut
tidak serempak keluar dari kolom, keluarnya molekul linarut dari kolom
keluar secara acak dan demikian pula untuk respon detektor terhadap

NURHIDAYA SAFITRI YSRAFIL

150 2014 0025
 APLIKASI KROMATOGRAFI HPLC UNTUK PENETAPAN KADAR
SEDIAAN OBAT

linarut keluar dari kolom tidak serempak terhadap semua molekul

(Mulja, 2005).
Solut-solut yang kurang kuat interaksinya dengan fasa diam
akan keluar dari kolom lebih dulu. Sebaliknya solut-solut yang kuat
berinteraksi dengan fasa diam maka solut-solut tersebut akan keluar
dari kolom lebih lama. Setiap komponen campuran yang keluar
kolom dideteksi oleh detektor kemudian direkam dalam bentuk
kromatogram (Hendayana, 2006).
Luas puncak kromatografi pada kurva elusi dipengaruhi
oleh tiga proses perpindahan massa yaitu difusi eddy, difusi
longitudinal dan transfer massa tidak seimbang. Sedangkan
parameter -parameter yang menentukan berlangsungnya proses-
proses tersebut adalah : laju aliran, ukuran partikel, laju difusi dari
ketebalan stasioner. Van Deemeter menghubungkan ketiga proses
di atas dengan efisiensi kolom dalam suatu persamaan. Persamaan
ini telah diuji dengan metode kromatografi gas (Khopkar, 2003).
Cara kerja HPLC adalah : dengan bantuan pompa fase gerak
cair dialirkan melalui kolom detektor. Cuplikan dimasukkan ke
dalam aliran fase gerak dengan cara penyuntikan. Didalam kolom
terjadi pemisahan komponen-komponen campuran. Karena
perbedaan kekuatan interaksi antara solut-solut terhadap fasa diam
(Hendayana, 2006).
Solut-solut yang kurang kuat interaksinya dengan fase diam
akan keluar dari kolom lebih dulu. Sebaliknya solut-solut yang kuat
berinteraksi dengan fase diam maka solut-solut tersebut akan keluar
dari kolom lebih lama. Setiap komponen campuran yang keluar
kolom dideteksi oleh detektor kemudian direkam dalam bentuk
kromatogram (Hendayana, 2006).
Pemisahan dengan HPLC mempunyai beberapa keuntungan
dibandingkan dengan metode konvensional seperti waktu analisis

NURHIDAYA SAFITRI YSRAFIL

150 2014 0025
 APLIKASI KROMATOGRAFI HPLC UNTUK PENETAPAN KADAR
SEDIAAN OBAT

yang cepat, biaya yang rendah dan kemungkinan untuk

menganilis sampel yang tidak stabil (Putra, 2004).
2.2 Uraian Bahan
1. Parasetamol (Ditjen POM 1979 : 37)
Nama Resmi : ACETAMINOPHENUM
Nama Lain : Asetamiofen/Parasetamol
RM/BM : C8H9NO2/151,16

Rumus Struktur :
Pemerian : Hablur atau serbuk hablur putih; tidak
berbau; rasa pahit
2. Asam asetat (Ditjen POM, 1979 : 42)
Nama resmi : ACIDUM ACETICUM GLACIALE
Nama lain : Asam asetat glacial
RM/BM : C2H2O2 / 60,05

Rumus struktur :
Pemerian : Cairan jernih, tidak berwarna, bau
khas, tajam, jika diencerkan dengan
air, rasa asam
Kelarutan : Dapat campur dengan air, dengan
etanol (95%) P dan dengan gliserol P
Penyimpanan : Dalam wadah tertutup rapat
Kegunaan : Zat tambahan
2.1 Prosedur Kerja (Anonim 2016)
1. Penetapan Kadar Tablet Parasetamol dengan Metode Standar
Ekstrenal
a. Menggunakan kolom ODS (oktadesisilen,C18) : diameter 4,6
mm dan panjang 150 mm.

NURHIDAYA SAFITRI YSRAFIL

150 2014 0025
 APLIKASI KROMATOGRAFI HPLC UNTUK PENETAPAN KADAR
SEDIAAN OBAT

b. Fase gerak : campuran dari asetonitril : asam asetat 0,05 M

(85:15)
c. Kecepatan alir 1 mL/menit
Prosedur:
a. Ditimbang 125 mh parasetamol baku dimasukkan dalam labu
takar 250 mL dan diencerkan dengan larutan asam asetat 0,05
M sampai tanda batas. (larutan stok)
b. Buat seri larutan baku dari larutan stok dengan deret
konsentrasi 0,5, 1,0, 1,5, 2,0 dan 2,5 mg/100 mL.
c. Dilakukan penetapan kelima larutan standar di atas dengan
HPLC. Adapun hasilnya, seperti pada table berikut:
Tabel 12.3 Data obtained from the analysis of paracetamol standard
solutions by HPLC

Concentration of paracetamol
Area of chromatographic peak
standard solution mg/100 mL
0.5044 17 994
1.009 36 109
1.513 54 121
2.018 71 988
2.522 89 984
Pers. Liner : y = 35656,585x + 80,803 ; r = 1,000
d. Timbangan berat 20 tablet parasetamol yang dianalisis, adalah
12,1891 gram
e. Serbuk tablet diambil 150,5 mg dilarutkan dengan asam asetat
0,05 M dalam labu takar 250 mL, lalu disaring
f. Dipipet 25 mL alikot dan encerkan dengan asam asetat 0,05 M
sampai 100 mL dalam labu takar. Selanjutnya, larutan
diencerkan lebih lanjut dengan mempipet 10 mL ke dalam labu
takar 100 mL dengan larutan asam asetat 0,05 M sampai
tanda batas

NURHIDAYA SAFITRI YSRAFIL

150 2014 0025
 APLIKASI KROMATOGRAFI HPLC UNTUK PENETAPAN KADAR
SEDIAAN OBAT

g. Larutan, dilakukan penetapan menggunakan kromatografi

HPLC pada kondisi sama pada larutan baku. Adapun hasilnya
diperoleh luas puncak kromatogram = 45.205
h. Tetapkan tablet parasetamol sesuai persyaratan tablet dalam
Farmakope Indonesia
2. Penetapan Kadar Krim Miconazole dengan Metode Standar
Internal Econazol
a. Menggunakan kolom ODS : diameter 4,6 mm dan panjang 150
mm
b. Fae gerak : campuran asetonitril : buffer pH 4,0 Na. Asetat 0,1
M (70:30)
c. Kecepatan alir 1 Ml/menit
Prosedur :
a. Buat larutan stok standar miconazol nitrat dan econazol nitrat
(standar internal) dengan menimbang masing-masinh 200,0
mg. Kemudian, masing-masing dilarutkan dengan larutan fase
gerak sampai 250 mL dalam labu takar.
b. Pipet 25 mL larutan econazol stok standar masukkan kedalam
lima buah labu takar 100 mL. Selanjutnya, pada kelima labu
takar tersebut ditambahkan larutan stok standar miconazol
masing-masing 15 mL, 20 mL, 30 mL, dan 35 mL, lalu encerkan
dengan larutan fase gerak hingga tanda batas
c. Kelima deret konsentrasi standar tersebut, masing-masing
dilakukan pengukuran dengan kromatigrafi HPLC, sehingga
diperoleh data seperti berikut:
Tabel 12.4
Concentration
of miconazole Area of Area of
Area miconazole
in calibration miconazole econazole
Area econazole
solution mg/ peak peak
100 Ml
12.09 70 655 123 563 0.5718
16.12 96 218 125 376 0.7674

NURHIDAYA SAFITRI YSRAFIL

150 2014 0025
 APLIKASI KROMATOGRAFI HPLC UNTUK PENETAPAN KADAR
SEDIAAN OBAT

20.15 119 793 126 783 0.9449

24.18 151 310 127 889 1.183
28.21 166 673 125 436 1.329
Pers. Liner: y = 0,048 x – 0,006 ; r = 0,998
Data pengamatan:
1. Berat miconazole yang digunakan membuat larutan stok =
201,5 mg
2. Berat krim untuk dianalisis = 1,0368 g
d. Sampel krim yang diuji mengandung micoazole nitrat 20 mg
dalam 1000 mg krim (2%). Berat krim miconazol adalah 1,0368
g, berat krim yang digunakan untuk analisis adalah 201,5 mg
e. Ditimbang 201,5 mg krim dilarutkan dengan 25 mL larytan fase
gerak dalam corong pisah sambil dikocok selama 5 menit.
Ekstraksi dengan 50 Ml heksan dan lapisan heksan
dikeluarkan/dibuang. Larutan fase gerak dialiri gas nitrogen
untuk menghilangkan sisa heksan, setelah itu dimasukkan ke
dalam labu takar 100 mL dan diencerkan sampai batas dengan
larutan fase gerak. Saring larutan dan pipet sebanyak 20 mL
untuk dilakukan pengukuran kromatografi HPLC menggunakan
detektor UV pada panjang gelombang 220 nm
f. Hasil pengukuran HPLC diperoleh data, seperti berikut:
1. Luas puncak kromatogram sampel miconazol = 119 923
2. Luas puncak kromatogram pembanding econazol = 124 118
3. Hitung persentase kadar miconazol dalam krim dan tetapkan
berdasarkan persyaratan sediaan krim miconazol yang
tertera dalam Farmakope Indonesia.

NURHIDAYA SAFITRI YSRAFIL

150 2014 0025
 APLIKASI KROMATOGRAFI HPLC UNTUK PENETAPAN KADAR
SEDIAAN OBAT

BAB 3 METODE KERJA

3.1 Alat Praktikum
Adapun alat yang digunakan yaitu kromatografi HPLC,
timbangan analitik, labu takar, corong, pipet volume, dan bulk.
3.2 Bahan Praktikum
Adapun bahan yang digunakan yaitu asetonitril, asam asetat
0,05 M, tablet parasetamol, econazol, miconazol nitrat, econazol nitrat.
3.3 Cara Kerja
1. Penetapan Kadar Tablet Parasetamol dengan Metode Standar
Ekstrenal
a. Ditimbang 125 mg parasetamol baku
b. Dimasukkan dalam labu takar 250 mL
c. Diencerkan dengan larutan asam asetat 0,05 M sampai tanda
batas. (larutan stok)
d. Dibuat seri larutan baku dari larutan stok dengan deret
konsentrasi 0,5, 1,0, 1,5, 2,0 dan 2,5 mg/100 mL.
e. Dilakukan penetapan kelima larutan standar di atas dengan
HPLC (Timbangan berat 20 tablet parasetamol yang dianalisis,
adalah 12,1891 gram).
f. Diambil 150,5 mg serbuk tablet
g. Dilarutkan dengan asam asetat 0,05 M dalam labu takar 250 mL,
lalu disaring
h. Dipipet 25 mL alikot dan diencerkan dengan asam asetat 0,05 M
sampai 100 mL dalam labu takar.
i. Diencerkan lebih lanjut dengan mempipet 10 mL ke dalam labu
takar 100 mL dengan larutan asam asetat 0,05 M sampai tanda
batas
j. Dilakukan penetapan menggunakan kromatografi HPLC pada
kondisi sama pada larutan baku. Adapun hasilnya diperoleh luas
puncak kromatogram = 45.205

NURHIDAYA SAFITRI YSRAFIL

150 2014 0025
 APLIKASI KROMATOGRAFI HPLC UNTUK PENETAPAN KADAR
SEDIAAN OBAT

k. Ditetapkan tablet parasetamol sesuai persyaratan tablet dalam

Farmakope Indonesia
2. Penetapan Kadar Krim Miconazole dengan Metode Standar
Internal Econazol
a. Dibuat larutan stok standar miconazol nitrat dan econazol nitrat
(standar internal) dengan menimbang masing-masing 200,0 mg.
b. Dilarutkan dengan larutan fase gerak sampai 250 mL dalam labu
takar.
c. Dipipet 25 mL larutan econazol stok standar masukkan kedalam
lima buah labu takar 100 mL.
d. Ditambahkan larutan stok standar miconazol masing-masing 15
mL, 20 mL, 30 mL, dan 35 mL pada 5 labu
e. Diencerkan dengan larutan fase gerak hingga tanda batas
f. Dilakukan pengukuran dengan kromatigrafi HPLC.
g. Ditimbang 201,5 mg krim dilarutkan dengan 25 mL larutan fase
gerak dalam corong pisah sambil dikocok selama 5 menit.
h. Diekstraksi dengan 50 mL heksan dan lapisan heksan
dikeluarkan/dibuang.
i. Dialiri larutan fase gerak dengan gas nitrogen untuk
menghilangkan sisa heksan,
j. Dimasukkan ke dalam labu takar 100 mL
k. Diencerkan sampai batas dengan larutan fase gerak.
l. Disaring larutan dan pipet sebanyak 20 mL untuk dilakukan
pengukuran kromatografi HPLC menggunakan detektor UV pada
panjang gelombang 220 nm
m. Dihitung persentase kadar miconazol dalam krim
n. Ditetapkan berdasarkan persyaratan sediaan krim miconazol
yang tertera dalam Farmakope Indonesia

NURHIDAYA SAFITRI YSRAFIL

150 2014 0025
 APLIKASI KROMATOGRAFI HPLC UNTUK PENETAPAN KADAR
SEDIAAN OBAT

BAB 4 HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Hasil
4.1.1 Tabel pengamatan
Tabel 12.3 Data obtained from the analysis of paracetamol
standard solutions by HPLC

Concentration of paracetamol
Area of chromatographic peak
standard solution mg/100 mL
0.5044 17 994
1.009 36 109
1.513 54 121
2.018 71 988
2.522 89 984

Tabel 12.4
Concentration
of miconazole Area of Area of
Area miconazole
in calibration miconazole econazole
Area econazole
solution mg/ peak peak
100 mL
12.09 70 655 123 563 0.5718
16.12 96 218 125 376 0.7674
20.15 119 793 126 783 0.9449
24.18 151 310 127 889 1.183
28.21 166 673 125 436 1.329

Pers. Liner: y = 0,048 x – 0,006 ; r = 0,998

NURHIDAYA SAFITRI YSRAFIL

150 2014 0025
 APLIKASI KROMATOGRAFI HPLC UNTUK PENETAPAN KADAR
SEDIAAN OBAT

4.1.2 PERHITUNGAN
1. Penetapan kadar tablet paracetamol dengan metode standar
adisi eksternal
y : 35656,585x + 80,803
dik : Luas area = 45.205
Dit % kadar ?
y = 35656,585x + 80,803; r=1,000
y= 45.205
y= a + bx
𝑦−𝑎
C= 𝑏
45.205 𝑥 80,803
C= 35656,585

C= 1,265 ppm
𝑉 𝑎𝑤𝑎𝑙 𝑥 𝐶 𝑠𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙
% kadar = 𝑥 𝑓𝑝 𝑥 100%
𝐵𝑒𝑟𝑎𝑡 𝑆𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙
1,265 𝑥 250 𝑚𝐿 𝑥 40
= 𝑥 100%
15,05

= 84,05 %
2. Penetapan kadar krim Miconazole dengan metode standar
internal econazole

𝑎𝑟𝑒𝑎 𝑚𝑖𝑐𝑜𝑛𝑎𝑧𝑜𝑙𝑒 119923

Dik : = 124118 = 0,966
𝑎𝑟𝑒𝑎 𝑒𝑐𝑜𝑛𝑎𝑧𝑜𝑙𝑒

y= 0,048x- 0,006 r= 0,998

Dit % kadar ?
y= a + bx
𝑦−𝑎
x=
𝑏
0,996− 0,006
x= 0,048

x= 20 ppm
𝑋 𝑥 𝑉 𝑠𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙
% kadar = 𝑥 100%
𝐵𝑒𝑟𝑎𝑡 𝑆𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙
20 𝑥 250𝑥
= 𝑥 100%
200

= 2500%

NURHIDAYA SAFITRI YSRAFIL

150 2014 0025
 APLIKASI KROMATOGRAFI HPLC UNTUK PENETAPAN KADAR
SEDIAAN OBAT

4.2 Pembahasan

HPLC sering digunakan antara lain untuk menetapkan kadar

senyawa aktif pada obat, produk hasil samping proses sintesis, atau
produk- produk degradasi dalam sediaan farmasi. Keterbatasan
metode HPLC ini adalah untuk identifikasi senyawa, kecuali jika HPLC
dihubungkan dengan spektometer massa (MS). Keterbatasan lainnya
adalah sampel sangat kompleks maka resolusi yang baik sulit
diperoleh.
Teknik HPLC merupakan suatu metode kromatografi cair-cair,
yang dapat digunakan baik untuk keperluan pemisahan maupun
analisis kuantitatif.Analisis kualitatif dengan teknik HPLC didasarkan
pada pengukuran luas area standard .Pada prakteknya, metode
pembandingan area standar dan sampel kurang menghasilkan data
yang akurat bila hanya melibatkan suatu konsentrasi standar.
Tujuan dari percobaan ini yaitu menganalisa suatu sediaan
obat dengan menggunakan kromatografi HPLC. Ada dua metode
yang digunakan yaitu metode standar eksternal dan metode standar
internal econazole.
Pada metode standar eksternal, yaitu pertama Ditimbang 125
mg parasetamol baku lalu dimasukkan dalam labu takar 250 mL.
Diencerkan dengan larutan asam asetat 0,05 M sampai tanda batas.
(larutan stok) kemudian Dibuat seri larutan baku dari larutan stok
dengan deret konsentrasi 0,5, 1,0, 1,5, 2,0 dan 2,5 mg/100 mL.
Dilakukan penetapan kelima larutan standar di atas dengan HPLC
(Timbangan berat 20 tablet parasetamol yang dianalisis, adalah
12,1891 gram). Lalu diambil 150,5 mg serbuk tablet. Dilarutkan
dengan asam asetat 0,05 M dalam labu takar 250 mL, lalu disaring.
Kemudian dipipet 25 mL alikot dan diencerkan dengan asam asetat
0,05 M sampai 100 mL dalam labu takar. Diencerkan lebih lanjut
dengan mempipet 10 mL ke dalam labu takar 100 mL dengan larutan

NURHIDAYA SAFITRI YSRAFIL

150 2014 0025
 APLIKASI KROMATOGRAFI HPLC UNTUK PENETAPAN KADAR
SEDIAAN OBAT

asam asetat 0,05 M sampai tanda batas. Dilakukan penetapan

menggunakan kromatografi HPLC pada kondisi sama pada larutan
baku. Adapun hasilnya diperoleh luas puncak kromatogram = 45.205.
Pada metode standar internal econazole, yaitu pertama Dibuat
larutan stok standar miconazol nitrat dan econazol nitrat (standar
internal) dengan menimbang masing-masing 200,0 mg. Dilarutkan
dengan larutan fase gerak sampai 250 mL dalam labu takar. Lalu
dipipet 25 mL larutan econazol stok standar masukkan kedalam lima
buah labu takar 100 mL. Ditambahkan larutan stok standar miconazol
masing-masing 15 mL, 20 mL, 30 mL, dan 35 mL pada 5 labu.
Diencerkan dengan larutan fase gerak hingga tanda batas. Dilakukan
pengukuran dengan kromatigrafi HPLC. Ditimbang 201,5 mg krim
dilarutkan dengan 25 mL larutan fase gerak dalam corong pisah
sambil dikocok selama 5 menit. Diekstraksi dengan 50 mL heksan dan
lapisan heksan dikeluarkan/dibuang. Dialiri larutan fase gerak dengan
gas nitrogen untuk menghilangkan sisa heksan. Dimasukkan ke dalam
labu takar 100 mL dan diencerkan sampai batas dengan larutan fase
gerak. Disaring larutan dan pipet sebanyak 20 mL untuk dilakukan
pengukuran kromatografi HPLC menggunakan detektor UV pada
panjang gelombang 220 nm. Dihitung persentase kadar miconazol
dalam krim.
Pada kedua percobaan ini diperoleh hasil, yaitu kadar
paracetamol dengan menggunakan metode standar eksternal adalah
84,05% dan kadar krim meconazole dengan metode standar internal
econazole adalah 2500%. Hasil ini tidak sesuai dengan yang tertera
pada farmakope Indonesia yaitu acetaminophen mengandung tidak
kurang dari 98,0% dan tidak lebih dari 101,0%. Dan untuk krim
miconazole mengandung tidak kurang dari 90,0% dan tidak lebih dari
110,0% dari yang tertera pada etiket.

NURHIDAYA SAFITRI YSRAFIL

150 2014 0025
 APLIKASI KROMATOGRAFI HPLC UNTUK PENETAPAN KADAR
SEDIAAN OBAT

BAB 5 PENUTUP
5.1 Kesimpulan
Berdasarkan percobaan yang telah dilakukan maka dapat
disimpulkan bahwa kadar paracetamol dengan menggunakan metode
standar eksternal adalah 84,05% dan kadar krim meconazole dengan
metode standar internal econazole adalah 2500%. Hal ini tidak sesuai
dengan yang tertera pada farmakope Indonesia yaitu acetaminophen
mengandung tidak kurang dari 98,0% dan tidak lebih dari 101,0%.
Dan untuk krim miconazole mengandung tidak kurang dari 90,0% dan
tidak lebih dari 110,0% dari yang tertera pada etiket.
5.2 Saran
Sebaiknya, setiap selesai praktikum diadakan diskusi
perkelompok dengan asisten terkait perhitungan sehingga praktikan
mahir dan praktikum berjalan lancar.

NURHIDAYA SAFITRI YSRAFIL

150 2014 0025
 APLIKASI KROMATOGRAFI HPLC UNTUK PENETAPAN KADAR
SEDIAAN OBAT

DAFTAR PUSTAKA

Dirjen POM., 1979, Farmakope Indonesia Edisi III, Depkes RI: Jakarta.

Ditjen POM., 1995, Farmaope Indonesia Edisi IV, Departemen Kesehatan

RI: Jakarta.

Hendayana, S., 2006, Kimia Pemisahan Metode Kromatografi dan

Elektroforesis Modern, PT. Remaja Rosdakarya, Bandung.

Mulja, M., dan Suharman., 2005, Analisis Instrumental, Airlangga

University Press, Surabaya.

Putra, E.D., 2004, Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Dalam Bidang

Farmasi, Sumatra, Universitas Sumatra Utara.

Rohman, A dan Gandjar, I.G., 2007, Metode Kromatografi untuk Analisis

Makanan, Pustaka Pelajar, Yogyakarta.

Rohman, A., 2009, Kromatografi untuk Analisis Obat, Graha Ilmu,

Yogyakarta.

NURHIDAYA SAFITRI YSRAFIL

150 2014 0025
 APLIKASI KROMATOGRAFI HPLC UNTUK PENETAPAN KADAR
SEDIAAN OBAT

LAMPIRAN
Skema Kerja
1. Penetapan Kadar Tablet Parasetamol dengan Metode Standar
Ekstrenal
Ditimbang 125 mg parasetamol baku

Dimasukkan dalam labu takar 250 mL

Diencerkan dengan larutan asam asetat 0,05 M sampai tanda

batas.

Dibuat seri larutan baku dari larutan stok dengan deret

konsentrasi 0,5, 1,0, 1,5, 2,0 dan 2,5 mg/100 mL.

Dilakukan penetapan kelima larutan standar di atas dengan

HPLC (Timbangan berat 20 tablet parasetamol yang dianalisis,
adalah 12,1891 gram).

Diambil 150,5 mg serbuk tablet

Dilarutkan dengan asam asetat 0,05 M dalam labu takar 250 mL,
lalu disaring

Dipipet 25 mL alikot dan diencerkan dengan asam asetat 0,05 M

sampai 100 mL dalam labu takar.

Diencerkan lebih lanjut dengan mempipet 10 mL ke dalam labu

takar 100 mL dengan larutan asam asetat 0,05 M sampai tanda
batas

NURHIDAYA SAFITRI YSRAFIL

150 2014 0025
 APLIKASI KROMATOGRAFI HPLC UNTUK PENETAPAN KADAR
SEDIAAN OBAT

Dilakukan penetapan menggunakan kromatografi HPLC pada

kondisi sama pada larutan baku. Adapun hasilnya diperoleh luas
puncak kromatogram = 45.205

Ditetapkan tablet parasetamol sesuai persyaratan tablet dalam

Farmakope Indonesia
2. Penetapan Kadar Krim Miconazole dengan Metode Standar
Internal Econazol
Dibuat larutan stok standar miconazol nitrat dan econazol nitrat
(standar internal) dengan menimbang masing-masing 200,0 mg.

Dilarutkan dengan larutan fase gerak sampai 250 mL dalam labu

takar.

Dipipet 25 mL larutan econazol stok standar masukkan kedalam

lima buah labu takar 100 mL.

Ditambahkan larutan stok standar miconazol masing-masing 15

mL, 20 mL, 30 mL, dan 35 mL pada 5 labu

Diencerkan dengan larutan fase gerak hingga tanda batas

Dilakukan pengukuran dengan kromatigrafi HPLC.

Ditimbang 201,5 mg krim dilarutkan dengan 25 mL larutan fase

gerak dalam corong pisah sambil dikocok selama 5 menit.

Diekstraksi dengan 50 mL heksan dan lapisan heksan

dikeluarkan/dibuang.

NURHIDAYA SAFITRI YSRAFIL

150 2014 0025
 APLIKASI KROMATOGRAFI HPLC UNTUK PENETAPAN KADAR
SEDIAAN OBAT

Dialiri larutan fase gerak dengan gas nitrogen untuk

menghilangkan sisa heksan dimasukkan ke dalam
labu takar 100 mL

Diencerkan sampai batas dengan larutan fase gerak.

Disaring larutan dan pipet sebanyak 20 mL untuk dilakukan

pengukuran kromatografi HPLC menggunakan
detektor UV pada panjang gelombang 220 nm

Dihitung persentase kadar miconazol dalam krim

Ditetapkan berdasarkan persyaratan sediaan krim

miconazol yang tertera dalam Farmakope
Indonesia

NURHIDAYA SAFITRI YSRAFIL

150 2014 0025