Anda di halaman 1dari 26

BAB I

PENDAHULUAN
A. Latar Belakang

Genetika adalah ilmu yang mempelajari tentang hereditas (sifat turun


temurun) sifat induk dan variasi sifat karakteristik mikrobia. Hereditas adalah
pengawetan sifat-sifat struktur dan fungsi pada keturunan-keturunan berikutnya.
Perkecualian atau penyimpangan yang terjadi pada keturunan suatu organism
berbeda dalam satu atau beberapa sifat induknya. Penyimpangan-penyimpangan
dan pengawetan sifat-sifat semacam itu dikenal dengan variasi. Variasi dapat
terjadi karena perubahan genetic dan evolusi. Diduga peristiwa perkawinan tidak
terjadi pada bakteri. Mikrobia hanya berkembang biak dengan mekanisme
aseksual melalui peembelahan diri. Maka para ahli menggolongkan mikrobia
bersama-sama dengan algae biru dalam schizophyta.

Kemudian timbul pertanyaan kalau mikrobia berkembang dengan


mekanisme yang monoton seperti di atas maka terbentuk individu seragam tetapi
pada kenyataannya tidak, sehingga terjadi variasi mikroba.Sifat mikroba sangat
bervariasi karena masing-masing mikroba mempunyai kemampuan untuk
beradaptasi terhadap pengaruh lingkungan sekitarnya. Mikroba contohnya bakteri
mempunyai populasi yang berkembang cepat dan beraneka ragam variasinya.
Bakteri untuk memperoleh variasi yang beragam dapat melalui mutasi. Peristiwa
seksual yang semula diduga tidak terjadi, dapat dibuktikan oleh para ahli. Bahkan
perpindahan bahan genetik dapat didemontrasikan dari satu mikroba ke mikroba
lain

B. Rumusan Masalah

1. Bagaimana struktur dan fungsi bahan genetic mikroba ?


2. Bagaimana regulasi ekspresi gen mikroba ?
3. Bagaimana bioteknologi dan DNA rekombinan mikroba ?

C. Tujuan

Agar mahasiswa dapat :

 Menjelaskan tentang struktur dan fungsi bahan genetic mikroba.


 Menjelaskan tentang regulasi ekspresi gen mikroba.
 Menjelaskan tentang bioteknologi dan DNA rekombinan mikroba.

1
BAB II
PEMBAHASAN

A. Struktur dan Fungsi Bahan Genetik

Material genetik bakteri terdiri atas kromosom dan plasmid. Keduanya


terdiri atas DNA. Dua fungsi utama materi genetik adalah replikasi dan ekspresi.
Material genetik harus bereplikasi secara akurat sehingga dihasilkan 2 replikan
(anakan) yang identik dengan induknya. Materi genetik juga terekspresi dalam
bentuk karakter terobservasi atau fenotip.

 Kromosom

Kromosom bakteri mempunyai beratnya 2-3% dari berat kering satu sel,
pada sel haploid (prokariot) bersifat kromosom tunggal dan tidak berpasangan.
Berbentuk sirkuler, panjangnya ± 1mm, beratnya 2-3% dari berat kering satu sel,
disusun sekitar 4 juta kpb DNA, makromolekul yang sangat banyak ini dikemas
agar tidak berubah dalam bentuk superkoil (± 70-130 superkoil domain)
(Syahrurachman, 1994). Kebanyakan gen prokariota terdapat pada kromosom,
yang terletak dalam suatu bagian pusat sitoplasma, yang dinamakan daerah
nuklear atau nukleoid untukn membedakannya dari membran-pengikat nukleus
pada sel eukariotik. Jumlah nukleoid dalam sel bakteri dapat lebih dari satu,
tergantung kecepatan pertumbuhan dan ukuran sel. Nukleoid berisi gen yang
penting untuk pertumbuhan bakteri.

 Plasmid

Plasmid adalah material genetik ektrakromosomal. Ukuran plasmid lebih


kecil daripada kromosom. Plasmid biasanya mengkode polipeptida yang tidak
penting bagi pertumbuhan secara langsung. Plasmid berbentuk sirkuler, tetapi
terdapat plasmid berbentuk linier seperti terlihat pada Borrelia dan Streptomyces.
Plasmid dibedakan menjadi 2, yaitu plasmid konjugatif dan non-konjugatif.
Plasmid konjugatif adalah plasmid yang mampu didonorkan ke resepien,
sedangkan plasmid non-konjugatif tidak dapat didonorkan. Plasmid non-
konjugatif biasanya berukuran kurang dari 7,5 kbp dan biasanya berjumlah
banyak (10-20 perkromosom). Plasmid didistribusikan secara acak ke sel anakan.

Meskipun plasmid tidak berperan langsung dalam pertumbuhan, tetapi


plasmid memiliki fungsi penting secara medis. Fungsi penting plasmid secara
medis, yaitu kemampuan plasmid mengkode polipeptida resistensi antibiotik,
toksin, struktur permukaan sel untuk perlekatan dan kolonisasi. Plasmid yang
berperan dalam resistensi antibiotika disebur plasmid R atau faktor R.

2
STRUKTUR DNA DAN RNA

1. DNA (ASAM DEOKSIRIBONUKLEAT)

DNA/ Kromosom bakteri lebih banyak diteliti dari pada kromosom


organisme lain. DNA bakteri mampu mengkode 1000-3000 polipeptida yang
berbeda-beda. DNA bakteri merupakan molekul berantai ganda yang sirkuler.
Struktur Dna bakteri tidak merupakan bentuk sederhana tetapi merupakan belitan
yang tidak teratur dalam sitoplasma. James Watson dan Francis Crick (1953) telah
menemukan struktur DNA yang berupa dua untai pita DNA terpilin. Penemuan ini
merupakan titik awal revolusi biologi karena merupakan penemuan struktur DNA
ini sangat penting untuk mempelajari dan memahami bagaimana informasi
genetik dapat dipindahkan dari satu generasi ke generasi berikutnya serta
bagaimana DNA dapat mengendalikan replikasinya.

Replikasi informasi herediter di dalam sel melibatkan sintesis molekul


DNA baru yang mempunyai urutan nukleotida sama seperti genom sel inangnya.
Molekul DNA adalah makromolekul yang mempunyai informasi herediter suatu
sel. DNA ini tersusun oleh sub unit-sub unit yang disebut dengan nukleotida atau
deoksiribonukleotida. Urutan nukleotida menentukan kespesifikan suatu informasi
herediter dan berisi mekanisme untuk mengendalikan eksperi genetik.

Masing-masing deoksiribonukleotida terdiri dari basa nitrogen (asam


nukleat), gula deoksiribosa, dan gugus fosfat. Basa asam nukleat terdiri dari basa
purin terdiri : Adenin (A) dan guanin (G) yang mempunyai dua cincin. Dan
pirimidin terdiri atas : timin (T) dan sitosin (C) yang hanya mempunyai satu
cincin. Purin dan pirimidin merupakan molekul heterosiklis karena mengandung
dua macam atom C dan N. Basa asam nukleat menempel pada deoksiribosa
membentuk deoksiribonukleosida. Deoksiribonukleosida ini bergabung dengna
gugus fosfat pada atom C5 membentuk subunit deoksiribonukleotida DNA.

2. RNA (ASAM RIBONUKLEAT)

Asam nukleat lainnya yang dijumpai secara alamiah ialah asam


ribonukleat (RNA). Bedaanya dari DNA ialah :

a. Biasanya berutasan tunggal


b. Komponen gula pada nukloetida yang membentuk RNA adalah ribosa, dan
bukan deoksiribose. Ribose adalah sama dengan deoksiribose kecuali
adanya gugusan hidroksil pada atom karbon nomor 2
c. Basa bernitrogen pirimidin yang dijumpai pada nukleotida yang
membentuk RNA ialah urasil bukan timin.

3
REPLIKASI DNA

Replikasi DNA berarti penggandaan. Ada 3 model replikasi DNA yaitu :

1) Model konservatif.
Model ini menyatakan bahwa 2 rantai DNA bereplikasi tanpa memisahkan
rantai-rantainya.
2) Model semi konservatif.
Model ini menyatakan bahwa 2 rantai DNA berpisah kemudian
bereplikasi.
3) Model dispersi.
Model ini menyatakan bahwa DNA terpecah menjadi potongan-potongan
yang kemudian bereplikasi.

Meselson dan Stahl membuktikan bahwa DNA bereplikasi sesuai model


semi-konservatif.Replikasi model semi konservatif dimulai pada suatu situs
tertentu yang sudah pasti pada kromosom bakteri yang disebut titik pangkal kedua
utas DNA memisah pada situs ini membentuk struktur berbentuk Y. Titik
persimpangannya disebut titik tumbuh.Replikasi bergerak berurutan dari titik
tumbuh, baik pada satu arah atau dua arah.Titik asal dan titik tumbuh terikat pada
membran sel dan situlah kedua utusan tersebut diduplikasikan.Masing-masing
utasan mempunyai urutan basa yang komplementer terhadap urutan basa pada
utasan-utasan DNA yang mula-mula (Pelczar, 2009).

Enzim DNA polymerase nemanbahkan nukleotida pada ujung hidroksil-3'


utasan atau utasan–utasan DNA yang sedang berreplikasi, jadi mensintenis
utasan-utasan DNA dengan arah 5' ke 3'.Sejauh ini belum ditemukan polymerase
yang mereplikasi dengan arah 3' ke 5'.Sintesis DNA bersifat sinambung.Selain
mekanisme replikasi DNA yang baru saja diuraikan, inisiasi (pengawwalan)
replikasi DNA membutuhkan suatu pancing atau pemula yaitu sepotong pendek
RNA yang disentesis oleh RNA polymerase dan komplementer terhadap
DNA.Dengan adanya pemula ini, DNA polymerase dapat mulai mensisntesis
duoksiribonukleotida.Sekali pancingan mengena, DNA polymerase lalu mencerna
RNA tersebut dapat menggantikannya dengan DNA. Berpartisipasinya RNA
sebagai pancing tampaknya ekstensif karena setiap fragmen okazaki juga
mengandung sebagian RNA sebagai pancing (Micheal Pelczar, 2009).

Bila titik-titik tumbuh telah bergerak di seluruh panjang molekul DNA,


maka terbentuk dua molekul DNA yang lengkap.Setiap molekul berutasan ganda
mengandung salah satu dari utasan asli atau satu utasan baru(Micheal Pelczar,
2009).

4
B. Regulasi Ekspresi Gen

EKSPRESI GEN

1. Transkripsi

Transkripsi adalah langkah pertama dalam ekspresi genetis.DNA


ditranskripsi menjadi RNA. Pita DNA yang menjadi cetakan disebut DNA
template. Karena RNA hasil transkripsi membawa “pesan” untuk ditranslasi,
maka RNA tersebut disebut RNA messenger (mRNA). Urutan basa mRNA sama
dengan urutan basa DNA non-template, kecuali timin diganti urasil. Enzim yang
berperan dalam sintesis mRNA adalah enzim RNA polimerase. Urutan DNA yang
ditranskrip dapat terdiri atas 1 gen atau lebih. Transkripsi yang multigen terjadi
pada gen-gen yang terekspresi dalam suatu paket fungsional.

Transkripsi DNA terdiri atas 3 tahap, yaitu inisiasi, pemanjangan, dan


penghentian. Inisiasi melibatkan pengikatan RNA polimerase ke DNA template.
Elongasi adalah proses sintesis mRNA oleh RNA polimerase. Penghentian
meliputi penghentian pemanjangan dan pelepasan mRNA dari DNA template.

2. Translasi

Translasi, yaitu langkah berikut nya didalam ekspresi gan adalah proses
pengarahan sintensis protein oleh informasi genetis yang sekarang ada pad
molekul mRNA.

Bila keempat basa yang berbeda-beda pada nukleotida-nukleodtida mRNA


itu ditata dalam suatu deretan, maka setiap deret yang terdiri dari 3 basa disebut
kodon, mampu menetapakan suatu amino tertentu. Karena ada empat macam basa
yang berbeda-beda, jumlah deret berbasa tiga tersebut yang mungkin terbentuk
adalah 43, atau 64 macam. Triplet-triplet basa ini masing-masing menetapkan
suatu asam amino tertentu, merupakan sandi genetis.Sandi ini mungkin bersifat
universal bagi semua spesies organisme hidup.

Kode Kode kedua Kode


pertama ketiga
U C A G

Fenilalanin Serin Tirosin Sistein U


U Fenilalanin Serin Tirosin Sistein C
Leusin Serin Stop Stop A
Leusin Serin Stop Triptofan G

Leusin Prolin Histidin Arginin U

5
C Leusin Prolin Histidin Arginin C
Leusin Prolin Glutamin Arginin A
Leusin Prolin Glutamin Arginin G

Ileusin Treonin Asparagin Serin U


A Ileusin Treonin Asparagin Serin C
Ileusin Treonin Lisin Arginin A
Metionin Treonin Lisin Arginin G

Valin Alanin Aspartat Glisin U


G Valin Alanin Aspartat Glisin C
Valin Alanin Glutamat Glisin A
Valin Alanin Glutamat Glisin G

Proses ekspresi gen, yaitu proses transformasi informasi genetik melalui


transkripsi dan translasi, untuk pembentukan protein atau enzim. Karena protein
dan enzim sangat berperan dalam menjalankan metabolisme maka ekspresi gen
sebenarnya merupakan proses pengendalian metabolisme oleh gen. Pada modul
ini akan dijelaskan bahwa ekspresi gen atau sintesis protein dapat diatur,
dihidupkan atau dimatikan, sebagaimana layaknya aliran listrik. Enzim
merupakan katalisator yang berperan menjalankan proses reaksi metabolisme,
keberadaan enzim akan menentukan berjalannya proses metabolisme. Bila suatu
produk metabolisme di dalam sel sudah mencapai kuantitas yang mencukupi
maka reaksi metabolisme tersebut harus dihentikan. Proses pengaturan ini
dilakukan dengan cara menghentikan produksi enzim, melalui penghentian
ekspresi gen penyandinya. Mekanisme pengaturan ekspresi gen disebut regulasi
ekspresi gen.

Regulasi pada prokariot

Regulasi ekspresi gen banyak dimengerti melalui mekanisme yang


dipelajari pada bakteri. Sistem regulasi yang pertama dimengerti ialah sistem
regulasi operon laktosa pada bakteri E. coli oleh Jacob dan Monod. Regulasi ini
berperan dalam mengatur produksi enzim β−galaktosidase, ketika bakteri harus
memilih menggunakan laktosa atau glukosa sebagai sumber karbonnya.

Berikut ini akan dijelaskan dua sistem regulasi yang paling umum
dilakukan pada bakteri, yaitu sistem operon laktosa (operon lac) dan sistem
operon triptopan (operon trp). Pada operon lac ekspresi gen diatur pada tingkat
promotor, yaitu mengatur kontak antara promotor dengan enzim transkriptase
(pengendali transkripsi). Pada operon trp ekspresi diatur dengan cara
menghentikan transkripsi bila produk trankripsi, yaitu triptofan, sudah mencapai
kuantitas yang dibutuhkan.

6
1. Sistem Regulasi Operon laktosa

Laktosa adalah gula bisakarida, yaitu gula yang tersusun atas dua molekul
gula sederhana, yaitu glukosa dan galaktosa. Laktosa dapat diuraikan menjadi
glukosa dan galaktosa dengan bantuan enzim β−galaktosidase.

Bakteri E. coli dalam hidupnya dapat memanfaatkan baik laktosa maupun


glukosa tergantung gula mana yang tersedia dilingkungan. Bakteri E. coli
mempunyai kemampuan mensisntesis β−galaktosidase sehingga bila laktosa yang
dimanfaatkan sebagai sumber karbon maka bakteri tersebut akan mampu
mengubah laktosa menjadi glukosa dan galaktosa. Namun bila tersedia laktosa
dan glukosa maka bakteri akan memilih glukosa sebagai sumber karbon, karena
glukosa merupakan gula yang lebih langsung dimanfaat dalam proses
metabolisme.

Kemampuan bakteri untuk memilih laktosa dan glukosa sebagai sumber


karbon telah memunculkan pertanyaan apakah bakteri akan tetap mensintesis
β−galaktosidase seandainya glukosa yang jadi pilihan. Jawabannya ialah bahwa
bakteri mampu mengatur ekspresi gen penyandi β−galaktosidase sesuai dengan
pilihan sumber karbon yaitu laktosa atau glukosa.

Pengaturan ekspresi gen ini disebut sistem regulasi ekspresi gen; dan
sistem ini pertama kali dijelaskan oleh Jacob dan Monod. Sistem regulasi yang
ditemukan oleh mereka sekarang dikenal sebagai sistem regulasi operon laktosa,
Sistem regulasi ini merupakan sitem regulasi pada tingkat inisiasi transkripsi atau
regulasi pada tingkat promotor.

Dalam penjelasannya Jacob dan Monod memperkenalkan istilah operon,


yang mempunyai pengertian sekelompok gen yang diapit secara bersamaan oleh
sepasang promotor dan terminator. Gen-gen pada satu operon akan diekspresikan
secara bersamaan melalui inisiasi transkripsi pada promotor yang sama dan
berakhir pada terminator yang sama. Pada operon laktosa terdapat tiga gen yaitu
lac-Z, lac- Y, dan lac-A, yang masing-masing menyandikan β−galaktosidase,
permease, dan transasetilase. Gen-gen yang berada pada satu operon mempunyai
hubungan fungsi dalam metabolisme.

Pengaturan ekspresi operon laktosa dilakukan oleh suatu protein regulator


yang akan berinteraksi dengan promotor. Protein regulator tersebut akan
menentukan inisiasi translasi yang dilakukan oleh transkriptase. Protein pengatur
dihasilkan oleh gen regulator, yaitu gen yang produk ekspresinya berperan

7
mengatur ekspresi gen lain. Dalam kasus operon laktosa terdapat dua gen
regulator yaitu gen lac-i dan gen crp. Gen lac-i berhubungan dengan kehadiran
laktosa, sedangkan gen crp berhubungan dengan kehadiran glukosa. Gen yang
diatur tersebut dinamakan gen struktural, sebagai contoh gen lac-Z, lac-Y, dan
lac-A pada operon laktosa. Jadi gen regulator berperan mengatur ekspresi gen
struktural.

Gen lac-i akan menghasilkan suatu polipeptida, yang kemudian setiap


empat polipeptida akan membentuk satu molekul protein tetramer yang berperan
sebagai regulator. Dalam proses regulasi protein tetramer ini akan menempel pada
suatu wilayah promotor yang disebut operator. Penempelan itu terjadi karena ada
kecocokan tertentu antara runtunan basa operator dengan protein regulator. Akibat
adanya protein regulator yang menempati wilayah operator maka transkriptase
tidak dapat melakukan inisiasi translasi, sehingga gen-gen yang terdapat di
belakang promotor menjadi tidak terekspresi. Protein regulator seperti di atas
bersifat menghalangi atau menekan terjadinya transkripsi, maka disebut inhibitor.
Lawan sifat dari represor disebut aktivator, yaitu yang bersifat mendorong
terjadinya ekspresi gen.

Kehadiran laktosa pada media tumbuh akan mendorong terjadinya


ekspresi operon laktosa atau terjadi sintesis β−galaktosidase. Berarti kehadiran
laktosa harus mampu melepaskan protein regulator dari promotor agar terjadi
ekspresi gen lac-Z, untuk menghasilkan β−galaktosidase. Dalam sistem regulasi
ini laktosa yang diambil oleh bakteri dapat berinteraksi dengan protein regulator
dan asosiasi yang akan mengubah konfigurasi molekul protein regulator.
Perubahan konfigurasi pada protein represor menyebabkan protein tersebut
menjadi tidak mampu berasosiasi dengan operator. Dengan tidak adanya inhibitor
pada promotor maka transkriptase menjadi tidak terhalang untuk melakukan
inisiasi transkripsi, dan terjadi ekspresi gen-gen pada operon laktosa.

Selain oleh kehadiran laktosa ekspresi operon lac juga diatur oleh
keberadaan glukosa. Bila bakteri telah mengkonversi laktosa menjadi glukosa,
dan bila kuantitas glukosa sudah mencukupi maka β−galaktosidase harus
dihentikan sintesisnya. Regulasi oleh glukosa ini disebut represi katabolit atau
represi glukosa. Proses regulasi ini melibatkan tiga komponen yaitu glukosa,
cAMP (cyclic AMP), dan CAP (protein aktivator/ represor). CAP merupakan
protein yang berperan mengaktifkan enzim transkriptase, protein ini disandikan
oleh gen regulator crp. Asosisasi antara CAP dengan transkriptase menyebabkan
transkriptase menjadi aktif dan mampu mengkatalisis proses transkripsi; tanpa
CAP transkriptase menjadi tidak aktif.

Glukosa mengatur aktivitas CAP melalui pengaturan cAMP. Antara CAP


dan cAMP dapat terbentuk asosiasi, dan asosiasi ini akan menyebabkan CAP aktif
berperan sebagai aktivator; CAP yang terbebas dari cAMP tidak dapat berperan
sebagai aktivator. Kuantitas cAMP berbanding terbalik dengan kuantitas glukosa.
Saat glukosa di dalam sel berjumlah kecil cAMP ditemukan berada dalam jumlah
yang besar, dan bila kuantitas glukosa dalam sel meningkat maka cAMP akan
menurun. Dalam keadaan kuantitas rendah cAMP tidak dapat berasosiasi dengan
CAP, akibatnya CAP tidak dapat menjadi aktivator. Jadi pada saat glukosa rendah

8
cAMP berada dalam jumlah besar dan membentuk asosiasi cAMP-CAP yang
berperan menjadi aktivator enzim transkriptase, sehingga terjadi transkripsi
operon laktosa. Ketika glukosa meningkat sampai jumlah tertentu cAMP menurun
sehingga tidak terbentuk asosiasi cAMP-CAP, dan CAP tidak dapat berperan
sebagai aktivator dan transkripsi operon laktosa tidak berlangsung

Pada kenyataannya regulasi oleh laktosa dan glukosa atau oleh lac-i dan
crp berjalan secara simultan. Protein inhibitor dan aktivator bekerja secara
bersamaan dalam mempengaruhi kerja transkriptase. Pada Tabel diperlihatkan
hasil kombinasi kerja antara kedua gen tersebut. Terlihat bahwa β−galaktosidase
akan disintesis hanya pada kondisi kehadiran laktosa dan tidak ada glukosa.

Laktosa Represor/ Glukosa cAMP cAMP-CAP β-galaktosidase

Lac-i

hadir tidak aktif hadir rendah tidak terbentuk tidak terekspresi

hadir tidak aktif tidak hadir tinggi terbentuk tereskpresi

tidak hadir aktif hadir rendah tidak terbentuk tidak terekspresi

tidak hadir aktif tidak hadir tinggi terbentuk tidak terekspresi

2. Sistem Regulasi Operon trp

Pada operon trp terdapat lima gen struktural yaitu trp-E, trp-D. trp-C, trp-
B, dan trp-A, dan satu gen pengawal yaitu trp-L yang berfungsi dalam regulasi.
Gen trp-E sampai trp-A keseluruhannya menyandikan enzim yang berperan
dalam satu lintasan metabolisme triptofan. Trp-L merupakan gen yang paling
dekat pada promotor.

Regulasi ekspresi operon trp berbeda dengan regulasi operon lac; pada
operon lac regulasi dilakukan pada tingkat inisiasi atau pada tingkat promotor,
sedangkan regulasi operon trp berlangsung pada tingkat RNA hasil transkripsi.
Pada operon trp satu gen pengawal (trp-L) yang terletak tepat di belakang
promotor, berfungsi sebagai regulator. Inisiasi transkripsi, pada promotor, akan
berjalan tanpa hambatan dan transkriptase masuk ke ruas trp-L.

Regulasi berlangsung pada saat enzim transkriptase berada pada ruas trp-
L, yang akan menentukan apakah transkripsi akan berhenti pada trp-L atau
dilanjutkan ke ruas gen yang ada di belakangnya (trp-E sampai trp-A).

Dalam keadaan sel kekurangan triptofan dengan adanya ekspresi gen-gen


pada operon trp maka akan terjadi peningkatan kuantitas triptofan dalam sel.
Kuantitas tiptofan dalam sel akan mengendalikan ekspresi gen-gen pada operon
ini, yaitu pada konsentrasi tertentu triptofan akan menghentikan ekspresi gen-gen

9
tersebut. Regulasi oleh triptofan berhubungan dengan ruas trp-L. Pada ruas trp-L
terdapat dua kodon yang berhubungan dengan asam amino triptofan yaitu kodon
yang terletak pada basa 54 sampai 59. Saat transkripsi sedang berjalan pada ruas
gen trp-L, RNA yang dihasilkan transkripsi tersebut juga mulai dibaca oleh
ribosom atau ditranslasikan. Ribosom akan berjalan membaca kodon-kodon yang
terdapat RNA tersebut dan merangkaikan berbagai asam amino yang sesuai.
Pergerakan ribosom akan berjalan lancar selama tersedia amino-asil-tRNA yang
cocok dengan kodon yang dibaca ribosom tersebut. Pada saat kuantitas triptofan
dalam sel belum mencukupi tidak akan terbentuk triptofal-tRNA (amino-asil-
tRNA untuk triptofan), sehingga ketika ribosom mencapai kodon trp, basa 54
sampai basa 59, tidak akan ada tRNA yang berasosisasi pada ribosom, dan
ribosom akan berhenti pada kodon tersebut. Ketika jumlah triptofan sudah
mencukupi maka akan terbentuk triptofal-tRNA dan ribosom dapat membaca
kedua kodon trp tersebut (basa 54 sampai basa 59) dan melanjutkan translasi
kodon-kodon selanjutnya. Kejadian berhenti atau berjalannya ribosom pada kodon
trp akan menentukan apakah proses transkripsi operon trp akan berjalan masuk ke
gen trp-E atau berhenti pada ruas gen trp-L.

Ruas gen pengawal trp-L terbagi atas 4 ruas. Keempat ruas tersebut
homolog satu dengan yang lainnya, sehingga ruas-ruas RNA yang
ditranskripsikannya dapat membentuk pasangan satu sama lain. Ruas-2 dapat
berpasangan dengan ruas-1 dan ruas-3, sedangkan ruas-3 selain berpasangan
dengan ruas-2 juga dapat berpasangan dengan ruas-4. Ruas-3 dan ruas-4
merupakan bentuk dari terminator dari gen trp-L, sehingga bila pada RNA kedua
ruas ini berpasangan (pasangan 3-4) maka akan terbentuk struktur jepit rambut,
yang merupakan signal akhir transkripsi, yang akan berakibat transkripsi berhenti.
Regulasi pada tingkat RNA berlangsung melalui pengaturan pembentukan
pasangan 3-4 (struktur jepit rambut terminator). Terjadinya perpasangan 3-4 dapat
dicegah seandainya ruas-3 berpasangan dengan ruas-2.

Telah dijelaskan pada alinea terdahulu bahwa keberadaan ribosom pada


basa 54-59 (pada trp-L) akan menentukan apakah transkripsi operon trp akan
berhenti pada ruas trp-L atau berlanjut ke trp-E. Bila kuantitas triptofan di dalam
sel belum mencukupi maka tidak akan terbentuk triptofal-tRNA, sehingga
ribosom akan berhenti pada basa 54-59, ruas-2 akan terbebas dari ribosom
sehingga dapat berpasangan dengan ruas-3 (pasangan 2-3). Pada kondisi ini tidak
akan terbentuk pasangan 3.4 atau struktur jepit rambut terminator, sehingga
transkripsi tidak berhenti pada ujung trp-L; melainkan terus dilanjutkan ke ruas
gen trp-E dan seterusnya. Bila triftofan dalam sel telah mencukupi maka ribosom
tidak akan berhenti pada basa 54-59, karena akan tersedia triptofal-tRNA;
ribosom akan bergerak masuk ke ruas-2.

Akibat kehadiran ribosom pada ruas-2 maka ruas-3 terbebas dari


perpasangan dengan ruas-3, dan akan berpasangan dengan ruas-4 membentuk
pasangan 3-4 atau struktur jepit rambut. Dalam kondisi ini maka transkripsi akan
berakhir pada ujung trp-L, sehingga ruas trp-E dan yang lainnya tidak akan
tertranskripsikan.

10
MUTASI

Mutasi adalah perubahan spontan pada gen suatu makhluk hidup/bakteri.


Sebagai contoh yang sederhana adalah adanya koloni bakteri Serratia marcescens
yang berwarna putih diantara koloni yang berwarna merah. Jika koloni putih
tersebut diisolasi dan kemudian diteliti sifat-sifatnya serta dibandingkan dengan
bakteri dari koloni merah, maka sifat-sifat selain pigmentasinya sama. Bakteri dari
koloni putih tersebut dikatakan mutan kadang-kadang mutan putih tersebut dapat
kembali menjadi merah. Peristiwa ini dinamakan mutasi balik

Perubahan-perubahan karena mutasi dapat dibedakan dengan modifikasi


(perubahan tidak menurun) yang disebabkan karena faktor lingkungan. Dalam hal
modifikasi semua sel akan mengalami perubahan fenotif, sedangkan pada mutasi
hanya sebgian kecil dari populasi. Ada dua macam mutasi yaitu mutasi selektif
dan mutasi tidak selektif Mutasi selektif ialah mutasi yang menguntungkan bagi
kelangsungan hidup bakteri tersebut. Mutasi ini terjadi pada keadaan lingkungan
tertentu misalnya adanya antibiotika.Mutan tersebut dapat tumbuh dengan adanya
antibiotika dalam dosis tertentu yang dapat menghambat dan membunuh sel
induknya.Mutasi ini dinamakan juga mutasi buatan.Mutasi tidak selektif ialah
mutasi yang tidak mempunyai sifat yang lebih menguntungkan atau merugikan
dibandingkan dengan pertumbuhan sel induknya.Mutasi ini disebut juga mutasi
alami, tanpa campur tangan manusia.

Mekanisme terjadinya mutasi (mutagenesis).Sel yang mengalami mutasi


(mutan) mengalami perubahan urutan nukleotida dari DNA nya.Bagian DNA
yang mengalami perubahan tersebut dinamakan muton. Perubahan ini akan
mempengaruhi sebagian dari aktivitas sel, misalnya susunan asam amino dari
polipeptida/ protein. Ditinjau dari perubahan nukleotida atau basa DNA maka
dapat dikenal macam-macam perubahannya, yaitu mutasi titik. Pertukaran,
pengurangan, pengisian, pembalikan

Mutasi titik adalah mutasi yang disebabkan perubahan-perubahan atau


pengurangan satu basa DNA saja.Misalnya adenin diganti dengan guanin atau
timin diganti dengan sitosis.Pengaruh dari perubahan tersebut tergantung dari
letak basa DNA pada gen. Perubahan tersebut dapat tidak dipengaruhi produksi
protein atau mempengaruhi urutan asam amino dari protein atau tidak
menghasilkan protein tertentu. Jika perubahan basa DNA tidak mempengaruhi
produksi protein atau gejala fenotif lain maka mutasi inya dinamakan mutasi bisu.
Mutasi ini kemungkinan karena perubahan kodon yang terjadi tetap mengkode
asam amino yang samaProses pertukaran, pengurangan, penambahan dan
pembalikan dapat berlangsung secara sederhana artinya meliputi satu atau
beberapa basa DNA saja atau mencakup beratu-ratus DNA.Mutagenesis dapat
terjadi karena adanya senyawa mutagen, sinat ultra violet, cat akredin dan
sebagianya.

11
Ada beberapa macam mekanisme mutasi yaitu:

1. Mutasi Spontan
Mutasi spontan dapt terjadi setiap 108-109 pasangan DNA dan diperoleh
satu mutan. Mutasi ini disebabkan karena terjadi kerusakan fisik pada
DNA, terjadi perpindahan posisi DNA , kesalahan oleh enzim pada waktu
terjadi replikasi. Sehingga urutan DNA, maupum pasangan basa berubah
atau berbeda bentuk yaitu dari bentuk amino menjadi imine, yang disebut
tautomer.

2. Mutagenesis dengan basa analog


Basa analog adalah senyawa yang mirip dengan basa pada DNA, tetapi
susunannya berdeda.

3. Mutagenesisi kimia
Senyawa mutagen adalah agenesia yang mampu meningkatkan frekuensi
mutasi.Karena senyawa mutagen bereaksi dengan satu basa atau lebih basa
DNA.Senyawa mutagen dapat berupa asam nitrit, hidroksilamin, etil,
sulfonat, dan lain-lain.

4. Mutagenesisi karena perubahan pola pembacaan (reading frame shiff)


Akredin merupakan cat yang dapat menyebabkan terjadinya mutasi karena
senyawa akredin mempunyai bentuk sama dengan basa DNA, sehingga
molekul ini dapat disisipkan diantara dua pasangan basa DNA dan
menghilangkan sebagian basa, lalu akan terjadi pola pembacaan.

5. Mutagenesis karena radiasi


Mikrobia bila ditumbuhkan dalam kondisi alam dan terkena sinar ultra
violet dapat menyebabkan perubahan DNA, sehingga menimbulkan mutasi

C. Bioteknologi dan DNA Rekombinan

Dengan telah ditemukannya DNA sebagai bahan gen, manusiapun


berupaya untuk mendapatkan kombinasi sifat -sifat baru suatu mahluk hidup
dengan cara melakukan perubahan langsung pada DNA genomnya. Usaha
untuk mengubah DNA genom secara langsung ini disebut dengan istilah
Rekayasa Genetika atau Genetic Engineering. Dalam upaya melakukan
rekayasa genetika, manusia menggunakan teknologi DNA rekombinan.

Apakah Teknologi DNA Rekombinan itu ?

Teknologi DNA Rekombinan merupakan kumpulan teknik atau


metoda yang digunakan untuk mengkombinasikan gen-gen di dalam tabung
reaksi.

12
Teknik-teknik tersebut meliputi:

- Teknik untuk mengisolasi DNA.

- Teknik untuk memotong DNA.

- Teknik untuk menggabung atau menyambung DNA.

- Teknik untuk memasukkan DNA ke dalam sel hidup.

Kumpulan teknik -teknik atau metoda-metoda yang telah


dikembangkan oleh para ilmuwan telah mungkinkan bagi kita untuk:
mengisolasi DNA dari berbagai organisme, menggabungkan DNA yang
berasal dari organisme yang berbeda sehingga terbentuk kombinasi DNA
(DNA rekombinan), memasukkan DNA rekombinan ke dalam sel organisme
prokariot maupun eukariot hingga DNA rekombinan tersebut dapat berepilkasi
dan bahkan dapat diekspresikan.

Teknologi DNA Rekombinan telah memberikan banyak manfaat bagi


perkembangan ilmu pengetahuan maupun bagi kehidupam manusia sehari-
hari. Beberapa jenis obat-obatan, vaksin, bahan pangan, bahan pakaian dan
lainnya telah diproduksi dengan memanfaatkan teknologi DNA Rekombinan.

Dalam kehidupan kita sehari-hari, secara langsung maupun tidak


langsung, sebagian dari kita pernah berhubungan dengan hasil penggunaan
teknologi DNA Rekombinan. Contoh: insulin telah digunakan untuk
mengobati penyakit diabetes. Penyakit diabetes pada manusia diobati dengan
insulin manusia. Bagaimanakah kita dapat memperoleh insulin manusia ini?

Apakah untuk mengobati orang yang sakit diabetes ini kita harus
mengorbankan orang yang sehat untuk diekstrak insulinnya?. Tentu saja tidak.
Saat ini insulin manusia telah berhasil diproduksi secara masal dengan
menggunakan bakteri. Kemampuan bakteri untuk memproduksi insulin
manusia ini adalah karena manusia telah berhasil memasukkan dan
mengintegrasikan gen yang menyandikan insulin manusia kedalam genom
bakteri.

Contoh lainnya adalah kapas transgenik. Kapas transgenik pernah


ramai dibicarakan di media masa kita pada awal abad 21 ini. Salah satu kapas
transgenik adalah kapas-bt. Tanaman kapas- bt telah mengandung gen
penyandi toksin yang berasal dari bakteri Bacillus turingiensis (Bt). Toksin
tersebut dapat membunuh hama kapas sehingga kapas-bt tersebut tahan
terhadap serangan hama. Tanaman kapas ini tahan terhadap serangan hama
(ulat) karena tanaman ini menghasilkan toksin yang dapat membunuh
hamanya (ulat) . Toksin tersebut disandikan oleh gen yang berasal dari bakteri
Bacillus turingiensis

13
Genom tanaman kapas ini mengandung gen yang berasal dari bakteri
Bacillus turingiensis. Oleh karena itu, tanaman kapas ini seringkali disebut
sebagai kapas-Bt (Bt = Bacillus turingiensis). Kapas-bt merupakan salah satu
contoh organisme transgenik. Organisme transgenik adalah organisme yang
mengandung gen yang berasal dari jenis organisme lainnya. Oleh karena
tanaman kapas ini mengandung gen yang asalnya dari organisme lainnya,
maka kapas ini secara umum disebut tanaman kapas transgenik.

Bakteri penghasil insulin dan tanaman kapas-bt tersebut merupakan


sebagian dari hasil rekayasa yang dilakukan manusia terhadap makhluk hidup
dengan menggunakan teknologi DNA rekombinan.

Teknologi DNA rekombinan berdasarkan pada mekanisme yang


terdapat pada bakteri. Hasil Percobaan Lederberg dan Tatum (1946)
menunjukkan bahwa bakteri mempunyai mekanisme seksual. Mekanisme
seksual pada bakteri ini menyebabkan terbentuknya kombinasi gen-gen yang
berasal dari dua sel yang berbeda. Mekanisme seksual pada bakteri ini
merupakan pertukaran DNA atau gen dari satu sel ke sel lainnya. Jadi
mekanisme seksual pada bakteri ini tidak bersifat reproduktif (tidak
menghasilkan anak atau zuriat).

Transfer DNA atau perpindahan DNA ke dalam bakteri dapat melalui


tiga cara yaitu konjugasi, transformasi, dan transduksi. DNA yang masuk ke
dalam sel bakteri selanjutnya dapat berintegrasi dengan DNA atau kromosom
bakteri sehingga terbentuk kromosom rekombinan.

Konjugasi merupakan perpindahan DNA dari satu sel (sel donor) ke


dalam sel bakteri lainnya (sel resipien) melalui kontak fisik antara kedua sel.
Sel donor (sel jantan) memasukkan sebagian DNA-nya ke dalam sel resipien
(sel betina). Transfer DNA ini melalui pili seks yang dimiliki oleh sel jantan.
Sel betina tidak memiliki pili seks. DNA dari sel jantan berpindah ke dalam
sel betina secara replikatif. Oleh karena itu, setelah proses konjugasi selesai,
sel jantan tidak kehilangan DNA. Setelah konjugasi selesai kedua sel berpisah
kembali dan jumlah sel tidak bertambah (setelah konjugasi tidak dihasilkan
anak sel). Oleh karena itu, proses konjugasi ini disebut juga sebagai proses
atau mekanisme seksual yang tidak reproduktif.

Transformasi merupakan pengambilan DNA oleh bakteri dari


lingkungan di sekelilingnya. DNA yang berada di sekitar bakteri (DNA asing)
dapat berupa potongan DNA atau fragmen DNA yang berasal dari sel bakteri
lainnya atau dari organisme lainnya. Masuknya DNA dari lingkungan ke
dalam sel bakteri ini dapat terjadi secara alami. Fenomena transformasi ini
telah diamati oleh Griffith (1928) dan kelompok Avery (1944). Griffith (1928)
telah menemukan bahwa strain bakteri yang tidak virulen (strain yang
penampilan koloninya kasar) dapat berubah sifatnya menjadi strain yang
virulen (penampilan koloninya halus). Perubahan sifat ini disebabkan karena
strain yang tidak virulen (strain kasar) dicampur dengan sel-sel bakteri strain
virulen (strain halus) yang telah dimatikan.

14
Avery, McCleod, dan McCarty (1944) menemukan bahwa perubahan
sifat atau transformasi dari bakteri kasar menjadi menjadi bakteri halus atau
perubahan dari tidak virulen menjadi virulen tersebut disebabkan oleh adanya
DNA dari sel bakteri halus yang masuk ke dalam sel bakteri kasar.
Berdasarkan pada mekanisme transformasi alami ini, kita dapat melakukan
transformasi bakteri secara buatan. Dengan perlakuan tertentu, kita dapat
memasukkan potongan DNA ke dalam sel bakteri. Prinsipnya sederhana yaitu
mencampurkan sel-sel bakteri hidup dengan potongan DNA tertentu di dalam
tabung reaksi. Beberapa waktu kemudian kita dapat menyeleksi sel-sel bakteri
yang sudah mengandung potongan DNA tertentu tersebut.

Transduksi adalah cara pemindahan DNA dari satu sel ke dalam sel
lainnya melalui perantaraan fage. Beberapa jenis virus berkembang biak di
dalam sel bakteri. Virus-virus yang inangnya adalah bakteri seringkali disebut
bakteriofage atau fage. Pada waktu fage menginfeksi bakteri, fage
memasukkan DNA-nya ke dalam bakteri. DNA fage ini kemudian bereplikasi
di dalam sel bakteri atau berintegrasi dengan kromosom bakteri (ingat siklus
hidup fage: siklus litik dan siklus lisogenik). Pada waktu DNA fage dikemas
di dalam pembungkusnya untuk membentuk partikel fage-fage baru, DNA
fage tersebut dapat membawa sebagian dari DNA bakteri yang telah menjadi
inangnya. Selanjutnya bila fage menginfeksi bakteri lainnya, maka fage akan
memasukkan DNA-nya yang mengandung sebagian dari DNA bakteri
inangnya yang sebelumnya. Dengan demikian, fage tidak hanya memasukkan
DNA-nya sendiri kedalam sel bakteri yang diserangnya tetapi juga
memasukkan DNA dari sel bakteri lainnya yang ikut terbawa pada DNA fage.
Jadi, secara alami fage memindahkan DNA dari satu sel bakteri ke sel bakteri
lainnya.

Perangkat yang digunakan dalam teknologi DNA rekombinan adalah


perangkat-perangkat yang ada pada bakteri. Perangkat tersebut antara lain
adalah: enzim restriksi, enzim DNA ligase, plasmid, transposon, pustaka
genom, enzim transkripsi balik, pelacak DNA/RNA.

Enzim restriksi digunakan untuk memotong DNA. Pada tahun 1960,


Werner Arber & Hamilton Smith menemukan enzim dari mikroba yang dapat
memotong DNA utas ganda. Enzim tersebut sekarang dikenal dengan nama
enzim restriksi atau endonuklease restriksi. Enzim tersebut mengenal dan
memotong DNA pada sekuens spesifik yang panjangnya 4 sampai dengan 6
pasang basa. Enzim tersebut sekarang dikenal dengan nama enzim restriksi
atau enzim endonuklease restriksi. Secara alami, bakteri menghasilkan enzim
restriksi untuk menghancurkan DNA fage yang menginfeksinya (yang masuk
ke dalam sel bakteri). Sampai saat ini sudah banyak jenis enzim restriksi yang
telah ditemukan dan diisolasi dari berbagai spesies bakteri. Nama setiap enzim
restriksi diawali dengan tiga huruf yang menyatakan nama bakteri yang
menghasilkan enzim tersebut. Setiap enzim restriksi mengenal sekuens dan
situs pemotongan yang khas. Enzim restriksi memotong DNA bukan pada
sembarang tempat, tetapi memotong DNA pada bagian tertentu. Bagian pada

15
DNA yang dikenai aksi pemotongan oleh enzim restriksi ini dinamakan
sekuens pengenal. Suatu sekuens pengenal adalah urutan nukleotida (urutan
basa) tertentu yang dikenal oleh enzim restriksi sebagai tempat atau bagian
yang akan dipotongnya. Salah satu contoh enzim restriksi ini adalah enzim
Eco RI yang telah diisolasi pertama kali oleh Herbert Boyer pada tahun 1969
dari bakteri Escherichia coli. Enzim EcoRI memotong DNA pada bagian yang
urutan basanya adalah GAATTC (sekuens pengenal bagi EcoRI adalah
GAATTC). Di dalam sekuens pengenal tersebut, enzim EcoRI memotongnya
tidak pada sembarang situs tetapi hanya memotong pada bagian atau situs
antara G dan A. Pada DNA utas ganda, sekuens GAATTC ini akan
berpasangan dengan sekuens yang sama tetapi berlawanan arah. Enzim EcoRI
ini memotong setiap utas dari utas ganda tersebut pada bagian antara G dan A.
Sebagai akibatnya, potongan-potongan atau fragmen-fragmen DNA utas
ganda yang dihasilkan akan memiliki ujung berutas tunggal. Ujung seperi ini
yang dikenal dengan istilah sticky ends atau cohesive ends.

Enzim DNA ligase digunakan untuk menyambung DNA. Pada tahun


1972, David Jackson, Robert Simon, dan Paul Berg melaporkan bahwa
mereka berhasil membuat molekul DNA rekombinan. Mereka berhasil
menggabungkan fragmen-fragmen DNA dengan cara memasangkan (anneal)
ujung sticky ends dari satu fragmen dengan ujung sticky ends fragmen lainnya,
kemudian menyambungkan kedua ujung fragmen-fragmen tersebut secara
kovalen dengan menggunakan enzim DNA ligase. Keberhasilan membuat
DNA rekombinan ini terjadi tidak lama setelah enzim restriksi ditemukan dan
diisolasi pertama kali dari E.coli oleh Herbert Boyer yaitu pada tahun 1969 .

Plasmid digunakan sebagai vektor untuk mengklonkan gen atau


mengklonkan fragmen DNA atau mengubah sifat bakteri. Pada umumnya
bakteri mempunyai satu kromosom. Kromosom bakteri berupa DNA sirkular
atau DNA yang berbentuk lingkaran. Disamping memiliki satu kromosom,
berbagai jenis bakteri juga memiliki DNA sirkular lainnya yang ukurannya
jauh lebih kecil dari pada DNA kromosomnya. DNA sirkuler selain
kromosom yang terdapat pada bakteri dinamakan plasmid. Jadi, plasmid
merupakan DNA bakteri yang terpisah dari kromosom bakteri. Plasmid dapat
bereplikasi sendiri. Plasmid juga mengandung berbagai gen. Jenis, jumlah
jenis, dan jumlah tiap jenis (copy) plasmid bervariasi antar sel. Bahkan antar
sel dalam satu spesies bakteri.

Plasmid mulai digunakan sebagai vektor untuk mengklonkan gen tidak


lama setelah David Jackson, Robert Simon, dan Paul Berg berhasil membuat
molekul DNA rekombinan itu pada tahun 1972. Dalam hal ini, plasmid
digunakan sebagai pembawa fragmen DNA asing. Dengan kata lain, plasmid
dikombinasikan dengan DNA asing. Plasmid rekombinan yang pertama kali
berhasil bereplikasi di dalam sel bakteri adalah plasmid pSC101 yang telah
dikonstruksi oleh Stanley Cohen dan Herbert Boyer (SC=Stanley Cohen).

Salah satu contoh plasmid yang telah lama digunakan sebagai vektor
untuk mengklon gen adalah plasmid pBR322. Plasmid pBR322 ini
mengandung gen penyandi resistensi terhadap ampisilin dan tetrasiklin. Pada

16
gambar disamping ditujukkan adanya berbagai situs yang dapat dipotong oleh
enzim restriksi.

Adanya gen resistensi terhadap antibiotik yang didalamnya


mengandung situs enzim restriksi akan memberikan kemudahan dalam
menyeleksi plamid rekombinan atau memudahkan dalam menyeleksi klon
bakteri yang telah membawa plasmid rekombinan. Akan lebih memudahkan
lagi dengan adanya enzim yang hanya memotong pada bagian gen resistensi
terhadap antibiotik. Misalnya, enzim PstI yang hanya akan memotong
pBR322 pada bagian gen resistensi terhadap ampisilin (gen ApR).

Dari beberapa perangkat diatas (enzim restriksi, enzim DNA ligase,


dan plasmid), telah memungkinkan bagi kita untuk mengklonkan gen atau
fragmen DNA. Dalam hal ini, kita dapat membuat plasmid rekombinan
(plasmid yang mengandung fragmen DNA asing) di dalam tabung reaksi. Bila
dikombinasikan dengan salah satu cara bakteri memindahkan DNA, yaitu
transformasi, kita dapat memasukkan plasmid rekombinan tersebut ke dalam
sel bakteri.

Tahapan dalam mengklonkan gen meliputi: pemotongan plasmid,


menyisipkan gen atau fragmen DNA, memasukkan DNA kedalam sel bakteri
(trasformasi), seleksi klon bakteri yang benar yaitu bakteri yang mengandung
plasmid rekombinan.

 Pemotongan plasmid. Plasmid pBR322 dipotong di dalam tabung


reaksi menggunakan enzim restriksi PstI maka pBR322 akan terpotong
atau terbuka pada bagian gen ApR.

 Menyisipkan gen atau fragmen DNA. Bila pBR322 yang sudah


terbuka lingkarannya dicampur dengan potongan DNA asing dan
kemudian ditambahkan enzim DNA ligase, maka kemungkinan
hasilnya adalah berupa campuran yang berisi:

1) plasmid pBR322 yang tersambung kembali atau membentuk


lingkaran lagi seperti semula,

2) plasmid rekombinan yaitu pBR322 yang telah disisipi oleh


DNA asing.

 Memasukkan DNA kedalam sel bakteri (trasformasi). Campuran


kedua bentuk plasmid ini kemudian dicampurkan dengan kumpulan
sel-sel bakteri hidup yang tidak mempunyai plasmid.

17
Kemungkinan hasilnya berupa campuran yang berisi:

1) sel bakteri yang mendapatkan plasmid pBR322 tanpa sisipan,

2) sel yang mendapatkan plasmid rekombinan (pBR322 yang


telah disisipi DNA asing),

3) sel bakteri yang tidak mengandung (tidak dimasuki) plasmid.

 Seleksi klon bakteri yang benar yaitu bakteri yang mengandung


plasmid rekombinan. Dalam contoh ini, seleksi dilakukan dengan
menggunakan media tumbuh bakteri yang mengandung antibiotik. Sel
yang yang tidak mengandung pasmid tidak akan tumbuh pada media
yang mengandung ampisilin maupun tetrasiklin. Sel bakteri yang
mengandung plasmid tanpa sisipan (pBR322 semula) tumbuh pada
media yang mengandung tetrasiklin maupun ampisilin. Sel bakteri
yang mengandung plasmid rekombinan tumbuh pada media yang
mengandung tetrasiklin tetapi tidak tumbuh pada media yang
mengandung ampisilin karena gen ApR disisipi DNA asing sehingga
sehingga tidak berfungsi. Dalam teknis pelaksanaannya, cairan
suspensi dalam pekerjaan transformasi (campuran antara bakteri,
plasmid, dan DNA asing yang telah diperlakukan dalam rangka
transformasi) disebarkan pada media yang mengandung tetasiklin.
Koloni bakteri yang tumbuh adalah koloni Sel1 dan koloni Sel2
(koloni adalah kumpulan sel yang sama yang semula berasal dari satu
sel) . Sel bakteri yang tidak mengandung plasmid tidak mampu
tumbuh. Masing-masing koloni yang tumbuh pada media+tetrasiklin
kemudian dipindahkan pada media+ampisilin. Koloni yang tidak
tumbuh pada media+ampisilin adalah koloni yang diinginkan (sel-sel
bakterinya mengandung plasmid rekombinan).

Contoh plasmid lainnya yang telah lama digunakan sebagai vektor


untuk mengklonkan gen adalah plasmid pUC118 dan pUC119. Plasmid ini
merupakan pengembangan dari pBR322. Plasmid pUC118 dan pUC119
mengandung gen lacZ yang menyandikan enzim b-galactosidase. Pada lacZ
terdapat daerah yang disebut daerah polikloning.

Pada daerah polikloning ini terdapat banyak situs restriksi dari


berbagai enzim restriksi. Dalam hal ini, kita dapat menggunakan berbagai
enzim restriksi untuk memotong pUC118 atau pUC119 pada bagian lacZ.

Dengan demikian kita dapat menyisipkan DNA asing pada bagian


lacZ. Bila gen lacZ disisipi oleh DNA asing maka gen lacZ tersebut tidak
berfungsi (tidak menghasilkan β-galactosidase). Bila kita menggunakan
pUC188 atau pUC119 sebagai plasmid vektor, maka koloni yang membawa
plasmid rekombinan dapat dideteksi dengan menggunakan Xgal (5-bromo-4-

18
chloro-indolyl-β-D-galactosida). Enzim β-galactosidase akan memecah Xgal
menjadi galatosa dan 5-bromo-4-chloroindigo berwarna biru.

Koloni bakteri yang mengandung plasmid pUC118 atau pUC119 akan


berwarna biru bila ditumbuhkan pada media yang mengandung Xgal. Hal ini
karena l bakteri menghasilkan enzim β-galactosidase. Oleh karena medianya
mengandung Xgal maka enzim β-galactosidase memecahkan Xgal sehingga
dihasilkan 5-bromo-4-chloroindigo yang berwarna biru.

Koloni bakteri akan berwarna putih bila pUC118 atau pUC119 telah
disisipi DNA asing pada bagian lacZ. Dalam hal ini sel bakteri tidak
menghasilkan enzim β-galactosidase karena gen lacZ. Gen lacZ tidak
berfungsi karena disisipi oleh DNA asing.

Transposon digunakan sebagai alat untuk melakukan mutagenesis dan


untuk menyisipkan penanda. Keberhasilan para ahli dalam melakukan
rekayasa genetika terhadap berbagai organisme tidak lepas dari peranan
transposon. Transposon atau elemen loncat mula-mula ditemukan oleh
Barbara McClintock. Untuk sampai pada penemuan tentang adanya
transposon, Barbara McClintock mempelajari penyebab terjadinya variasi
warna biji jagung. Seperti yang pernah anda pelajari sebelumnya bahwa biji
jagung terbentuk sebagai hasil dari pembuahan ganda (dua pembuahan). Satu
pembuahan menghasilkan zigot yang kemudian berkembang menjadi embrio
yang tersimpan dalam biji jagung. Satu pembuahan lainnya menghasilkan
endosperma. Endosperma inilah yang kita lihat penampilannya (yang nampak
sebagai biji jagung). Endosperma ini merupakan bagian terbesar dari biji dan
merupakan bagian penyimpan makanan. Endosperma inilah yang kita gunakan
kandungan karbohidratnya untuk makanan kita maupun makanan ternak.

Oleh karena endosperma ini awalnya berasal dari satu sel (sel triploid
yang merupakan hasil peleburan antara satu initi sel sperma dengan dua inti
sel kutub) yang kemudian membelah secara mitosis. Oleh karena itu
seharusnya endosperma tersebut merupakan kumpulan sel yang sama sifatnya.
Bila kumpulan sel endosperma warnanya sama maka setiap titik pada
permukaan setiap biji jagung itu warnanya sama atau seragam. Bila berwarna
putih, maka seluruh permukaan biji jagung (endospermanya) berwarna putih.
Atau bila kuning, maka seluruh permukaan biji jagung (endospermanya)
berwarna kuning. Oleh karena itu, anda apat menemukan di pasar atau di
penjual sayur keliling, jagung yang setiap bijinya berwarna kuning atau putih.

Barbara McClintock mempelajari mengapa ada biji jagung yang


warnanya tidak seragam sehingga nampak kuning dengan bercak-bercak
coklat. Pola bercaknya tidak teratur. Biji yang satu dengan biji lainnya juga
berbeda pola bercaknya. Dengan melakukan persilangan-persilangan antar
tanaman jagung yang berbeda warna bijinya, akhirnya Barbara McClintock
menemukan bahwa ketidak-seragaman atau variasi warna biji jagung
disebabkan oleh adanya bagian dari kromosom yang berpindah-pindah.
Bagian dari kromosom tersebut pindah dari satu tempat ke tempat lain pada
kromosom yang sama atau pindah dari satu kromosom ke kromosom lainnya.

19
Bagian dari kromosom yang dapat berpindah tempat tersebut dinamakan
transposon.

Jadi, transposon adalah DNA yang dengan sendirinya dapat berpindah-


pindah tempat atau berpindah posisinya. Transposon dapat berpindah-pindah
tempatnya pada satu molekul DNA atau pada satu krosom. Transposon juga
dapat pindah dari satu molekul DNA ke molekul DNA lainnya atau pindah
dari satu kromosom ke kromosom lainnya. Karena memiliki kemampuan
untuk berpindah tempat dengan sendirinya maka sering kali transposon
disebut juga dengan nama elemen loncat.

Transposon dapat ditemukan pada berbagai jenis tanaman, cendawan,


dan bakteri. Jenis transposon bermacam-macam berdasarkan ukuran atau
panjangnya, gen-gen yang dikandungnya, dan cara berpindahnya. Transposon
yang paling sederhana hanya mengandung gen penyandi enzim tranposom
(transposase). Enzim transposon ini dibutuhkan untuk melepaskan diri dari
tempat semula dan menyisip ke tempat lain. Transposon yang lebih kompleks
dapat mengandung satu atau beberapa gen tertentu misalnya gen-gen penyandi
resistensi terhadap antibiotik.

Bila transposon menyisip pada suatu gen tertentu maka gen tertentu
tersebut akan terganggu fungsinya. Oleh karena itu, transposon sering
digunakan oleh para peneliti untuk melakukan mutagenesis (melakukan proses
mutasi) sehingga dihasilkan mutan. Misalnya, untuk mempelajari gen yang
menyebabkan warna hijau, seorang peneliti dapat menggunakan transposon
untuk mendapatkan mutan yang tidak berwarna hijau. Mutan menjadi tidak
hijau karena gen penentu warna hijau disisipi oleh transposon. Dengan
melacak posisi dimana transposon berada maka peneliti tersebut dapat
mempelajari gen yang menentukan warna hijau karena gen tersebut telah
disisipi transposon (gen warna hijau bersatu bersama transposon).

Transposon juga dapat digunakan untuk menandai suatu sel.


Transposon yang membawa gen resistensi terhadap antibiotik sering
digunakan oleh para peneliti sebagai penanda. Kita dapat menandai suatu
strain bakteri dengan menyisipkan gen resistensi terhadap suatu antibiotik.
Untuk menyisipkan gen resistensi terhadap antibiotik, kita dapat
menggunakan transposon. Misalnya, kita dapat menandai strain bakteri-B
dengan menggunakan transposon Tn5-kanR (transposon Tn5 yang
mengandung gen kanR. Gen kanR menyandikan resistensi terhadap antibiotik
kanamisin). Kita dapat menggunakan Tn5-kanR untuk menandai agar bakteri-
B menjadi resisten terhadap kanamisin. Bila Tn5 masuk ke dalam sel bakteri-
B maka Tn5 beserta gen kan R yang dikandungnya akan menyisip ke dalam
DNA (kromosom) bakteri-B. Dengan demikian bakteri-B yang semula tidak
tahan terhadap kanamisin, setelah disisipi Tn5 menjadi tahan terhadap
kanamisin. Selanjutnya bila sel bakteri-B yang sudah ditandai tersebut
tercampur dengan sel bakteri lainnya, maka kita masih dapat memilihnya atau
menyeleksinya yaitu menggunakan media yang mengandung kanamisin.
Dalam hal ini, bakteri lain tidak tumbuh, sedangkan bakteri-B (yang sudah
ditandai) dapat tumbuh pada media dengan antibiotik kanamisin tersebut.

20
Transposon dapat digunakan untuk menandai sel, menandai suatu gen,
melacak keberadaan suatu gen, menemukan letak suatu gen di dalam
kromosom. Jadi, transposon merupakan salah satu perangkat penting di dalam
teknologi DNA rekombinan.

Pustaka Genom digunakan untuk menyimpan gen atau fragmen DNA


yang telah diklonkan. Salah satu cara yang digunakan untuk mempelajari
genom suatu organisme adalah dengan menggunakan pendekatan Shot-Gun.
Dengan pendekatan ini, DNA total dipotong menggunakan enzim restriksi.
Oleh karena jumlah potongannya sangat banyak maka sangatlah sulit untuk
mempelajari setiap potongan tersebut dalam waktu yang bersamaan. Oleh
karena itu, potongan-potongan tersebut perlu untuk disimpan lebih dulu
sebelum mendapatkan gilirannya untuk dipelajari. Untuk menyimpan
potongan atau fragmen DNA genom digunakan Pustaka Genom. Pustaka
genom merupakan koleksi berbagai klon bakteri yang berisi plasmid
rekombinan maupun koleksi klon fage yang mengandung DNA rekombinan.

Di dalam pustaka genom ini, setiap plasmid rekombinan atau setiap


DNA fage rekombinan membawa salah satu potongan atau fragmen DNA
genom yang dipelajari. Setiap klon bakteri membawa satu plasmid
rekombinan sedangkan setiap klon fage membawa satu DNA fage
rekombinan. Kumpulan klon-klon bakteri yang membawa plasmid
rekombinan ini dinamakan Pustaka Plasmid, sedangkan kumpulan fage
rekombinan dinamakan Pustaka Fage. Jadi Pustaka Genom dapat berupa
Pustaka Plasmid dan/atau Pustaka Fage.

Enzim traskripsi balik digunakan untuk membuat DNA berdasarkan


RNA. Tidak lama setelah penemuan enzim restriksi, Howard Temin dan
David Baltimore secara terpisah pada tahun 1970 menemukan enzim
transkripsi-balik (reverse-transcriptase) yang digunakan oleh retrovirus untuk
membuat copy DNA berdasarkan RNA-nya. Enzim transkripsi-balik ini
kemudian digunakan untuk mengkonstruksi copy DNA yang disebut cDNA
(complementary DNA) dengan menggunakan RNA sebagai cetakannya.
Dengan demikian gen atau bagian dari gen dapat disintesis berdasarkan
mRNA. Proses sintesis DNA dengan cara ini merupakan kebalikan dari pada
proses transkripsi. Oleh karena itu dinamakan transkripsi balik.

Saat ini, enzim transkriptase-balik sudah diproduksi secara komersial.


Ketersediaan enzim transkriptase-balik ini telah memberikan kemudahan bagi
para peneliti untuk mempelajari gen yang bertanggung-jawab terhadap sifat-
sifat tertentu. Tanpa enzim transkriptase-balik, pekerjaan mencari gen
umumnya dimulai dari mengisolasi DNA total genom, kemudian memotong-
motongnya menjadi ratusan ribu potongan yang kemudian diteruskan dengan
mempelajari setiap potongan. Cara ini tentu saja membutuhkan lebih banyak
tenaga dan memakan waktu yang lebih lama. Dengan ketersediaan enzim
transkritase- balik, pekerjaan mencari gen tidak lagi harus dimulai dengan
mengisolasi DNA genom total tetapi dimulai dengan mengisolasi mRNA.

21
Tahapan utama dalam pembuatan DNA menggunakan transkriptase
balik ini adalah sebagai berikut:

a. DNA gen eukariot terdiri atas intron dan exon, pada wakttu
transkripsi semua bagian tersebut diterjemahkan oleh enzim
transkriptase menjadi RNA.

b. Dalam proses pasca-transkripsi, intron dibuang sehingga


mRNA tidak lagi mengandung intron.

c. Bila kita berhasil mengisolasi mRNA dari sel, maka kita dapat
membuat DNA gen yaitu dengan menambahkan enzim
transkriptase-balik.

d. Enzim transkriptase-balik mensisntesis DNA dengan


menggunakan mRNA tersebut sebagai cetakannya. Hasilnya
berupa DNA utas tunggal.

e. Setelah dihasilkan DNA utas tunggal, DNA polimerase akan


mensintesis utas DNA pasangannya sehingga dihasilkan gen
yang berupa DNA utas ganda. DNA gen hasil dari transkripsi
balik ini tidak mengandung intron.

Pelacak DNA / RNA digunakan untuk mendeteksi gen atau fragmen


DNA yang diinginkan atau untuk mendeteksi klon yang benar. Edwin M
Southern, pada tahun 1975, telah mempublikasikan prosedur untuk
mendeteksi fragmen DNA yang spesifik. Prosedur ini dikenal dengan nama
teknik Southern Blotting . Pelacak atau probe yang digunakan untuk
mengidentifikasi fragmen DNA yang spesifik tersebut merupakan asam
nukleat pendek, berutas tunggal (RNA atau DNA berutas tunggal) dan diberi
label radioaktif atau non radioaktif.

Bila dicampurkan dengan fragmen-fragmen DNA, rangkaian basa


yang ada pada probe tersebut akan berpasangan dengan rangkaian basa
komplementer yang ada pada fragmen DNA. Dengan kata lain bahwa fragmen
DNA yang akan tertempeli probe adalah fragmen DNA yang mengandung
urutan basa yang komplementer dengan urutan basa pada probe.

Dengan teknik ini, gen tertentu dapat diisolasi dari campuran fragmen
DNA yang kompleks. Langkah awalnya adalah memisahkan fragmen-fragmen
DNA dengan cara elektroforesis pada gel agarosa. Fragmen DNA yang telah
terpisah di dalam gel agarose, selanjutnya didenaturasi (dibuat menjadi utas
tunggal).

Fragmen-fragmen DNA tersebut kemudian ditransfer pada filter


nitroselulosa atau membran nilon sehingga setiap fragmen DNA menempel
kuat pada membran dan posisinya yang sama dengan posisi pada gel agarosa.
Kemudian membran atau filter direndam dalam cairan yang mengandung
probe. Bila probe-nya adalah probe radioaktif, filter selanjutnya ditempelkan

22
atau diekspose pada lembaran film X-ray untuk mengetahui posisi fragmen
yang tertempeli probe pada filter atau membran. Probe non-radioaktif juga
telah cukup lama dikembangkan. Probe dapat dikaitkan dengan enzim,
misalnya peroksidase sehingga menjadi probe-enzim. Deteksinya dapat
dilakukan dengan menggunakan substrat chemiluminescent yang signalnya
ditangkap oleh lembaran film x -ray. Probe juga dapat dikaitkan dengan
vitamin misalnya biotin, sedangkan deteksinya menggunakan enzim misalnya
alkalin phosphatase. Signalnya akan nampak langsung pada filter atau
membran berupa pita-pita yang berwarna biru/ungu bila pita-pita tersebut
merupakan fragmen DNA yang berikatan dengan probe.

Dengan prinsip yang sama yaitu perpasangan basa-basa probe dengan


basa-basa DNA target yang komplementer, probe asam nukleat ini juga dapat
digunakan untuk mendeteksi klon yang benar. Klon DNA (gen atau fragmen
DNA) dapat dibuat melalui pembuatan plasmid rekombinan di dalam tabung
reaksi (mencampurkan plasmid asal dan fragmen DNA). Kemungkinan yang
dapat ditemui di dalam tabung reaksi tersebut adalah plasmid tanpa
mengandung fragmen DNA (plasmid asal) dan plasmid rekombinan (plasmid
yang mengandung fragmen DNA).

Tahap berikutnya adalah memasukkan plasmid ke dalam sel bakteri


dengan cara mencampurkan campuran plasmid tersebut dengan bakteri
inangnya. Kemungkinan yang dapat terjadi dalam hal ini adalah: ada sel
bakteri yang tidak berisi plasmid, ada sel yang berisi plasmid asal, dan ada sel
yang berisi plasmid rekombinan. Teknik Southern Blotting tersebut di atas
dapat digunakan untuk mendeteksi klon yang benar (klon bakteri yang
mengandung plasmid rekombinan), yaitu dengan menggunakan probe yang
spesifik untuk fragmen DNA yang diklonkan (urutan basanya komplemen
dengan urutan basa pada fragmen yang diklonkan).

Berdasarkan mekanisme bakteri, perangkat bakteri, dan beberapa


teknik diatas, DNA rekombinan dapat dibuat paling tidak melalui tiga
pendekatan, yaitu:

b. Mengestraksi DNA total suatu organisme, memotong DNA total


menjadi fragmen-fragmen, memilih fragmen yang dikehendaki,
mengklonkan fragmen yang telah terpilih.

c. Mengestraksi DNA total suatu organisme, memotong DNA total


menjadi fragmen-fragmen, mengklonkan semua fragmen DNA
pada vektor yang sesuai, menguji setiap klon untuk mendapatkan
gen yang diinginkan.

d. Sintesis gen atau fragmen DNA yang diinginkan secara langsung


dan mengklonkan gen atau fragmen DNA hasil sintesis.

23
24
BAB III
PENUTUP
Kesimpulan

Genom bakteri merupakan materi genetik yang mengatur pewarisan sifat


dalam suatu sel bakteri. Genom bakteri terdiri dari DNA kromosom, RNA dan
Plasmid serta materi genetik tambahan lainya. Plasmid merupakan materi genetik
ekstrakromosomal yang umumnya berbentuk sirkuler dana dapat bereplikasi
sendiri.Plasmid ini berperan dalam fungsi-fungsi khusus, seperti dalam resistensi
obat, penghasil toksin, penghasil enzim-enzim khusus dll.

Mekanisme pemindahan bahan genetik pada bakteri secara umum


dilakukan dengan tiga cara yaitu transformasi, transduksi, dan konjugasi.

Sisntesis protein pada bakteri pada prinsipnya sama dengan sintesis


protein yang terjadi pada sel eukariot. Pada sel bakteri karena tidak memiliki
membran ini, maka proses translasi diikuti langsung dengan proses translasi tanpa
mengalami prose splicing.

Pengaturan sintesis protein pada sel bakteri dilakukan oleh sistem


regulator yaitu lac. operon atau typ.operon. Pengaturan sintesis protein ini
melibatkan gen-gen regulator dan gen struktural yang bekerja dalam satu
kesatuan.

25
DAFTAR PUSTAKA
Campbell, et all. 2002. Biologi edisi 5 jilid 1. Jakarta: Erlangga.

Darkuni, Noviar. 2001. Mikrobiologi (Bakteriologi, Virologi dan Mikologi).


Malang: Universitas Negeri Malang.

Gardner, E.J., dkk. 2000. Principle of Genetic. New York: Chichester-Brisbane-


Toronto-Singapore: John Wiley and Sons Inc.

Lewin, Benjamin. 2004. Genes VIII. United States of America: Pearson Prentice
Hall Pearson Education, Inc.

Pangastuti, Artini. 2006. Definisi Spesies Prokaryota Berdasarkan Urutan Basa


Gen Penyandi 16s rRNA dan Gen Penyandi Protein. BIODIVERSITAS. 7(3):
292-296.

Pelczar, Michael. 2008, Dasar-Dasar Mikrobiologi. Jakarta: UI Press.

Ristiati, Ni Putu. 2000. Pengantar Mikrobiologi Umum. Jakarta: Departemen


Pendidikan Nasional.

Snustad, P.D. and Simmons, M.J., 2012. Principles of Genetics. 6th ed. United
States of America: John Willey & Sons Inc.

Pelczar, Michael dan Chan. 2010. Dasar-dasar Mikrobiologi. Jakarta: UI Press.

Suharni, Tri Theresia, dkk. 2008. Mikrobiologi Umum. Yogyakarta: Universitas


Atma Jaya

Syahrurachman, Agus. 1994. Mikrobiologi kedokteran ed.revisi. Jakarta: Bina


Rupa Aksara

http://web.ipb.ac.id/~tpb/files/materi/genetika/regulasi/regulasitextpdf.pdf

http://web.ipb.ac.id/~tpb/files/materi/genetika/dnarekombinan/textdnarekombinan
pdf.pdf

26