Nama Dosen : Drh. Surachmi Setiyaningsih, Ph.

D
Kelompok : 9/Pagi

UJI REVERSE TRANSCRIPTERASE-POLYMERASE CHAIN

REACTION (RT PCR) UNTUK DETEKSI NEWCASTLE DISEASE
(ND) DAN AVIAN INFLUENZA (AI)

Anggota Kelompok:

Siow Shuen Yuan B04168010

Jonathan Ho Kah Keat B04168014
Pang Sze Khay B04168017
Gan Li Yan . B04168024
Irfandi Makmur Putra. B04160165

DEPARTEMEN ILMU PENYAKIT HEWAN DAN KESMAVET

FAKULTAS KEDOKTERAN HEWAN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
2019
 PENDAHULUAN

Latar Belakang

Virus Avian Influenza (AI) dan Newcastle Disease (ND) merupakan contoh
penyakit pada hewan yang dapat menyebabkan kerugian yang besar. Virus AI
merupakan virus yang bersifat zoonosis yang dapat menyebabkan penyakit hingga
kematian pada manusia(Cleaveland et al. 2001). Penyakit AI merupakan penyakit
infeksius pada unggas yang disebabkan oleh virus AI tipe A yang termasuk dalam
famili Orthomyxoviridae, dan mampu menginfeksi berbagai spesies hewan mamalia
dan manusia (Swayne dan Halvorson 2003). Strain virus AI yang dapat ditularkan
dari unggas antara lain adalah virus influenza H5N1 dan H7N7 (Koopmans et al.
2004) Virus ND merupakan virus dalam famili Paramyxoviridae yang memiliki 10
serogroup, yaitu avian paramyxovirus (APMV)-1 sampai APMV-10. Virus ND
termasuk dalam serogroup APMV-1 dan merupakan virus paling patogen pada
unggas (OIE 2012). Virus ND dapat digolongkan menjadi 4 pathotype berdasarkan
gejala klinis yang ditimbulkan, yaitu viscerotropic velogenic yang menyebabkan
infeksi akut dengan lesi hemoragi pada organ pencernaan, tipe neurotropic velogenic
dengan gejala gangguan pernafasan dan saraf, tipe mesogenic yang umumnya
menyerang hewan muda, dan tipe lentogenic dengan gejala gangguan pernapasan
(Alexander dan Venne 2008).
Kedua virus tersebut dapat berdampak pada kesehatan masyarakat Indonesia
serta dapat berdampak pada ekonomi, sosial, dan politik Indonesia menyebabkan
penyakit ini menjadi sangat penting dan harus diperhatikan. Oleh karena itu,
identifkasi dan karakterisasi virus yang patogen pada hewan yang tepat, cepat, dan
akurat sangat diperlukan. Identifikasi virus dapat dilakukan dengan berbagai teknik
pengujian, baik secara konvensional maupun molekuler. Kemajuan perkembangan
teknologi molekuler menghasilkan teknik amplifikasi genom dengan Polymerase
Chain Reaction (PCR) yang menjadi standar terbaru untuk deteksi mikroba. PCR
telah dikembangkan sebagai aplikasi diagnostik pada laboratorium klinik (Cockerill
dan Smith 2002). PCR dapat digunakan untuk mengamplifikasi DNA atau RNA.
Dalam pengamplifikasian RNA, proses PCR dimulai dengan reverse transcripterase
terhadap molekul mRNA dehingga dapat diperoleh complementary DNA (cDNA)
yang kemudian akan digunakan sebagai template dalam proses PCR. Proses ini
dikenal dengan Reverse Transcripterase-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR).
Pengujian ini telah banyak dilakukan dilapangan untuk mengidentifikasi genom virus
seperti Avian Influenza (AI) dan Newcastle Disease (ND).
 Tujuan

Praktikum ini bertujuan mengetahui tingkat cemaran virus ND dan AI pada

peternakan unggas di sekitar kampus IPB Dramaga dengan cara diagnosa
menggunakan RT-PCR.

METODE PRAKTIKUM

Waktu dan Tempat Penelitian

Pengambilan sampel atau isolat virus dilakukan di peternakan unggas di

sekitar kampus IPB Dramaga dan dari tiap peternakan diambil sebanyak 5 sampel.
Pengambilan sampel dilakukan pada hari Minggu, 8 September 2019 pukul 09.00.
Selanjutnya, prosedur ekstraksi dan deteksi virus dilakukan di RK Kitwan dan Lab
Diagnostik FKH IPB pada hari Selasa, 17 September 2019 dan 24 September 2019
pukul 10.30-13.00.

Alat dan Bahan

Alat yang digunakan yaitu ice pack/ice box, tabung eppendorf, cotton bud
yang sudah disterilkan, label, gloves, micropipet 100 µL, rak, yellow tips, tabung,
mesin RT-PCR, magnetic stand, dan titer plate shaker. Bahan yang digunakan yaitu
ayam untuk swab kloaka kemudian digabungkan menjadi satu, Kit RT-PCR, wash
solution 1 (Isopropanol), dan wash solution 2 (Etanol).

Metode

Isolat virus
Isolat virus didapatkan dari peternak ayam dengan total sampel virus
berjumlah 5 tiap kelompok. Sampel virus didapatkan dengan cara dilakukan swab
dengan cotton bud steril pada bagian kloaka. Sampel virus diletakan di ice box agar
komponen virus tidak rusak. Setelah itu, sampel virus dibawa ke laboratorium.

Pooling
Setiap sampel diberi nama/identitas (P1,P2..dst), kemudian sampel di thawing
dengan cara setiap sampel diletakkan di sela-sela jari lalu digoyangkan. Setelah di
thawing sampel dihomogenkan dengan menggunakan sentrifuse. Kemudian tube
diambil dengan menggunkan mikropipet dengan cara ditekan lalu diletakkan di rak
kemudian diambil dari masing-masing sampel kelompok lalu dimasukkan ke dalam
microtube dan sampel siap untuk diekstrasi RNA virus.

Ekstraksi virus RNA

Pertama kit dicampurkan 50 ml nuklease-free water, 4 processing plates and
lids, 50 ml viral lysis/ binding solution concentrate, 10 ml bead resuspension
solution, 105 ml wash solution 1 konsentrat, 100 ml wash solution 2 konsentrat, 20
ml elution buffer, 2 ml RNA binding beads dan 500 µL carrier RNA. Kemudian
sampel diletakkan di magnetic stand.

Prosedur isolasi MagMAX-96 AI/ND viral RNA

Kit dicampurkan 50 µL nuclease-free water, kemudian ditambahkan 50 µL
sampel ke 101 µL viral lysis/binding solution, 20 µL bead resuspension ke setiap
sampel, dicampur selama 4 menit. RNA binding beads diambil dengan hati-hati dan
supernatan dibuang. Kemudian dicuci sekali dengan 100 µL wash solution 1 selama
30 detik. Kemudian dicuci dua kali dengan 100 µL wash solution 2 selama 30 detik.
Beads dikeringkan dengan menggoyangkannya selama 2 meni. Lalu elusi RNA
dimasukkan ke dalam 50 µL buffer elusi selama 3 menit. Kemudian isolated RNA
disimpan di RNAse-free solution selama 24 jam dengan suhu 4° C dan <24 jam
dengan suhu- 70 °C.

Komponen reaksi untuk Newcastle Virus

Reaksi : 20 µL
dH2O : 3.5 µL
2x RT-PCR Buffer (MgCl2) (Wise et al. 2004) : 10.0 µL
Sense Primer(20 µM) (M+4100) (Wise et al. 2004) : 0.5 µL
Antisense primer (20 µM) (M-4220) (Wise et al. 2004) : 0.5 µL
Probe (20 µM) (M+4169) (Wise et al. 2004) : 0.3 µL
TaKaRa Ex Taq HS (5 U/µl) : 0.4 µL
Primer Script RT enzyme Mix : 0.4 µL
ROX Reference Dye II : 0.4 µL
Template RNA : 4.0 µL
Komponen reaksi untuk Avian Influenza Virus
Reaksi : 20 µL
dH2O : 3.5 µL
2x RT-PCR Buffer (MgCl2) (Wise et al. 2004) : 10.0 µL
Sense Primer(20 µM) : 0.5 µL
Antisense primer (20 µM) : 0.5 µL
Probe (20 µM) : 0.3 µL
TaKaRa Ex Taq HS (5 U/µl) : 0.4 µL
Primer Script RT enzyme Mix : 0.4 µL
ROX Reference Dye II : 0.4 µL
Template RNA : 4.0 µL

HASIL DAN PEMBAHASAN

Identifikasi Virus Avian Influenza

Identifikasi virus Avian Influenza (AI) dilakukan pada sampel hasil swab
kloaka ayam dengan menggunakan uji real time Reverse Transcriptase-Polymerase
Chain Reaction (RT-PCR). Uji RT-PCR untuk mendeteksi virus AI dilakukan pada 8
sampel.

Tabel 1 Hasil identifikasi virus AI real time RT-PCR dari sampel swab kloaka ayam
No Sampel Hasil
1 P1 Negatif
2 P2 Negatif
3 P3 Negatif
4 P4 Negatif
5 P5 Negatif
6 P6 Negatif
7 P7 Negatif
8 P8 Negatif
P: Pagi
 Gejala klinis dari infeksi virus AI yang dapat diamati menurut Soejoedono
dan Handharyani (2005) berupa jengger dan pial yang berwarna biru keunguan,
pembengkakan disekitar kepala dan muka, cairan yang keluar dari hidung dan mata,
pendarahan titik (ptechie) pada daerah dada, kaki dan telapak kaki, batuk, bersin, dan
ngorok. Sampel ayam dalam penguji ini, tidak dapat gejala klinis yang dibahas dalam
literatur. Berdasarlan hasil pada Tabel 1, tidak terdapat sampel yang positif memiliki
RNA virus AI. Ini menunjukan bahwa peternakan ayam di sekitar kampus memiliki
tingkat cemaran virus AI sebanyak 0% dan menunjukan bahwa peternakan unggas di
sekitar kampus bebas dari virus Avian Influenza (AI). Hal ini dapat disebabkan oleh
waktu penampungan ayam yang singkat sehingga tingkat cemaran pada ayam sangat
rendah dan tidak dapat terdeteksi pada uji laboratorium. hasil negatif juga dapat
disebabkan karena RNA terdegradasi dan terkontaminasi oleh agen kontaminan
sehingga enzim polimerase tidak dapat bereaksi akibatnya tidak adanya RNA virus
dalam sampel, (Budiarto et. al 2018).
Uji diagnostik cepat dikembangkan untuk membedakan antara HPAI dan
LPAI virus AI subtipe H5 dengan real time RT-PCR (rRT-PCR) satu tahap dan
analisisnya berdasarkan nilai Ct. Analisis Ct untuk membedakan antara HPAI dan
LPAI berdasarkan perbedaan ukuran amplikon dan persentase kandungan guanin
sitosin. Rancangan primer H5 untuk rRT-PCR biasanya dirancang dari daerah yang
konsisten antara strain HPAI dan LPAI dengan menggunakan sekuen nukleotida yang
diperoleh dari GenBank atau laporan hasil penelitian. rRT-PCR ini telah banyak
digunakan untuk diagnosis dan penelitian virus AI yang pathogen (Hewajuli dan
Dharmayanti 2013). Unggas yang terinfeksi virus AI dapat menjadi sumber penularan
pada manusia, hal ini merupakan hal yang harus sangat diperhatikan karena unggas
merupakan salah satu hewan komoditi yang penting bagi aktivitas sosial dan ekonomi
masyarakat. Buruknya penerapan biosekuriti, sanitasi, dan higiene dapat menjadi
memicu terjadinya penyebaran dan penularan virus AI dalam suatu lingkungan
peternakan (Darminto 2008).

Identifikasi Virus Newcastle Disease

Identifikasi virus Newcastle Disease (ND) dilakukan pada sampel hasil swab
kloaka ayam dengan menggunakan uji real time Reverse Transcriptase-Polymerase
Chain Reaction (RT-PCR). Uji RT-PCR untuk mendeteksi virus ND dilakukan pada
6 sampel.

Tabel 2 Hasil identifikasi virus ND real time RT-PCR dari sampel swab kloaka ayam
 No Sampel Hasil
1 S1 Negatif
2 S2 Negatif
3 S3 Negatif
4 S4 Negatif
5 S5 Negatif
6 P9 Positif
P: Pagi, S: Siang

Berdasarlan hasil pada Tabel 2, terdapat satu sampel yang positif memiliki
RNA virus ND dari 6 sampel, yaitu sampel P9. Ini menunjukan bahwa peternakan
unggas di sekitar kampus memiliki tingkat cemaran virus ND sebanyak 16.7%. Hasil
positif didasari oleh fluorosensi yang muncul ketika RNA template diamplifikasi
pada proses PCR. Ayam yang positif terhadap uji ND memiliki signalement
BLABLABLA yang sesuai/tidak sesuai dengan literatur. Virus ND dapat
digolongkan menjadi 4 pathotype berdasarkan gejala klinis yang ditimbulkan, yaitu
viscerotropic velogenic yang menyebabkan infeksi akut dengan lesi hemoragi pada
organ pencernaan, tipe neurotropic velogenic dengan gejala gangguan pernafasan dan
saraf, tipe mesogenic yang umumnya menyerang hewan muda, dan tipe lentogenic
dengan gejala gangguan pernapasan (Alexander dan Venne 2008).
Methode reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) digunakan
untuk mengamplifikasi gen protein F kemudian diananlisis menggunakan agarose gel
electrophoresis (Dahliatul et al. 2017).
Gejala klinis yang sering terjadi akibat infeksi virus ND secara umum adalah
diare, depresi, bulu rontok, kesulitan pernafasan, anoreksia dan lesu seta penurunan
produksi telur. Gejala patogomonis yang dapat diamati yati adanya hemoragi dan
nekrosis pada organ limfiod seperti limpa dan timus. Pada ayam petelur yang telah
mendapat vaksinasi ND selama proses produksi akan memperoleh kekebalan
persisten sehinga tidak menunjukkan gejala yang menciri selain penurunan produksi
telur. Virus ND bersifat sistemik sehingga dapat ditemukan terdistriibusi pada
beberapa tempat yaaitu saluran pernapasan, saluran pencernaan, pakreas dan otak
(Dahliatul et al. 2017).
Ayam atau unggas yang terinfeksi dapat mencemari lingkungan, pakan, air, dan
peralatan kandang akibat eksresi virus dalam bentuk droplet, debu, atau partikel lain.
Eksresi melalui pernafasan dapat mempercepat sirkulasi penyebaran virus karena
dapat ditramisikan melalui udara. Alexander dan Venne (2008) menyatakan bahwa
 transmisi Newcastle Disease Virus yang paling tinggi dapat terjadi melalui aerosol
atau droplet yang dieksresikan oleh unggas terinfeksi.

SIMPULAN

Penelitian ini menunjukan bahwa tingkat cemaran virus Newcastle Disease (ND)
pada peternakan unggas di sekitar kampus IPB Dramaga adalah sebanyak 16.7%,
sedangkan tingkat cemaran virus Avian Influenza (AI) pada peternakan unggas di
sekitar kampus IPB Dramaga adalah sebanyak 0%.

DAFTAR PUSTAKA

[OIE]. Office International des Epizooties. 2012. Terrestial Manual Newcastle disease.
[diunduh 30 September 2019]. Tersedia pada:
http://www.oie.int/fileadmin/Home/fr/Health_standards/tahm/2.03.14_NEWCAS
TL _DIS.pdf.
Alexander, D.J. and D.A. Senne. 2008. Newcastle Disease. other avian paramyxovirus
and pneumovirus infections: Newcaste Disease. in Disease of Poultry. Saif, Y.
(Ed.). 12nd ed. Iowa (US): Iowa State University
Cleaveland S. Laurenson MK. Taylor LH. 2001. Diseases of human and their domestic
mammals: pathogen characteristics, host range and the risk of emergence. Philos
Trans R Soc Lond Ser B Biol Sci 356: 991-999
Cockerill FRIII, Smith TF. 2002. Rapid-cycle real-time PCR: a revolution for clinical
microbiology. ASM News 68: 77-83
Dahliatul Qosimah, Sri Murwani, Indah Amalia Amri. 2017. Penyakit Viral Pada
Unggas Malang (ID): UB Press. pp 19-30.
Darminto. (2008). Perkembangan Teknologi Pengendalian Penyakit Avian Influenza.
Bogor.(ID): Balai Besar Penelitian Veteriner,
Hewajuli DA dan Dharmayanti NLPI. 2013. Perkembangan Teknologi Reverse
Koopmans M, Willbrink B, Conyn M, Natrop G, van der Nat H, Vennema H, Meijer
A, van Steenbergen J, Fouchier Rm Osterhaus A, Bosman A. 2004. Transmission
of H7N7 Avian Influenza A virus to human beings durng a large outbreak in
commercial poultry farns in the Netherlands. Lancet. 363: 587-593
Soejoedono RD, Handharyani E. 2005. Flu Burung. Jakarta(ID) : Penebar Sawadya.
Swayne, D.E. 2008. Epidemiology of avian influenza in agricultural and other man
made systems. in: Avian Influenza. DE Swayne (Ed), 59-85. Iowa.(US):
Blackwell Publising.
Transcriptase-Polymerase Chain Reaction dalam Mengidentifikasi Genom
Avian Influenza dan Newcastle Diseases. WARTAZOA. 24 (1) : 16-29.
 LAMPIRAN

Gejala Klinis Ayam Masing-Masing Kelompok

Sampel Viral P1
 Signalemen Hewan
Nama Unggas 1 Unggas 2 Unggas 3 Unggas 4 Unggas 5
Sex - - - - -
Jenis Hewan Ayam Ayam Ayam Ayam Ayam
Ras/Breed Ayam Ayam Ayam Ayam Ayam
kampung kampung kampung kampung kampung
Umur - - - - -

Swab Kloaka kloaka Kloaka kloaka Kloaka

Tujuan Untuk kesenangan pribadi
pemeliharaan
 Anamnesa : sehat ,tidak ada kelainan
 Lokasi pengambilan sampel : -

Sampel Viral P2
 Signalemen Hewan
Nama Unggas 1 Unggas 2 Unggas 3 Unggas 4 Unggas 5
Sex Jantan Jantan jantan betina Jantan
Jenis Hewan Ayam Ayam ayam ayam Ayam
Ras/Breed Ayam Ayam Ayam Ayam Ayam
kampung kampung kampung kampung kampung
Umur (bulan) 12 10 13 12 24

Swab Kloaka Kloaka Kloaka kloaka Kloaka

Tujuan Untuk kesenangan pribadi
pemeliharaan
 Anamnesa : sehat, tidak divaksin
 Lokasi pengambilan sampel : jalan sengked 3


Sampel Viral P3
  Signalemen Hewan
Nama Unggas 1 Unggas 2 Unggas 3 Unggas 4 Unggas 5
Sex Jantan Jantan Jantan Betina Jantan
Jenis Hewan Ayam Ayam Ayam Ayam Ayam
Ras/Breed Ayam Ayam Ayam Ayam Ayam
kampung kampung kampung kampung kampung
Umur 3-4 bulan 3-4 bulan 3-4 bulan 4-5 bulan 4-5 bulan

Swab Kloaka Kloaka Kloaka kloaka Kloaka

Tujuan Untuk kesenangan pribadi
pemeliharaan
 Anamnesa : Tidak pernah sakit
 Lokasi pengambilan sampel : Babakan lio, Ciampea

Sampel Viral P4
 Signalemen Hewan
Nama Unggas 1 Unggas 2 Unggas 3 Unggas 4 Unggas 5
Sex Jantan Jantan Jantan Betina Jantan
Jenis Hewan Bebek Bebek Bebek Ayam Ayam
Ras/Breed Bebek Bebek Bebek Ayam Ayam
lokal lokal lokal kampung kampung
Umur 6 bulan 6 bulan 6 bulan 3 minggu 3 minggu

Swab Kloaka Kloaka Kloaka kloaka Kloaka

Tujuan Untuk kesenangan pribadi
pemeliharaan
 Anamnesa : Tidak divaksin
 Lokasi pengambilan sampel : Cangkurawok

Sampel Viral P5
 Signalemen Hewan
Nama Unggas 1 Unggas 2 Unggas 3 Unggas 4 Unggas 5
Sex Betina Jantan Jantan Betina Jantan
Jenis Hewan Ayam Ayam Ayam Ayam Ayam
Ras/Breed Ayam Ayam Ayam Ayam Ayam
kampung kampung kampung kampung kampung
Umur 4 bulan 6 bulan 4 bulan 2 bulan 2 bulan
Swab kloaka Kloaka Kloaka kloaka Kloaka
Tujuan Untuk kesenangan pribadi
pemeliharaan
 Anamnesa : Belum divaksin
 Lokasi pengambilan sampel : Cangkurawok

Sampel Viral P6
 Signalemen Hewan
Nama Unggas 1 Unggas 2 Unggas 3 Unggas 4 Unggas 5
Sex Jantan Betina Jantan Betina Jantan
Jenis Hewan Ayam Ayam Ayam Ayam Ayam
Ras/Breed Ayam Ayam Ayam Ayam Ayam
kampung kampung kampung kampung kampung
Umur 6 bulan 6 bulan 6 bulan 1 minggu 2 minggu

Swab kloaka Kloaka Kloaka kloaka Kloaka

Tujuan Untuk kesenangan pribadi
pemeliharaan
 Anamnesa : Tidak pernah sakit, belum divaksin
 Lokasi pengambilan sampel : Babakan dramaga

Sampel Viral P7
 Signalemen Hewan
Nama Unggas 1 Unggas 2 Unggas 3 Unggas 4 Unggas 5
Sex - - - - -
Jenis Hewan Ayam Ayam Ayam Ayam Ayam
Ras/Breed Ayam Ayam Ayam Ayam Ayam
kampung kampung kampung kampung kampung
Umur - - - - -

Swab Kloaka Kloaka Kloaka kloaka Kloaka

Tujuan Untuk kesenangan pribadi
pemeliharaan
 Anamnesa : Snot, jamur di kulit
 Lokasi pengambilan sampel : -

Sampel Viral P8
 Signalemen Hewan
Nama Unggas 1 Unggas 2 Unggas 3 Unggas 4 Unggas 5
Sex Jantan Betina Betina Jantan Jantan
Jenis Hewan Ayam Ayam Ayam Ayam Ayam
Ras/Breed Ayam Ayam Ayam Ayam Ayam
kampung kampung kampung Pelung Pelung
Umur 1 tahun 1 tahun 1 tahun 1 tahun 1 tahun

Swab Kloaka Kloaka Kloaka kloaka Kloaka

Tujuan Untuk kesenangan pribadi
pemeliharaan
 Anamnesa : Snot, jamur di kulit
 Lokasi pengambilan sampel : Cihideung Ilir

Sampel Viral P9(positif ND)

 Signalemen Hewan
Nama Unggas 1 Unggas 2 Unggas 3 Unggas 4 Unggas 5
Sex Betina Jantan Betina Jantan Jantan
Jenis Hewan Ayam Ayam Ayam Ayam Ayam
Ras/Breed Ayam Ayam Ayam Ayam Ayam
kampung kampung kampung kampung kampung
Umur 3 minggu 5 bulan 3 minggu 3 minggu 3 minggu

Swab kloaka kloaka Kloaka kloaka Kloaka

Tujuan Untuk kesenangan pribadi
pemeliharaan
 Anamnesa : sehat ,tidak ada kelainan
 Lokasi pengambilan sampel : Cangkurawok