2.

BAHAN DAN METODE

2.1. Bahan

Streptozotocin (STZ), ethidium bromide, vitamin A (bentuk retinil) dan vitamin E yang dibeli dari
Sigma Aldrich Co.,MO, USA. Tikus-tikus albino Wistar dibeli dari Co Mesir untuk Experimental
Animals Impor, Helwan, Kairo, Mesir. Pelarut seperti dimetil sulfoksida (DMSO) dan bahan terkait
berasal dari ADWIA perusahaan farmasi, Mesir. Kit untuk lipid profil, MDA, katalase, NO dan
kegiatan peroksidase berasal dari Clini Lab, Kairo, Mesir.

2.2. Induksi Obesitas dan Eksperimental Desain

Empat puluh tikus Wistar jantan, berusia 3 minggu,dengan bobot 75-85 g, digunakan untuk
penelitian ini. Semua prosedur telah disetujui oleh komite Perawatan Hewan dari Taif Universitas
untuk proyek #2175/1434/1. Tikus terbiasa tinggal sendiri selama seminggu dan dipelihara pada
12:12 h siklus gelap cahaya pada suhu 25˚C; dan mereka diberi kebebasan untuk makan dan minum.
Kelompok kontrol negatif (n = 10) memperoleh makan dan minum normal tanpa pengobatan
apapun, sedangkan tersisa tiga puluh tikus diberi High Fat Diet (HFD) untuk 3 bulan. HFD terdiri dari
15,5% protein, 38,8% lemak dan 45,7% karbohidrat. Komponen HFD ditunjukkan pada Tabel 1.
Obesitas dikonfirmasi oleh peningkatan parameter lipid dan berat badan.Tinggi lemak-makan tikus
dibagi ke dalam 4 kelompok berikut. Kontrol kelompok positif (obesitas, kelompok non diobati, n =
10) diperoleh akses bebas ke air dan HFD. Vitamin A kelompok obesitas, (n = 10) telah secara lisan
diberikan vitamin A, bentuk retinyl (129 mg / kg / hari) seperti dilansir Jayakumar et al.,selama 2
bulan. Vitamin E kelompok obesitas (n = 10) telah secara lisan diberikan vitamin E (340 mg / kg /
hari) seperti dilansir Shen et al.,selama 2 bulan. Kedua vitamin A dan E yang dilarutkan dalam DMSO;
dengan demikian, baik mengontrol negatif dan mengendalikan positif tikus setiap hari diberikan
DMSO dengan volume yang sama. Pada akhir penelitian, tikus dibius dengan halotan, dikorbankan
dengan pemenggalan kepala setelah puasa semalam dan darah diambil untuk pemisahan serum.
Sampel hati yang diawetkan dalam larutan Bouin ini untuk pemeriksaan histopatologi dan di Qiazol
reagen untuk ekstraksi RNA. Selama prosedur eksperimental, perubahan berat badan dan asupan
makanan dicatat pada titik-titik waktu yang ditunjukkan seperti yang ditunjukkan pada Tabel 2.

2.3. Pengujian Parameter Biokimia

Serum triasilgliserol (TAG), kolesterol total (TC), sangat lipoprotein low density (VLDL), lipoprotein
densitas rendah (LDL) dan high density lipoproteins (HDL) yang diukur spektrofotometri
menggunakan kit komersial, malondialdehid (MDA), nitrous oksida (NO), peroksidase dan katalase
diukur dengan menggunakan ELISA kit berdasarkan instruksi produsen manual.

2.4. Histopatologi hati

Sampel hati yang tetap dalam larutan Bouin, maka dehidrasi di kelas menaik alkohol, dan akhirnya
dibersihkan di xilena dan ditanam dalam parafin. Sampel yang diunggulkan di blok, kemudian diiris
menjadi 5 m dengan ketebalan dan ditempatkan di atas slide kaca. Slide diwarnai dengan Mayer
hematoksilin dan eosin (H dan E) dan diperiksa oleh mikroskop cahaya.
2.5. RNA Ekstraksi DAN Sintesis cDNA
Untuk persiapan RNA total, sampel jaringan hati (sekitar 100 mg per sampel) dikumpulkan dari tikus,
flash beku dalam nitrogen cair dan kemudian disimpan di -70˚C Dalam 1 ml Qiazol (QIAGEN Inc,
Valencia, CA). sampel beku yang homogen menggunakan Polytron 300 D homogenizer (Brinkman
Instrumen, Westbury, NY). Kemudian, 0,3 ml kloroform ditambahkan ke homogenat. Campuran
dikocok selama 30 detik diikuti dengan sentrifugasi pada 4C dan 12.500 rpm selama 20 menit. Itu
lapisan supernatan dipindahkan ke satu set baru tabung, dan volume yang sama dari isopropanol
ditambahkan ke sampel , kocok selama 15 detik dan disentrifugasi pada 4c dan 12.500 rpm
selama 15 menit . Pelet RNA dicuci dengan 70 % etanol , sebentar mengering , dan kemudian
dilarutkan di Diethylpyrocarbonate ( DEPC ) air . disiapkan integritas RNA diperiksa dengan
elektroforesis .konsentrasi RNA dan kemurnian ditentukan secara spektrofotometripada 260
nm . Rasio 260/280 optikkepadatan semua sampel RNA adalah 1,7-1,9 .Untuk sintesis cDNA
, campuran 2 ug RNA totaldan 0,5 ng oligo dT primer dalam total volume 11 mldisterilkan
air DEPC diinkubasi di PEX 0,5 Cycler termal ( Thermo Electronic Corporation, Milford ,Ma
) di 65C selama 10 menit untuk denaturasi . Kemudian , 4 ml5X RT -buffer , 2 ml 10 mM
dNTP dan 100 U MoloneyMurine leukemia Virus ( M - MuLV ) reverse transcriptase
( SibEnzyme Ltd Ak , Novosibirsk , Rusia ) yang ditambahkan dan total volume selesai
hingga 20 ml dengan air DEPC . Campuran itu kemudian kembali diinkubasi di Cycler termal
pada 37 C selama 1 jam , kemudian pada 90C selama 10 menit untuk menonaktifkan enzim
2.6 . Analisis PCR Semi – kuantitatif primer spesifik untuk gen diuji ( Tabel 3 ) dirancang
menggunakan program komputer Oligo - 4 dan disintesis oleh Macrogen ( Macrogen
Perusahaan , Gasa - dong , Geumcheon-gu . Korea). PCR dilakukan dalam volume akhir dari
25 ml yang terdiri dari 1 ml cDNA , 1 ml dari 10 picomolar ( PM ) dari masing-masing
primer ( maju dan mundur ) , dan 12,5 ml PCR Master mix ( Promega Corporation, Madison ,
WI ) ,
volume dibawa hingga 25 menggunakan disterilkan ,deionisasi air. PCR dilakukan
menggunakan PEX 0,5 termal Cycler dengan urutan siklus di 94˚C selama 5 menit
satu siklus , diikuti oleh 25 siklus yang masing-masing terdiridenaturasi pada 94˚C selama
satu menit , anil disuhu tertentu yang sesuai untuk setiap primer ( Tabel3 ) dan ekstensi di
72˚C selama satu menit dengan tambahan ekstensi akhir pada 72˚C selama 5 menit . Sebagai
acuan,
ekspresi dehidrogenase gliseraldehida - 3 – fosfat ( G3PDH ) mRNA terdeteksi menggunakan
spesifik primer ( Tabel 3 ) . Produk PCR dielektroforesis atas 1 % agarose ( Bio Basic INC .
Konrad Cres , Markha Ontario ) gel diwarnai dengan ethidium bromida dalam TBE ( Tris-
Borat - EDTA ) penyangga . Produk PCR divisualisasikan di bawah sinar UV dan difoto
menggunakan dokumentasi gel sistem. Intensitas dari band yang diukur densitometrically
menggunakan program image NIH
2.7 . Analisis statistik
Hasil dinyatakan sebagai berarti ± S.E. dari 10 independen tikus per masing-masing
kelompok . Analisis statistik dilakukan dengan menggunakan ANOVA dan Fischer uji post
hoc , dengan p < 0,05 makhlukdianggap signifikan secara statistik

Tabel 2. Perubahan berat badan (A) dan asupan makanan (B) di tikus Wistar obesitas setelah
pemberian oral vitamin A dan E selama 2 bulan.

Data disajikan sebagai mean ± S.E selama 10 tikus per kelompok. * P <0,05 vs nilai-nilai diwakili
pengendalian gulma nol; #p <0,05 vs diwakili sama minggu kelompok obesitas.

3. HASIL

3.1. Pengaruh Vitamin A dan Administrasi E pada Perubahan Berat Badan dan Intake Makanan
Administrasi vitamin A dan E untuk tikus obesitas selama 2 bulan menurun kenaikan berat badan
dibandingkan untuk obesitas dan kontrol tikus yang diberi makan. Penurunan dalam tubuh berat
badan dan makanan asupan tergantung waktu. Itu signifikan dari minggu kedua dan terus akhir
percobaan (Tabel 2).

3.2. Pengaruh Vitamin A dan Administrasi E pada Perubahan Lipid Profiles,Tingkat Antioksidan dan
Nitrous Oxide (NO)
Induksi obesitas pada tikus Wistar peningkatan kadar serum TAG, kolesterol, VLD dan VLDL dan
penurunan tingkat HDL. Administrasi Vitamin A dan E dinormalisasi peningkatan TAG, kolesterol, VLD
dan VLDL dibandingkan dengan kontrol dan tikus obesitas (Tabel 4). Mengenai perubahan tingkat
HDL, obesitas penurunan kadar HDL sedangkan kedua vitamin A dan administrasi E dinormalisasi itu
relatif untuk mengontrol dan obesitas tingkat mengkonfirmasikan hipolipidemik mereka tindakan
(Tabel 4). Vitamin A dan administrasi E untuk tikus obesitas dinormalisasi perubahan tingkat MDA.
Selain itu, aktivitas katalase menurun pada tikus gemuk dan normalisasi vitamin A dan E tikus
diberikan (Tabel 4). Dari catatan, obesitas tidak berpengaruh pada peroksidase aktivitas dan
administrasi baik vitamin A atau E tidak mempengaruhi aktivitas peroksidase. Selain itu, obesitas
diinduksi disfungsi endotel melalui perubahan di NO tingkat, obesitas penurunan kadar NO dan
administrasi vitamin A dan E tingkat NO normal (Tabel 4).