LAPORAN PRAKTIKUM

MIKROBIOLOGI DASAR
“Pewarnaan Gram dan Pengujian KOH Bakteri”

NAMA : MUSLIMIN
STAMBUK : D1C114016
KELAS : Teknologi Pangan A

PROGRAM STUDI TEKONOLOGI PANGAN

JURUSAN ILMU DAN TEKNOLOGI PANGAN
FAKULTAS PERTANIAN
UNIVERSITAS HALU OLEO
2014
 I. PENDAHULUAN

A. Latar Belakang

Bakteri mempunyai morfologi, struktur dan sifat-sifat yang khas. Bakteri

merupakan mikroorganisme yang berukuran mikroskopik. Selain mikroskopik,

bakteri juga hampir tidak berwarna atau transparan dan kontras dengan air.

Sehingga melihat dan mengamati bakteri dalam kedaan hidup sangat sulit. Untuk

mengatasi hal tersebut maka dikembangkan suatu teknik pewarnaan sel bakteri.

Ini merupakan salah satu cara yang paling utama dalam penelitian-penelitian

mikrobiologi. Hal itu untuk mempernudah proses identifikasi bakteri.

Banyak metode atau tahapan standar yang dilakukan dalammengidentifikasi

mikroba, salah satunya berdasarkan sifat kimiawinya. Sel terdiridari berbagai

bahan kimia. Bila sel mikroba diberi perlakuan kimiawi, maka selini

memperlihatkan susunan kimiawi yang spesifik. Sebagai contoh disini adalah

bakteri. Bakteri yang hidup hampir tidak berwarna dan kontras dengan air,

dimanasel-sel bakteri tersebut disuspensikan. Salah satu cara untuk mengamati

bentuk sel bakteri sehingga mudah untuk diidentifikasi ialah dengan metode

pengecatan atau pewarnaan. Hal tersebut juga berfungsi untuk mengetahui sifat

fisiologisnya yaitumengetahui reaksi dinding sel bakteri melalui serangkaian

pengecatan.

Dalam taksonomi mikroba alat yang paling ampuh digunakan yaitu

pewarnaan Gram (Gram Stain), yang dapat digunakan untuk memisahkan

anggota- anggota dominan bakteria ke dalam dua kelompok berdasarkan

perbedaan dinding selnya. Bakteri gram positif memiliki dinding sel yang lebih
sederhana,dengan jumlah peptidoglikan yang relatif banyak. Dinding sel bakteri

gram-negatif memiliki peptidoglikan yang lebih sedikit dan secara struktural lebih

kompleks. Membran bagian luar pada dinding sel gram-negatif mengandung

lipopolisakarida, yaitu karbohidrat yang terikat dengan lipid. Diantara bakteri

patogen,yang menyebabkan penyakit,spesies gram-negatif umumnya lebih

berbahaya dibandingkan dengan spesies gram-positif

Melihat dari berbagai devinisi yang telah disebutkan diatas maka kami

sangat tertarik untuk melakukan pengujian guna untuk mengidentifikasi dan

mengetahui morfologi dari bakteri utamanya pada bakteri yang ber gram positif

dan gram negatif serta dapat mengetahui morfologi bakteri aerob dan anaerob

dengan cara pewarnaan gram, uji KOH dan uji fisiologis mikroba.

B. Tujuan dan Kegunaan

Tujuan dari praktikum ini adalah untuk melihat bentuk bakteri dan

mempelajari cara pewarrnaan.

Kegunaan dari praktikum ini adalah untuk melihat bentuk bakteri dan

mempelajari cara pewarrnaan

 II. TINJAUAN PUSTAKA

Mikroorganisme sulit dilihat dengan mikroskop cahaya, karena tidak

mengadsorbsi atau pun membiaskan cahaya. Alasan inilah yang menyebabkan zat

warna digunakan untuk mewarnai mikroorganisme karena zat warna

mengadsorbsi dan membiaskan cahaya sehingga kontras mikroorganisme dengan

lingkungannya ditingkatkan.

Karakterisasi merupakan salah satu kegiatan yang dilakukan untuk

mengobservasi bakteri maupun kapang hasil isolasi (isolat). Kegiatan karakterisasi

dapat dilakukan berdasarkan sifat sitologi (bentuk sel, gerak atau motilitas, sifat

Gram dan endospora), sifat morfologi, dan sifat fisiologi. Uji sifat morfologi

mencakup sifat-sifat koloni, seperti ukuran, bentuk, warna dan tepian, sedangkan

uji sifat fisiologi diantaranya uji hidrolisis pati, hidrolisis lemak, hidrolisis protein

dan uji katalase (Subandi, 2009).

Pewarnaan Gram dan spora dapat dilakukan dalam uji sifat sitologi suatu

bakteri. Prinsip pewarnaan Gram adalah kemampuan dinding sel terhadap zat

warna dasar (Kristal violet) setelah pencucian alkohol 96%. Bakteri Gram positif

terlihat berwarna ungu karena dinding selnya mengikat Kristal violet lebih kuat,

sedangkan sel Gram negatif mengandung lebih banyak lipid sehingga pori-pori

mudah membesar dan Kristal violet mudah larut saat pencucian alkohol.

Pewarnaan spora dilakukan untuk mengetahui ada atau tidaknya spora pada

bakteri. Spora dapat terbentuk saat kondisi tidak memungkinkan pertumbuhan

bakteri. Spora juga mampu mengikat warna lebih cepat dan sukar melepaskannya

(Fardiaz, 2007).
 Pewarnaan gram dilakukan bertujuan sama dengan uji gram yaitu untuk

membedakan bakteri apakah gram positif atau gram negatif, bakteri dicampur

dengan tetesan air steril pada gelas objek, kemudian disebarkan ditengah gelas

obyek sehingga membentuk lapisan tipis dan difiksasi. Dengan kristal violet

olesan bakteri digenangi selama dua menit, lalu dicuci dengan air mengalir, dan

dikering anginkan. Diberi yodium selama dua menit, dicuci dengan air mengalir

dan dikeringanginkan. Selanjutnya diberi larutan pemucat yaitu alkohol 95%, tetes

demi tetes sampai zat warna ungu tidak terlihat lagi, lalu dicuci pada air mengalir

dan dikeringanginkan. Kemudian dogenangi lagi dengna safranin selama 30 detik,

lalu dicuci dan dibiarkan kering diudara. Warna merah pada olesan bakteri

menujukkan bakteri gram negatif dan jika warna ungu menunjukkan bakteri gram

positif (Michael, 2008).

Bakteri memiliki beberapa bentuk yaitu basil (tongkat), kokos, dan spirilum.

Bakteri yang berbentuk tongkat maupun kokus dibagi menjadi beberapa macam.

Pada bentuk basil pembagiannya yaitu basil tunggal, diplobasil, dan tripobasil.

Sedangkan pada kokus dibagi monokokus (satu buah bakteri berbentuk kotak),

diplokokus, sampai sthapylococcus (bentukknya mirip buah anggur). Khusus pada

spiral hanya di bagi dua yaitu setengah melengkung dan tidak melengkung.

Bakteri juga dapat dibedakan melalui teknik pewarnaan gram. Teknik pewarnaan

gram tersebut dapat menghasilkan warna merah dan ungu. Bakteri gram negative

ditandai dengan pewarnaan ungu sedangkan yang positif berwarna merah

(textbook, 2008). Hal ini bertujuan untuk memberikan warna pada bakteri pada

akhirnya dapat di identifikasi dengan mudah, selain itu, ada endospora adalah
organism yang dibentuk dalam kondisi yang stress karena kurang nutrisi, yang

memiliki kemungkinan untuk tetap berlanjut dilingkungan sampai kondisi

menjadi baik (ncbi, 2008).

Teknik pewarnaan gram haruslah sesuai prosedur karena dapat

mengakibatkan kesalahan identifikasi data apakah gram positif atau gram negative

sehingga diperlukan adanya praktikum ini dilakukan agar mengetahui jalanya

mekanisme pewarnaan gram. Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah salah

satu teknik pewarnaan yang paling penting dan luas yang digunakan untuk

mengidentifikasi bakteri. Dalam proses ini, olesan bakteri yang sudah terfiksasi

dikenai larutan-larutan berikut : zat pewarna kristal violet, larutan yodium, larutan

alkohol (bahan pemucat), dan zat pewarna tandingannya berupa zat warna

safranin atau air fuchsin. Metode ini diberi nama berdasarkan penemunya,

ilmuwan Denmark Hans Christian Gram (1853–1938) yang mengembangkan

teknik ini pada tahun 1884 untuk membedakan antara pneumokokus dan bakteri

Klebsiella pneumonia. Dengan metode pewarnaan Gram, bakteri dapat

dikelompokkan menjadi dua, yaitu bakteri Gram positif (berwarna ungu/biru) dan

bakteri Gram negatif (berwarna merah).

Perbedaan dua kelompok bakteri ini didasarkan pada kemampuan sel

menahan (mengikat) warna ungu dari kristal violet selama proses dekolorisasi

oleh alkohol. Bakteri gram positif tidak mengalami dekolorisasi karena tetap

mengikat warna ungu kristal violet dan pada tahap akhir pengecatan tidak

terwarnai safranin. Bakteri gram negatif mengalami dekolorisasi oleh alkohol dan

pada tahap akhir pengecatan terwarnai menjadi merah oleh safranin.

 Menurut Pelzar et al (2005), macam-macam pewarnaan antara lain

pewarnaan sederhana yaitu dengan menggunakan larutan tunggal suatu pewarna

pada lapisan tipis yang sudah di fiksasi. Pewarnaan differentsial yaitu prosedur

pewarnaan yang menampilkan perbedaan diantara sel-sel mikroba atau bagian-

bagian sel mikroba dari pewarnaan gram adalah teknik pewarnaan differensial

digunakan untuk bakteri.

Menurut Pratiwi (2009), selain merupakan gram-gram yang tersusun atas

ion positif dan negative, yang salah satunya berwarna dan disebut kromofor

(chromofor). Pewarnaan pada dasarnya adalah prosdur mewarnai mikroorganisme

dengan menggunakan zat warna yang dapat menonjolkan strktur tertentu dari

mikroorganisme yang ingin kita amati. Bakteri gram positif akan

mempertahankan zat warna krisktal violet dan karenanya akan tampak bewarna

ungu tua dibawah mikroskop. Adapun bakteri gram negates akan kehilangan zat

Kristal violet setelah dicuci dengan alkohol dan sewaktu diberi zat pewarna

tandingannya yaitu dengan zat warna air tochsin atau safranin akan tampak merah.

Perbedaan warna ini disebabkan olh perbedaan struktur kimiawi dinding selnya.

(wapedia, 2010).

Adakala suatu perlu diwarnai dua kali setelah zat warna yang pertama

(ungu) terserap, maka sediaan dicuci dengan alkohol, kemudian ditumpangi

dengan zat warna yang berlainan, yaitu dngan zat warna merah. Jika sediaan itu

kemudian kita cuci dengan air lau dengan alkohol maka dua kemungkinan dapat

terjadi. Pertama, zat tambahan terhapus, sehingga yang tampak ialah zat warna

asli (ungu). Dalam hal ini sediaan (bakteri) kita sebut gram positif. Kedua zat
warna tambahan (merah) bertahan hingga zat warna asli tidak tampak. Dalam hal

ini sediaan (bakteri) jika kita katakana gram negatif (Dwioseputro, 2005).

Bakteri dapat diklasifikasikan menjadi aerob dan anaerob. Perbedaan utama

antara kedua adalah kenyataan bahwa bakteri aerobik membutuhkan oksigen

untuk tetap hidup, sementara bakteri anaerob tidak bergantung pada oksigen untuk

proses metabolisme dan kelangsungan hidup. Sedangkan aerob dapat berkembang

di habitat yang memiliki oksigen berlimpah, anaerob dapat mati dalam dengan

adanya oksigen. Jenis bakteri memang memiliki keunggulan pertumbuhan area

tubuh tidak terpapar oksigen, dan mereka bisa menjadi patogen virulen. Perbedaan

kapasitas untuk memanfaatkan oksigen antara aerob dan anaerob penting dalam

pengobatan infeksi tubuh (Lay, 2006).

Identifikasi dan determinasi suatu biakan murni bakteri yang diperoleh dari

hasil isolasi dapat dilakukan dengan cara pengamatan sifat morfologi koloni,

morfologi sel bakteri, pengujian sifat-sifat fisiologi dan biokimianya. Selain itu,

identifikasi juga dapat dilakukan dengan penguraian sifat patogenitas dan

serologinya. Pertumbuhan bakteri di alam dipengaruhi oleh beberapa faktor luar

seperti susbtrat, pertumbuhan , pH, temperatur, dan bahan kimia. Bakteri yang

nampak dapat memiliki morfologi yang sama, namun keperluan nutrisi dan

persyaratan ekologinya berbeda. Untuk pengamatan morfologi bakteri dengan

jelas ,tubuhnya perlu diisi dengan cat warna, pewarnaan ini disebut pengecatan

ekteri (Ratna, 2007).

 III. METODE PRAKTIKUM

A. Tempat dan Waktu

Praktikum ini dilaksanakan di Laboratorium Agroteknologi Unit

Bioteknologi Fakulatas Pertanian Universitas Halu Oleo Hari Jum’at, 31 Oktober

2014 pukul 10:00 – 11:30 WITA.

B. Alat dan Bahan

Alat yang digunakan pada praktikum ini adalah jarum ose, lampu spritus

(lampu Bunsen), pipet mikro, dan kaca benda.

Bahan yang digunakan pada praktikum ini adalah biakan murni, st21e, agt a

2014, ralstonia, alcohol, larutan KOH 3% dan zat warna.

C. Prosedur Praktikum

 Pewarnaan sederhana

1. Membuat olesan bakteri pada kaca benda.

2. Difiksasi.

3. Member zat warna utama yaitu amonium oksalat Kristal violet (beripa larutan)

selama 1 – 2 menit, kemudian dicuci dengan air mengalir.

4. Memberi mordan yaitu larutan iodium selama 1 – 2 menit, dicuci dengan air

mengalir.

5. Meneteskan larutan alkohol aseton sedikit sedikit demi sedikit, sehingga

larutan yang mengalir tadi berwarna menjadi tidak berwarna.

6. Meneteskan zat pewarna penutup yaitu larutan berwarna merah atau karbon

selama 2 – 3 menit.

7. Mencuci dengan air mengalir, dikeringkan.

8. Mengamati di bawah mikroskop dengan minyak inersi.

9. Menggambar bentuk bakteri dan warnanya.

 Uji KOH

1. Mengambil satu ose biakan bakteri bacillus dan campurkan 2 tetes larutan

KOH 3%, di atas gelas objek.

2. Mengaduk secara merata dengan jarum ose, tarik jarum ose ke atas gelas objek

dan amati pembentukan lendir. Jika terbentuk lendir mengindikasikan bakteri

gram negatif (-), jika tidak berlendir mengindikasikan bakteri gram positif (+).

3. Lakukan hal yang sama (prosedur 1 dan 2) untuk isolat-isolat bakteri lainnya.
 IV. HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Hasil

Hasil pengamatan dapat dilihat Tabel berikut:

Tabel 1. Pengamatan pada pengujian KOH 3%

Hasil pengamatan
No Kode isolat Uji KOH 3% keterangan
Reaksi gram Bakteri gram
1. ST21E Positif Negatif Berlendir
2. RALSTONIA Negatif Positif Tidak berlendir
3. AGT A2014 Positif Negatif Berlendir

B. Pembahasan

Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah suatu metode untuk

membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, yakni gram-positif dan

gram-negatif, berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel mereka. Metode ini

diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuwan Denmark Hans Christian Gram

(1853–1938) yang mengembangkan teknik ini pada tahun 1884 untuk

membedakan antara pneumokokus dan bakteri Klebsiella pneumoniae.

Dengan metode pewarnaan Gram, bakteri dapat dikelompokkan menjadi

dua, yaitu bakteri Gram positif dan Gram negatif berdasarkan reaksi atau sifat

bakteri terhadap cat tersebut. Reaksi atau sifat bakteri tersebut ditentukan oleh

komposisi dinding selnya. Oleh karena itu, pengecatan Gram tidak bisa dilakukan

pada mikroorganisme yang tidak mempunyai dinding sel seperti Mycoplasma sp

Contoh bakteri yang tergolong bakteri tahan asam, yaitu dari genus

Mycobacterium dan beberapa spesies tertentu dari genus Nocardia. Bakteribakteri

dari kedua genus ini diketahui memiliki sejumlah besar zat lipodial (berlemak) di

dalam dinding selnya sehingga menyebabkan dinding sel tersebut relatif tidak

permeabel terhadap zat-zat warna yang umum sehingga sel bakteri tersebut tidak

terwarnai oleh metode pewarnaan biasa, seperti pewarnaan sederhana atau Gram.

Dalam pewarnaan gram diperlukan empat reagen yaitu :

1. Zat warna utama (C.Gention Violet).

2. Lugol(zat Iodin) yaitu senyawa yang digunakan untuk mengintensifkan warna

utama memperkuat reaksi.

3. Pencuci / peluntur zat warna (alcohol / aseton) yaitu solven organic yang

digunakan untuk melunturkan zat warna utama.

4. Zat warna kedua / cat penutup (air fuksin) digunakan untuk mewarnai kembali

sel-sel yang telah kehilangan cat utama setelah perlakuan dengan alcohol.

Bakteri Gram-negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna

metil ungu pada metode pewarnaan Gram. Bakteri gram-positif akan

mempertahankan zat warna metil ungu gelap setelah dicuci dengan alkohol,

sementara bakteri gram-negatif tidak. Pada uji pewarnaan Gram, suatu pewarna

penimbal (counterstain) ditambahkan setelah metil ungu, yang membuat semua

bakteri gram-negatif menjadi berwarna merah atau merah muda. Pengujian ini

berguna untuk mengklasifikasikan kedua tipe bakteri ini berdasarkan perbedaan

struktur dinding sel mereka.

Pengecatan gram dilakukan dalam 4 tahap yaitu:

1. Pemberian cat warna utama (C.Gention Violet) berwarna ungu.

2. Pengintesifan cat utama dengan penambahan larutan Lugo.

3. Pencucian (dekolarisasi) dengan larutan alkohol asam.

4. Pemberian cat lawan yaitu cat warna air fuksin

Perbedaan dasar antara bakteri gram positif dan negatif adalah pada

komponen dinding selnya. Kompleks zat iodin terperangkap antara dinding sel

dan membran sitoplasma organisme gram positif, sedangkan penyingkiran zat

lipida dari dinding sel organisme gram negatif dengan pencucian alcohol

memungkinkan hilang dari sel. Bakteri gram positif memiliki membran tunggal

yang dilapisi peptidohlikan yang tebal (25-50nm) sedangkan bakteri negative

lapisan peptidoglikogennya tipis (1-3 nm).

Sifat bakteri terhadap pewarnaan Gram merupakan sifat penting untuk

membantu determinasi suatu bakteri. Beberapa perbedaan sifat yang dapat

dijumpai antara bakteri Gram positif dan bakteri Gram negatif yaitu:

Ciri-ciri bakteri gram negatif yaitu:

 Struktur dinding selnya tipis, sekitar 10 – 15 mm, berlapis tiga atau multilayer.

 Dinding selnya mengandung lemak lebih banyak (11-22%), peptidoglikan

terdapat d idalam.

 lapisan kaku, sebelah dalam dengan jumlah sedikit ± 10% dari berat kering,

tidak mengandung asam tekoat.

 Kurang rentan terhadap senyawa penisilin.

 Pertumbuhannya tidak begitu dihambat oleh zat warna dasar misalnya kristal

violet.

 Komposisi nutrisi yang dibutuhkan relatif sederhana.

 Tidak resisten terhadap gangguan fisik.

 Resistensi terhadap alkali (1% KOH) lebih pekat

 Peka terhadap streptomisin

 Toksin yang dibentuk Endotoksin

Ciri-ciri bakteri gram positif yaitu:

 Struktur dinding selnya tebal, sekitar 15-80 nm, berlapis tunggal atau

monolayer.

 Dinding selnya mengandung lipid yang lebih normal (1-4%), peptidoglikan ada

yang sebagai lapisan tunggal. Komponen utama merupakan lebih dari 50%

berat ringan. Mengandung asam tekoat.

 Bersifat lebih rentan terhadap penisilin.

 Pertumbuhan dihambat secara nyata oleh zat-zat warna seperti ungu kristal.

 Komposisi nutrisi yang dibutuhkan lebih rumit.

 Lebih resisten terhadap gangguan fisik.

 Resistensi terhadap alkali (1% KOH) larut.

 Tidak peka terhadap streptomisin

 Toksin yang dibentuk Eksotoksin Endotoksin

 V. PENUTUP

A. Kesimpulan

Gram memiliki dinding sel yang tebal dan lemak yang tipis sedangkan

gram berlemak tebal dan berdinding sel tipis yang berada di ruang periplasma.

penentuan sifat gram dengan KOH 3% (disebutKOH string test) memiliki hasil

yang sama dengan pewarnaan gram.

Semua bakteri memiliki enzim proteinase tapi tidak semuanya memiliki

enzim proteinase ekstraseluler, aktivitas enzim ini juga dapat dibuktikan dengan

adanya zona bening di sekeliling koloni. Jenis bakteri yang dapat menghidrolisis

protein adalah bakteri yang memproduksi enzim proteinase ekstraseluler

B. Saran

pada praktikum ini banyak prosedur yang harus dilakukan secara teliti dan

tepat, sehingga disarankan agar setiap perlakuan dilakukan sesuai rosedur dan

aturan- aturan agar hasil pengamatan sesuai dengan yang diharapkan.

 DARTAR PUSTAKA

Dwioseputo. 2005. Dasar- dasar Mikrobiologi. Jakarta: PT Penerbit Djambatan.

Farrdiaz. 2007. Mikrobiologi Dasar Jilid I. Jakarta : Erlangga.

Lay.2006. Mikrobiologi Dasar, diterjemahkan oleh: Markham, M.sc.Jakarta:

Erlangga.

Michael. 2008. Microbiology 2nd Edition USA : WMC Brown Publisher.

Ncbi. 2008 .Dasar- dasar Mikrobiologi Jilid 1 Jakarta: UI Press.

Ratna. 2007. Teknik Pewarnaan Bakteri. Gramedia. Jakarta.

Subandi,U.2009. Mikrobiologi dasar Dalam Praktek. Gramedia. Jakarta.

Wapedia. 2010. Mikrobiologi Dasar. Jatinangor: Fmipa Unpad.