UNIVERSIDAD NACIONAL DEL CALLAO

FACULTAD DE INGENIERIA PESQUERA Y ALIMENTOS

ESCUELA DE INGENIERIA DE ALIMENTOS

EFECTO DE PH Y
TEMPERATURA SOBRE LA
ACTIVIDAD DE LA CATALASA
Y PEROXIDASA
AUTORES:
CARRION CARCAMO, KIMBERLY 1724125301
FREYRE YUCRAM, MELISA MARIA 1724112127
GALVEZ URETA, MADELEIN NICOLE 1724115072
SANCHEZ VALVERDE, JESSICA 1724115036
TRUJILLO AMADO, DIANA CELESTE 1724125131

GRUPO:
91G / MESA 3

PROFESORA:
DECHECO EGUSQUIZA ALICIA CECILIA

AÑO:
2019
 I. INTRODUCCIÓN:
Las enzimas son el producto de expresión de genes; por lo tanto, su actividad puede verse
modulada por el genotipo del individuo. El estudio de la actividad enzimática tiene importancia
en ciencia básica, bioquímica y biotecnología. Así mismo, la presencia de distintas isoenzimas y
su actividad enzimática diferencial puede ser empleada como marcador bioquímico de
normalidad o anormalidad (diagnóstico de enfermedades).
Las enzimas son proteínas (con la excepción de los RNA catalíticos) producidos por los seres
vivos que catalizan con gran eficacia las reacciones biológicas, actuando de forma específica y
regulada. Las anteriores propiedades hacen que las enzimas se puedan aplicar, de forma muy
eficaz, a procesos industriales tales como la obtención de fármacos, procesado de alimentos y
en analítica. La cinética enzimática es la parte de la enzimología que estudia la velocidad de las
reacciones catalizadas enzimáticamente y el efecto que diferentes factores físico-químicos
sobre dicha velocidad.
II. MARCO TEÓRICO
*CATALASA
Es una de las enzimas más abundantes en la naturaleza y se encuentra ampliamente
distribuida en el organismo humano, aunque su actividad varía en dependencia del tejido; ésta
resulta más elevada en el hígado y en los riñones, más baja en el tejido conectivo y los
epitelios, y prácticamente nula en el tejido nervioso. A nivel celular se localiza en la
mitocondrias y los peroxisomas, excepto en los eritrocitos, donde se encuentra en el citosol.
Esta enzima es una métalo proteína tetramétrica, cuyo peso molecular se encuentra en el
rango de 210- 280 KD. Consta de 4 subunidades idénticas que se mantienen unidas por
interacción no covalentes. Cada subunidad protohémico y el Hierro representa un 1,1% y
0,09% respectivamente del peso molecular de la enzima.

La catalasa es una enzima antioxidante presenta en la mayoría de los organismos aerobios.

Cataliza la dismutación del peróxido de hidrógeno (H2O2) en agua y oxígeno.
La mayoría de estas enzimas son homotetrámeros con un grupo Hemo en cada subunidad. Se
ha determinado la estructura cristalográfica de nueve catalasas. Algunas catalasas tienen
subunidades pequeñas (masa molecular = 60KDa) y otras grandes (Masa moléculas >80 KDa).
Entre éstos dos grupos de catalasas existen diferencias estructurales importantes. Las
catalasas pequeñas son menos resistentes a la desnaturalización, unen NADPH, tienen hemo b
y se inhiben e inactivan por sustrato. En cambio, las catalasas grandes tienen un dominio extra
en el C- terminal que es semejante a la flavodoxina, son muy resistentes a la desnaturalización,
tienen hemo d, presentan enlaces covalentes inusuales cercanos al sitio activo y son
resistentes a concentraciones molares de H2O2.
En algunas especies de enzimas se contiene moléculas nicotinamín adenín dinucleótido
fosfatado en su forma reducida (NADPH) ligadas estrechamente a la enzima, así se ha
demostrado que la CAT humana entre algunas y la de res están ligadas a moléculas de NADPH,
1 en cada subunidad y que no existe interacción directa entre el grupo hemo y NADPH.
El NADPH se une a las catalasas con un plegamiento único entre las oxidoreductasas. Los
aminoácidos de la cavidad que une el NADPH están muy conservados en las catalasas que
unen ese dinucleótido (4,9). El anillo de la adenina del NADPH está en una pequeña cavidad
conformada por varios aminoácidos hidrofóbicos (lle177, Leu428 y Leu429 en PMC). El grupo 2
fosfato de la adenina ribosa interactúa con la cadena lateral de una arginina conservada
(Arg182 en PMC). Una histidina (His284 en PMC) interactúa con el grupo pirofosfato y la
nicotidamina.

El NADPH unido a la enzima no está involucrado en su actividad catalítica o peroxidativa.

Ésta molécula puede invertir en la preservación y reservación parcial de la inactividad de la
CAT por su propio sustrato tóxico y estabiliza a la enzima por tener un reservorio de NADPH,
lo cual juega un papel importante durante el estrés oxidativo.

Uno de sus subproductos de la actividad de la célula viva es el peróxido de hidrógeno (Agua

oxigenada). Una sustancia tóxica para la vida celular y que por lo tanto ha de ser desdoblado
antes que se destruya la célula y como resultado de éste desdoblamiento se produce agua y
oxígeno. En esta práctica veremos como la velocidad de la reacción que cataliza se ve afectada
por diferentes factores como pH, temperatura, y concentración de enzimas y de sustrato.
Esta reacción inmediata es catalizada por la catalasa que se encuentra en todas las células que
tiene catabolismo aeróbico.
La catalasa o peróxido de hidrogeno – oxigeno reductasa en una enzima que tiene grupo
prostético hemo (presenta hierro en el centro de un esqueleto fundamental porfirinico) y
actúa sobre el peróxido de hidrogeno resultante de la oxidación del glicolato en los
peroxisomas durante la fotorespiracion en la hojas. También se encuentra con mayor
actividades el hígado y en diversos microorganismos. También se encuentra en los glioxisomas
principalmente en semillas secas en grasa donde, durante la germinación esta sustancia es
utilizada parcialmente como fuente de energía mediante el ciclo del ácido glioxilico.
El agua oxigenada es el sustrato y al entrar en contacto con la enzima inmediatamente
empieza la reacción, por lo tanto empezó a correr el tiempo (0.5, 1.1, 2, 3, 4, 5 min) el O2
liberando sale en forma de burbujas y puede ser cuantificado en los distintos tiempos por la
velocidad e intensidad.
La catalasa tiene como grupo activo ferriprotoporfirina IX. Por cada molécula enzimática hay 4
grupos hemina cada uno de los cuales va firmemente unido a la parte proteica a través de sus
dos grupos carboxilos (grupo prostético)

De acuerdo con la naturaleza de su grupo activo la catalasa es inhibida en forma irreversible por
las sustancias que forman complejos como el, por ejemplo el cianuro sulfuroso, acida fluoruro,
monóxido de carbono, monóxido de nitrógeno e hidroxidamina. Un inhibidor interesante de la
catalasa es la cianamida, que sin embargo, tiene muy poca acción sobre la peroxidasa.
La catalasa se encuentra en todas las células que tienen metabolismo aerobio, es una de las
enzimas conocidas con mayor actividad. La catalasa es una enzima que descompone el peróxido
de hidrogeno en oxígeno y agua. Químicamente la catalasa es una hemoproteina de estructura
similar al de la hemoglobina, excepto que los cuatro átomos de Hierro de la molécula están en
estado oxidado (Fe+++) en lugar de reducido (Fe++) excluyendo los estreptococos, la mayoría de
las bacterias aerobios y anaerobias facultativas poseen actividad catalasa.
La catalasa deshidrogena una molécula de peróxido de hidrogeno transportando el hidrogeno a
otra molécula de peróxido de hidrogeno

H2O2 + H2O2  O2 + 2H2O

La mayoría de los organismos aerobios tienen catalasa monofuncionales.

Las catalasas catalizan las dismutación del peróxido de hidrógeno en agua y oxígeno, evitando
así que se forme el radical hidroxilo y el oxígeno singulete, especies de oxígenos que son muy
reactivas. En el hombre, la catalasa protege la hemoglobina del peróxido de hidrogeno que se
genera en los eritrocitos. También tiene un papel de protección en la inflamación, en la
prevención de mutaciones, evita el envejecimiento y ciertos tipos de cáncer.
Las mutaciones en el gen de la catalasa pueden resultar en la enfermedad hereditaria
denominada acatalacemia que entre otros síntomas se reconoce por un incremento en la
incidencia de ulceraciones bucales.
  PEROXIDASA

Pertenece a la subclase de enzima oxidoreductasas que catalizan la acción de sustratos

orgánicos con peróxido de hidrogeno, quedando educida en agua.
Estas enzimas son proteínas homo que se hallan frecuentemente en plantas y
ocasionalmente en vegetales
Las peroxidasas son enzimas que catalizan la siguiente reacción:

ROOH + AH2  H2O + A

La reacción importante de las peroxidasas es la es la anterior, sin embargo existen 3 tipos de

reacciones en las que puede intervenir reacciones peroxidativas, oxidativas o hidroxilativas.
Para la reacción peroxidativa se requiere un peróxido orgánico o de agua. El número de
compuestos que pueden ser aceptores de hidrógeno para algunas peroxidasa es pequeño.
Los compuestos donadores de hidrógeno pueden ser fenoles, aminas y otros compuestos
orgánicos. El mecanismo de la reacción se basa en la formación de complejos de enzima-
donador de hidrógeno y dos pasos de oxidación univalente.

 Actividad Enzimática

Las propiedades de las enzimas derivan del hecho de ser proteínas de actuar como catalizadores.
Como proteínas, poseen una conformación natural más estable que las demás conformaciones
posibles. Así, cambios en la conformación suelen ir asociados en cambios en la actividad
catalítica. Los factores que influyen de manera más directa sobre la actividad de una enzima son:
-PH
-Temperatura
- Cofactores

a) Efecto de la Concentración de Enzima sobre la Actividad Enzimática

De forma general, la velocidad de una reacción catalizada enzimáticamente es proporcional a la

cantidad de enzima en la mezcla de ensayo según:

v = kcat Eo

Fig: 1La velocidad de una reacción catalizada enzimáticamente es generalmente proporcional a la

cantidad de enzima en la mezcla de ensayo.
b) Efecto del pH sobre la Actividad Enzimática

La actividad de una enzima se ve afectada por el PH al cual se lleva a cabo la reacción. La curva
actividad-pH puede ser diferente para cada tipo de enzima
En el caso más general la curva tiene forma de campana. El valor de pH al cual la actividad es
máxima se denomina pH óptimo; dicho pH no tiene porque coincidir con el pH intracelular. La
relación entre el pH y la actividad va a depender del comportamiento ácido-base de la enzima
y el sustrato. El sustrato y la enzima (centro activo) contienen grupos funciones ácidos y
básicos, siendo su grado de disociación dependiente del pH, lo que determinará, entre otros
aspectos, la conformación de la proteína, la capacidad de unión del sustrato al centro activo de
la enzima (Km) y la capacidad de transformación del sustrato (kcat). Los estudios cinéticos a
diferentes valores de pH nos proporcionan información sobre el mecanismo catalítico de la
enzima y la naturaleza de los aminoácidos más directamente implicados en el proceso
catalítico.

Fig2: La velocidad de una reacción catalizada enzimáticamente se ve afectada por el pH.

c) Efecto de la Temperatura sobre la Actividad Enzimática

La velocidad de una reacción catalizada por una enzima se incrementa al aumentar la

temperatura a la cual se lleva a cabo la reacción.

Fig3: La velocidad de una reacción catalizada enzimáticamente se ve afectada

La temperatura ejerce un doble efecto, sobre la conformación de la enzima y sobre la propia
reacción.
En la Fig.3. Se representa la típica curva actividad-temperatura.
La velocidad de la reacción se incremente al aumentar la temperatura dentro de un determinado
rango, alcanzando un valor máximo a la denominada temperatura óptima. A valores superiores
la actividad disminuye debido a que la enzima, como cualquier otra proteína, sufre procesos de
desnaturalización y, por lo tanto, de inactivación.

La relación entre la actividad y temperatura viene determinada por la ecuación de Arrhenius:

v = ke-Ea/RT

Donde Ea es la energía de activación, R la constante de los gases (2cal K-1 mol-1) y T la

temperatura(K).
d) Efecto de la Concentración de sustrato sobre la Actividad Enzimática

En la fig.4. Se representa el efecto de la concentración de sustrato sobre la velocidad de una

reacción catalizada enzimáticamente. Aunque no con todas las enzimas se observa dicho
comportamiento (sería el caso de enzimas alostéricas), es el caso más habitual y sencillo; las
enzimas que se ajustan a dicho modelo se conocen con el nombre de enzimas michaelianas.

Fig.4. Efecto de la S sobre la velocidad.

El anterior modelo cinético se ajusta a la ecuación:

v = VmaxS/km  S

Donde Km es la constante de michaelis e indica la afinidad de la enzima por su

sustrato, y Vmax es la velocidad máxima e indica la capacidad catalítica.
La determinación de los parámetros cinéticos Km y Vmax se puede llevar a cabo
utilizando la representación de Lineweaver-Burk (1/v: 1/S) (Fig.5.)
La correspondiente ecuación sería:

1/v = 1/Vmax  Km/Vmax 1/S

Fig.5. Representación de Lineweave-Burk o de los dobles inversos

III. OBJETIVOS:
 Determinar las presencia de enzima peroxidasa en diferentes tipos de tejidos.
 Determinar la intensidad de reacción de la enzima catalasa de origen animal y vegetal.
 Determinar el efecto de temperatura, pH y concentración de sales sobre la actividad
catalítica de la catalasa.
 Preparar el extracto enzimático de distintos medios biológicos y comprobar su actividad.
 Emplear un método continuo para medir la velocidad enzimática.
 Evaluar el efecto de la concentración de sustrato sobre la actividad enzimática
IV. MATERIALES Y PROCEDIMIENTO:
A.-MATERIALES
Pipeta

 Tubos de ensayo
 Tubos pequeños
 Vaso precipitado
 Mortero y pilón
 Termómetro,
 Pisceta
 Bagueta
 Gradilla
 Cintas de pH
 Espectrómetro

B.-REACTIVOS
 NaCl
 Mg Cl
 Bicarbonato de Sodio
 Vinagre
 Agua Oxigenada
 Solución con sal
 Zumo de limon

C.-MUESTRAS
Licuados de:

 Hígado
 Yuca
 Rabanito
 Uva
 camote
PARTE EXPERIMENTAL:
Licuar las muestras de origen animal y vegetal como el hígado, camote, rabanito, uva.

A.-PRUEBA DE BARRIDO DE PRESENCIA DE CATALASA Y PEROXIDASA

A cada tubo se le agrega 8ml de muestra de yuca, rabanito, uva e hígado .A los cuales se
añaden 2ml de H2 O2. Se debe observar la intensidad de reacción en el momento a
temperatura ambiente. Con un cronometro medir el tiempo de término de reacción es decir
cuando deje de liberar oxigeno (como burbujear).
B.-EFECTO DE TEMPERATURA
Prepare tubos con 8ml de la muestra de origen animal (higado) y vegetal (camote) donde la
reaccion fue intensa a un valor de ph apropiado y repita el experimento anterior tratando
previamente la muestra en baño maria a 70°c por 30’’, 1’, 3’, 6’, 9’.

Con un cronometro medir en cada tubo el tiempo de término de reacción es decir cuando deje
de liberar oxigeno (como burbujas).

EFECTO DE TEMPERATURA CAMOTE:

EFECTO DE TEMPERATURA DEL HIGADO:

C.-EFECTO DEL PH:
Prepare tubos con 8ml de muestra, incube a temperatura ambiente y verifique la actividad de
la catalasa y peroxidasa a diferentes pH ácidos y alcalinos (jugo de limón, jugo de mandarina,
agua, bicarbonato de sodio, hidróxido de sodio).

EFECTO DE PH DEL HIGADO

EFECTO DEL PH DEL CAMOTE

 V. RESULTADOS
A. PRUEBA DE BARRIDO DE PRESENCIA DE CATALAZA Y PEROXIDASA

MUESTRA TIEMPO DE REACCIÓN INTENSIDAD REACCIÓN

HIGADO 2s +++++ Completa
UVA - - -
RABANITO 13s +++ Incompleta
YUCA 38s ++++ Completa

B. EFECTO DE TEMPERATURA (PRESENCIA DE CATALAZA EN EL HIGADO DE RES)

TRATAMIENTO 70° C TIEMPO DE REACCIÓN INTENSIDAD REACCIÓN

30¨ 1¨ +++++ Completa
1´ 1¨ +++++ Completa
3´ 4¨ +++++ Completa
6´ 9¨ +++++ Completa
9´ 25¨ +++++ Completa

 En esta parte se observa que ocurre una gran actividad enzimática, el tiempo de
reacción aumenta en un grado muy bajo gracias a otros compenetentes del tejido
animal que reaccionan con la enzima.
 Nótese que todas las pruebas fueron completas y se evidencio la propagación de
burbujas de aire.

C. EFECTO DEL PH (PRESENCIA DE PEROXIDAZA EN EL CAMOTE)

PH PH I. PH F. TIEMPO DE REACCIÓN INTENSIDAD REACCIÓN

LIMON 2 4 - - -
MANDARINA 4.5 4.7 - - -
AGUA 6 6 35¨ ++++ Completa
Cl Na 5% 6 6 3¨ ++ Incompleta
NaHCO3 5% 9 7 55¨ +++ Completa
NaOH 0,1 N 14 6 1´2¨ +++ Completa

 En este experimento con referencia a la reacción que tiene el PH en la actividad de las

enzimas se pudo constatar que en los rangos de los ácidos y bases trabajados, se
observó en algunos la disminución de reacción enzimática con muy poca actividad de
la enzima. En algunos no hubo reacción.
 D. EFECTO DE TEMPERATURA (PRESENCIA DE CATALAZA EN EL CAMOTE)

TRATAMIENTO 70° C TIEMPO DE REACCIÓN INTENSIDAD REACCIÓN

30¨ 26¨ +++++ Completa
1´ 52¨ +++++ Completa
3´ 68¨ +++ Incompleta
6´ 115¨ +++ Incompleta
9´ 135¨ ++ Incompleta

 En esta parte del experimento se observa que el tiempo de reacción va aumentando

conforme pasa el tiempo a dicha temperatura.
 El efecto de la temperatura sobre la acción de la amilasa del camote, se mide la
actividad enzimática a diferentes tiempos, en las cuales e observa reacciones
diferentes.
 70°C es una temperatura extrema en la cual las enzimas, en particular la amilasa,
disminuye su acción y se inhiben totalmente, debido a la desnutrición de la molécula
proteica, de las cuales están conformadas las enzimas.
 En el 1° y 2° tuvo se observa la reacción lenta pero completa de la enzima, se
evidencia la producción de burbujas de aire.
 En el 3°,4°,5° tuvo se observa la reacción lenta, casi nula e incompleta de la enzima, no
se puede evidenciar la producción e burbujas de aire.

E. EFECTO DEL PH (PRESENCIA DE PEROXIDAZA EN EL HIGADO DE RES)

PH PH I. PH F. TIEMPO DE REACCIÓN INTENSIDAD REACCIÓN

LIMON 2 4.5 17¨ + Incompleta
MANDARINA 4.5 5.5 2¨ ++++ Completa
AGUA 6 5 1¨ +++++ Completa
Cl Na 5% 6 7 1¨ +++++ Completa
NaHCO3 5% 9 7 1¨ +++++ Completa
NaOH 0,1 N 14 9 1´5¨ +++++ Completa

 Se observa la gran reacción enzimática, con abundante producción de burbujeo del

macerado del hígado con cada uno de los ácidos y bases.
 Estos resultados se debe que en el hígado macerado existe una mayor superficie de
contacto entre las enzimas y el sustrato correspondiente, es decir, el peróxido de
hidrógeno agregado, y además las enzimas catalasas del tejido se hacen más
abundantes con el macerado, pues se extraen del interior de los tejidos y contactan
mejor y en mayor número con el peróxido, haciendo más evidente la reacción
enzimática.
VI. CONCLUSIONES:
 Las burbujas que se producen en este tipo de reacciones enzimáticas son básicamente
oxigeno que se desprende de la reacción de la reacción entre las moléculas de
peróxido de hidrogeno y la enzima catalasa, que la degrada en agua y oxigeno
molecular que se libera en forma de gas.
 Para que la catalasa funcione debe estar en ph neutro y temperatura ambiente.
 La temperatura es un factor determinante en las reacciones enzimáticas porque
acelera o retarda la acción de las enzimas, lo que se evidencia con la producción de
burbujas.
VII. CUESTIONARIO
1. EXPLIQUE EL GRUPO HEMO Y SU FUNCIÓN EN LAS CATALASAS
La localización del hemo y su ambiente están muy conservados en las catalasas. El hemo no
está unido covalentemente y se encuentra enterrado entre el barril β y dos hélices (α4 y α12).
La distancia del hemo a la superficie del tetrámero es de aproximadamente 20 Å. Los grupos
propionato del hemo están enterrados y estabilizados por puentes salinos con tres argininas
conservadas. En la PVC, la HPII, la CAT- 1 y la CatF el hemo está invertido, esto es, está rotado
180° con respecto al hemo de las catalasas BLC, PMC, MLC, SSCA y HEC, ( Díaz A, Rudiño-Piñera
E, Arreola R, Horjales E y Hansberg W. Manuscrito en preparación), de tal manera que los
grupos metilo y vinilo de los anillos I y II cambian sus posiciones La CatF de P. syringae es la
única catalasa pequeña en donde se describe la inversión del hemo

La inversión del hemo también se ha descrito en otras hemoproteínas como la mioglobina y el

citocromo b5. Se desconoce si la inversión del hemo en las catalasas tiene un efecto funcional.
El hemo divide la cavidad donde se encuentra en dos: la parte proximal está más cerca de los
ejes de simetría de la molécula y la distal más alejada del centro y más próxima a la superficie.
Hay tres aminoácidos esenciales involucrados en la catálisis: una His y un San en el lado distal y
una Tyr en el lado proximal del hemo. El oxígeno de la Tyr esencial se coordina con el FeIII del
hemo. El lado distal de la cavidad del hemo es muy hidrofóbico y tiene varias Phe conservadas.
Otro aminoácido hidrofóbico importante en el lado distal del hemo es el que precede a la His
esencial, el cual es una valina en PVC, BLC, HPII, SCCA, HEC y CAT-1, una Met en PMC y una cis-
Pro en MLC. Este aminoácido está en contacto directo con el anillo del hemo y en la PMC la
metionina está oxidada formando una metionina sulfona. La sulfona impide el acceso de
algunos compuestos grandes al sitio activo. Al cambiar la valina 111 por una alanina en la
SCCA, la enzima tiene una actividad de catalasa reducida pero la actividad de peroxidasa
aumenta para los sustratos grandes. En la cavidad distal del hemo de todas las estructuras de
catalasas existen moléculas de agua que están relativamente fijas. El sustrato llega al sitio
activo a través de un canal hidrofóbico de 25 Å de largo que está lleno de moléculas de agua.
En la HEC se propone un mecanismo denominado “la regla molecular” para seleccionar al
H2O2.
 2. ESTRUCTURA CRISTALOGRÁFICA DE LA CATALASA
Las catalasa-peroxidasas (CP´s) son enzimas
bifuncionales que han sido consideradas de interés por
dos razones, la primera es que son las únicas
peroxidasas con alta actividad de catalasa y la segunda
por su participación en la activación del fármaco anti-
tuberculosis llamado isoniazida. El plegamiento y la
arquitectura del sitio activo de las CP’s son típicos de
una peroxidasa. Sin embargo, mientras las peroxidasas
se presentan como monómeros, las CP´s son
homodímeros u homotetrámeros. Cada subunidad está
formada por un dominio N-terminal y otro C-terminal. El
sitio activo de las CP’s es un protohemo IX localizado en el dominio Nterminal, que presenta
una triada altamente conservada His/Trp/Asp, donde el Trp forma un aducto covalente con los
residuos Tyr/Met encargados de la actividad catalítica de la enzima. Además, las CP’s
presentan tres asas largas denominadas LL1, LL2 y LL3, de las cuales LL1 y LL2 se encargan de
restringir el paso del sustrato al centro activo. Hasta la fecha son pocos los estudios
bioquímicos reportados para CP´s y sólo están depositadas seis estructuras cristalográficas en
el PDB (Protein Data Bank), cuatro son de bacterias, una de arquea y una de eucariontes. Por lo
anterior, en este trabajo se planteó como objetivo principal cristalizar la CP de Neurospora
crassa denominada CAT-2. Previamente se clonó el gen de la CAT-2 en el vector pTYB1 y se
expresó en Escherichia coli. Posteriormente la enzima fue purificada por cromatografía con
una columna de afinidad. También se utilizó una columna de intercambio aniónico o una
columna de exclusión molecular. Se determinó el punto isoeléctrico de la enzima utilizando un
equipo Phastsystem obteniendo un valor de pI experimental de 5, que es similar al teórico. Los
análisis de dispersión dinámica de luz (DLS) mostraron la capacidad termoestable de la CAT-2
en altas temperaturas (40°C), además de revelar la pureza de la muestra ya que durante estos
ensayos la enzima se mantuvo homogénea y monodispersa en solución, aún con la
implementación de tres amortiguadores diferentes. Se realizaron pruebas de cristalización de
la CAT-2 con el método de “batch” y también pruebas de gota colgante y gota sentada
utilizando el robot de cristalización “Mosquito LCP”. Una vez que se encontraron las
condiciones de cristalización se realizaron matrices de optimización y escalado, en las que se
varió la concentración de las soluciones madre con el fin de conseguir mejores cristales. De los
cristales que se obtuvieron, nueve fueron congelados y difractados en líneas de los
sincrotrones de Brookhaven y Stanford. Así, se comprobó que eran cristales de la enzima.
Aunque desafortunadamente ninguno presentó la calidad suficiente para realizar una colecta
de datos y determinar la estructura cristalográfica de la CAT-2. Con el fin de conocer más sobre
la CAT-2 se realizaron dos análisis de su secuencia utilizando los programas XtalPred y
ProtParam. Los resultados de XtalPred indicaron que la CAT-2 es una enzima difícil de
cristalizar, ya que presenta regiones desordenadas en su secuencia. Con ProtParam se
determinaron algunos parámetros teóricos de la CAT-2, como la masa molecular y la pi.
También, su secuencia fue alineada con las secuencias de las otras CP´s que tienen
determinada su estructura cristalográfica utilizando el programa BioEdit para identificar los
residuos de aminoácidos importantes en la CAT-2. Asimismo a estas secuencias se les realizó
un análisis de BLAST para determinar el porcentaje de identidad entre la CAT-2 y otras CP’s.
Finalmente, se generó un modelo tridimensional con la secuencia de la CAT-2, con el fin de
analizar algunas características de la enzima
 3. IMPORTANCIA BIOMEDICA DE LA CATALASA

-La CAT ha sido ampliamente estudiada en relación con su participación en numerosos

procesos patológicos de gran importancia en las investigaciones biomédicas, y está involucrada
tanto en la génesis como en las consecuencias de dichos procesos.

-En modelos animales y humanos de isquemia-reperfusión se ha comprobado la participación

de las EROS en la producción de los daños que aparecen durante este proceso, así como la
modificación de las enzimas antioxidantes, entre las que se encuentra la CAT, y se ha
observado que estas modificaciones no se comportan de igual forma en todos los tejidos.

-En estudios realizados en riñón, la reperfusión que siguió al daño isquémico provocó una
pérdida de proteínas de la matriz de los peroxisomas, con drástico compromiso de las
funciones de éstos y descenso significativo de la actividad de CAT. La disminución de la
actividad durante la isquemia se debe a la formación de un complejo inactivo, mientras que
durante la reperfusión hay inactivación, proteólisis o disminución de la síntesis de la enzima.

-La reperfusión es, sin duda, la forma más efectiva para tratar la isquemia del miocardio, sin
embargo, puede causar profundos daños tisulares. La producción miocárdica de EROS que
sobrepasa la capacidad neutralizadora de los miocitos es una causa importante de este daño.
Hay evidencias de que la isquemia prolongada reduce los mecanismos de defensa contra estas
especies reactivas. El pretratamiento con derivados no tóxicos de endotoxinas induce la
protección contra el daño y aumenta la actividad de la CAT.

-Estudios recientes muestran que la CAT y las SOD, administradas de forma independiente
durante la reperfusión cardíaca, reducen significativamente la producción de EROS, pero fallan
ante la producción de arritmias ventriculares inducidas por la reperfusión. Ambos efectos
pueden eliminarse cuando las 2 enzimas se aplican juntas.

-La acción de la CAT puede suprimir el incremento de CA++ intracelular que se produce a través
del aumento del H2O2 provocado por el daño isquémico a nivel miocárdico.

-durante los trasplantes cardíacos tiene lugar una isquemia prolongada seguida de reperfusión
con sangre oxigenada, produciéndose un aumento en los niveles de las EROS, lo que trae como
consecuencia un desacoplamiento de los procesos de contracción- -excitación a nivel del
sarcolema. La CAT y las SOD pueden preservar la función del metabolismo miocárdico durante
el trasplante.

-Se ha encontrado que después de quemaduras severas existe un incremento del catabolismo
proteico con la consiguiente disfunción hepática, lo cual puede reducirse administrando
enzimas antioxidantes como la CAT.

-Numerosos estudios han relacionado la infertilidad masculina con una disminución de la

motilidad de los espermatozoides, lo que parece estar causado por un aumento de especies
reactivas, sobre todo de H2O2. Este puede ser reducido por acción de la CAT, lo cual se propone
como posible tratamiento en estos casos.

-Se han realizado estudios que plantean la inducción de proteínas del shock térmico (HSP)
como responsables de enfermedades neurodegenerativas como la enfermedad de Alzheimer.
La síntesis de HSP es inducida por las EROS y se observa que una exposición a éstas en
presencia de enzimas antioxidantes como la CAT y las SOD mejora la supervivencia de las
células y disminuye la inducción de HSP.

-En relación con las afecciones tumorales se ha encontrado en pacientes con tumores del
tracto gastrointestinal un aumento de la actividad de CAT en los estadios iniciales del proceso.
Esta actividad disminuía y llegaba a ser mínima en estadios de metástasis diseminada y
caquexia.24

-Otros estudios con modelos experimentales han mostrado el importante papel que juegan las
EROS en la invasión tumoral y las metástasis y se ha observado que la administración de CAT
podía inhibir la formación de metástasis.

-Estos hallazgos permiten considerar que la participación de los sistemas antioxidantes en el

mantenimiento del balance oxidante/antioxidante constituye un elemento esencial para el
control de numerosos procesos biológicos cuyas alteraciones pueden originar o ser
consecuencia de trastornos somáticos en un individuo.

4. DEFINA
*UNIDAD INTERNACIONAL DE ENZIMAS:
Se define la unidad de actividad enzimática (U) como la cantidad de enzima que cataliza la conversión de 1
µmol de sustrato en un minuto. La actividad específica es el número de unidades de enzima por miligramo
de proteína (U/mg prot) o por mililitro de disolución (U/ml).
Recientemente, el Sistema Internacional de unidades (SI) ha definido la unidad de actividad enzimática como
la cantidad de enzima que transforma 1 mol de sustrato por segundo. Esta unidad se llama katal (kat). Como
1 mol son 10 µmoles y 1 minuto son 60 segundos, resulta que 1 katal equivale a 60 x 106U. Esta unidad es
muy grande, de forma que se utilizan frecuentemente los submúltiplos como el microkatal (µkat, 10-6 kat) o
el nanokatal
(Nkat, 10-9kat).
Cuando se conoce el peso molecular del enzima puro y el número de centros activos por molécula de
enzima, las medidas de actividad enzimática permiten calcular el número de recambio del enzima, o sea, el
número de reacciones elementales que realiza el enzima por cada centro activo y por unidad de tiempo.

*MUTASA:
Es una enzima isomerasa que cataliza la octava etapa de la glicólisis. Cataliza la transferencia interna
de un grupo fosfato desde el carbono C-3 al carbono C-2 que resulta en la conversión de 3-
fosfoglicerato a 2-fosfoglicerato a través del compuesto intermedio 2,3-bisfosfoglicerato. La reacción
implica a dos grupos fosfato diferentes, es decir el grupo fosfato final del 2-fosfoglicerato no es el
mismo que el grupo fosfato inicial del 3-fosfoglicerato.
*INMUNOADSORBENTES:
Soporte insoluble para un Antígenos O Anticuerpos que se utiliza en Cromatografía de
Afinidad para adsorber el anticuerpo o antígeno homólogo de una mezcla. Se usan muchas
sustancias diferentes, como la Sefarosa, GLUTARALDEHIDO, copolímeros de Anhídridos,
poliacrilamidas, etc.

*KCAT:
Soporte insoluble para un Antígenos O Anticuerpos que se utiliza en Cromatografía de Afinidad
para adsorber el anticuerpo o antígeno homólogo de una mezcla. Se usan muchas sustancias
diferentes, como la Sefarosa, GLUTARALDEHIDO, copolímeros de Anhídridos, poliacrilamidas,
etc..

*COMPOSICION ENANTIOMERICA
Los enantiómeros tienen las mismas propiedades químicas y físicas, a excepción de su
respuesta ante la luz polarizada (actividad óptica). Por ello se les denomina isómeros ópticos.
... La medida de la rotación específica indica la composición enantiomérica del producto.

Las dos formas enantiómeras tienen las mismas propiedades físicas excepto la interacción con
la luz polarizada en un plano. Puede ser que un isómero desvíe el plano de polarización hacia la
derecha, mientras el otro isómero lo desvíe en la dirección contraria; sin embargo, esta
propiedad óptica no está relacionada en absoluto con el tipo de enantiómero, es decir, si la
molécula es un enantiómero D o L, sino con el carácter levógiro o dextrógiro de la molécula;
pudiendo ser L-dextrógiro o L-levógiro o un D-dextrógiro o D-levógiro.

Los dos enantiómeros de la talidomida: la (R)-(+)-talidomida es sedante y no teratógena; su

isómero óptico, la (S)-(–)-talidomida presenta acción teratógena.

También tienen las mismas propiedades químicas, excepto si reaccionan con otras moléculas
quirales. De hecho, los enantiómeros son moléculas quirales. Por eso, presentan actividad
biológica muy diferente ya que la mayoría de las moléculas presentes en los seres vivos son
quirales. Por ejemplo, la R(-)adrenalina es más potente que la S(+)adrenalina.

*ACTIVIDAD MOLECULAR
La actividad molecular es el número de moléculas de sustrato transformadas por minuto por
una sola molécula de enzima(o por un solo centro activo), cuando la enzima es el factor
limitante de la velocidad, se basa en la Vmax y tiene unidades de recíproco de tiempo (min.-1).

La actividad específica es el número de unidades de enzima por miligramo de proteína (una

unidad enzimática se define como la cantidad de enzima que origina la transformación de un
micromol de sustrato por minuto a 250c en condiciones óptimas de medida). La actividad
específica constituye una medida de la pureza de la enzima, aumenta durante el proceso de su
purificación y llega a ser máxima y constante cuando ésta se halla en estado puro. La forma más
usada de expresión de la actividad específica es la de micromoles de producto formado por
minuto por miligramo de proteína.

Aunque estas definiciones son sugeridas por la Comisión de Enzimas, no siempre seguidas, como
en el caso de preparaciones crudas. Cada investigador aplica su propia definición de unidad de
enzima y es necesaria una interconversión cuidadosa para comparar diferentes preparaciones
de la misma enzima. En esta práctica la actividad de la catalasa se expresará como el número de
micromoles de peróxido de hidrógeno transformado por minuto a 0 C, por ml de sangre.

La actividad de los preparados de catalasa se mide de diversas formas, casi siempre sujetas a
errores. Un método conveniente consiste en medir el peróxido de Hidrógeno no atacado por la
enzima, mediante titulación con Permanganato de Potasio, después de incubar la enzima (por
cinco minutos) sobre una solución diluida de peróxido de Hidrógeno, (la reacción se detiene
añadiendo ácido sulfúrico que destruye a la enzima).

5. EXPLIQUE MÉTODOS DE EXTRACCIÓN Y ENSAYO DE

ACTIVIDADES ENZIMÁTICAS EN VEGETALES
lipasas y pectinoesterasa se elaboran apartir de soya, ricino y frutas cítricas; del germen
detrigo se extrae la alfa-amilasa. las proteasas se obtienen de la papaya, del higo, de la piña y
laperoxidasa, del rábano picante.

Alinasa:

se encuentra en la cebolla y en el ajo, es la encargada de desarrollar sabores y olores

característicos cuando el tejido se daña mecánicamente

Mirosinasa:

se encuentra en los rábanos y la mostaza, su acción es la de convertir los tioglucósididos en

isotiocianatos y carbohidratos, cuando el producto sufre daños físicos en su tejido, los
tioglucósidos actuan siendo los responsables del aroma , se recomienda que para mantener el
aroma se deben cosechar y consumir

Peroxidasa:

La pectinmetil estereasa provoca la formaciónde un numero mayor de grupos carboxilo

capaces de interaccionar con el calcio y crear estructuras más rígidas que aumentan la dureza
de los frutos por esta razón , enciertos casos es práctica comun la adición de calcio para
mantener la textura de los productos sobre todo los que son tratados termicamente.
VIII. BIBLIOGRAFIA:
 Díaz A, Rudiño-Piñera E, Arreola R, Horjales E y Hansberg W. Manuscrito en
preparación
 Hansberg, T. W. (2002). Biología de las especies de oxígeno reactivas. Mensaje
bioquímico 26, 19-54.
 Rivera, C. A. P.; Restrepo, P.; Narváez, C. C. E. (2004). Polifenoloxidasa y
peroxidasa de pulpa de uva caimarona (Pourouma cecropiifolia). Rev.Col.
Quim. 33 57-66
 Rubio, M. E. Estudio del cambio de actividad de polifenoloxidasa, PFO, durante
el proceso de maduración del lulo (Solanum quitoense L.). Tesis de Maestría.
Departamento de Química, Facultad de Ciencias, Universidad Nacional de
Colombia, Bogotá, Colombia, 1999.
 Narváez, C. C. E. Evaluación del comportamiento fisiológico del fruto de uva
caimarona (Pourouma cecropiifolia) a temperatura ambiente y a temperaturas
de refrigeración. Tesis de Maestría. Departamento de Química, Facultad de
Ciencias, Universidad Nacional de Colombia, Bogotá, Colombia, 2002.