Anda di halaman 1dari 16

Marker Assisted Selection

11.2.1 Dasar Pemikiran Marker Assisted Selection

A. DEFINISI

 Marker assisted selection (MAS): merupakan metode seleksi yang mengacu


pada pemanfaatan marka DNA yang berpautan dengan lokus target, sebagai
alat untuk menduga dan membantu seleksi penotipe sifat yang menjadi target
pemuliaan.
 Asumsi: Marka DNA mampu menduga secara akurat keberadaan suatu
penotipe.
 Kriteria marka genetik:
o Marka harus mampu membedakan kedua tetua
o Ciri marka diwariskan secara sama dan akurat dari tetua ke turunannya.
 Jenis Marka:
o Marka dominan (dominant marker) dapat menandai adanya lokus target,
tetapi tidak bisa membedakan homozigot dengan heterozigot.
o Marka ko-dominan (co-dominant marker) dapat menandai adanya lokus
target homozigot atau lokus target heterozigot

B. TIPE-TIPE MARKA DNA

 Marka Situs Acak


1. Random Amplified Polymorphism DNA (RAPD)
2. Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP)
3. Amplified Fragment Length Polymorphism (AFLP)
4. Simple Sequence Repeat (SSR)/ Microsatellites
 Marka Situs Spesifik
1. Sequence Characterized Amplification Region (SCAR)
2. Expressed Sequence Tags (EST)
3. Single Nucleotide Polymorphism (SNP)
C. KEUNTUNGAN MAS

 Lebih sederhana dibandingkan seleksi fenotifik


o Terutama untuk sifat yang membutuhkan banyak tenaga dan langkahnya
rumit
o Dapat menghemat waktu dan sumberdaya
 Dapat dilakukan pada fase awal perkembangan
o Penting untuk sifat kualitas hasil
o Dapat dilakukan seleksi pada tahap bibit
 Meningkatkan akurasi
o Tidak dipengaruhi lingkungan
o Dapat memisahkan homozigot dan heterozigot

D. PERTIMBANGAN PENGGUNAAN MARKA DNA

 Metode teknis
o sederhana atau rumit
 Akurasi
 Tipe polimorfisme
o tinggi atau rendah
 Tipe dominansi
o dominan atau ko-dominan
 Kualitas dan kuantitas DNA yang dibutuhkan
 Biaya**
 Ketersediaan sumberdaya
o peralatan, kemampuan tenaga pelaksana
E. PAUTAN MARKA DNA DENGAN LOKUS TARGET

11.2.2 Skema Marker Assisted Selection

Tahap aplikasi MAS:

1. Marker-assisted backcrossing
2. Piramidanisasi
3. Seleksi Generasi Awal
4. Kombinasi dengan seleksi fenotifik

1. Marker-assisted backcrossing (MAB)

 Marka DNA digunakan untuk seleksi lokus target dari penotipe tanaman yang
paling sesuai dengan tetua donor.
 Keuntungan MAB dibandingkan backcross biasa:
o Seleksi lokus target lebih akurat
o Minimalisasi pautan negatif
o Mempercepat recovery tetua donor
2. Piramidanisasi

 Digunakan untuk mengkombinasikan banyak gen tahan yang bersifat vertikal


(bersifat spesifik untuk suatu ras), misalnya ketahanan terhadap Blast
dikendalikan banyak gen yang sepisifik untuk satu ras.
 Piramidanisasi sangat sulit dilakukan dengan metode konvensional
o Harus diperhitungkan kesulitan seleksi penotipik terhadap sifat ketahanan
yang dikendalikan oleh ~30 gen seperti pada kasus ketahanan terhadap
Blast.
 Sangat penting untuk merakit genotipe yang tahan terhadap banyak ras seperti
pada kasus ketahanan terhadap penyakit Pirycularia griseae

3. Seleksi generasi awal

 MAS dilakukan pada tahap F2 atau F3


 Individu yang membawa lokus target dipilih yang memiliki alel homozigot
o Individu yang tidak terpilih dapat segera di pisahkan, sehingga hanya
mengelola tanaman yang membawa lokus target
 Karena pemilihan akurat pada tahap awal memungkinkan penghematan
sumber daya karena jumlah galur yang dikelola lebih sedikit
4. Pendekatan Kombinasi dengan Seleksi Fenotipik

Pada beberapa kasus kombinasi pemilahan fenotifik dengan MAS lebih efektif:

1. Untuk memaksimalkan genetic gain (bila QTL belum diperoleh dari pemetaan
QTL)
2. Tingkat akurasi marka DNA kurang tinggi (Jarak genetik lebih dari 5 cm).
3. Untuk mengurangi ukuran populasi apabila aplikasi marka DNA lebih murah
daripada pemilahan penotifik.
‘Marker-directed’ phenotyping (Seleksi Tandem)

11.2.3 Aplikasi Marker Assisted Selection

A. Hambatan aplikasi MAS bagi pemuliaan:

 Sumberdaya (peralatan) tidak tersedia


 Marka tidak efektif dari segi biaya
 Akurasi hasal pemetaan QTL (quantitative traits loci)
 Pengaruh QTL tergantung latar belakang genetik (genetic background), atau
masih dipengaruhi lingkungan
 Terbatasnya marka DNA yang polimorfis
 Kurang terintegrasinya pendekatan genetika molekular dengan pemuliaan
konvensional

B. Biaya merupakan hambatan terbesar:

 Efisiensi biaya aplikasi MAS (Marker Assisted Breeding) jarang dihitung, namun
biasanya biaya MAS lebih mahal untuk sebagian besar sifat, kecuali sifat
kualitas kimiawi produk (kandungan protein, kandungan vitamin, kandungan
asam lemak).
 Biaya ditentukan oleh:
o Sifat dan metode pemilahan penotif
o Biaya penanaman di rumah kaca/lapang
o Biaya tenaga kerja
o Tipe marka yang digunakan
 Marka DNA biasanya untuk gen major, marka QTL lebih sulit untuk
dikarakterisasi
C. Akurasi pemetaan QTL merupakan faktor kunci keberhasilan MAS:

 Akurasi data penotifik sangat kritikal


o Membutuhkan pengulangan dalam berbagai lingkungan tumbuh
 Hasil pemetaan QTL perlu dikonfirmasi pada populasi lain yang terpisah latar
belakang genetiknya.
 Harus dilakukan Validasi Marka:
o Pengujian akurasi marka dalam menduga penotif
o Pengujian tingkat polimorfisme marka
 Pengaruh Latarbelakang genetik perlu diperhitungkan.

D. Tantangan ke depan:

 Meningkatkan efisiensi biaya


o Optimasi, penyederhanaan teknik dan metode, inovasi marka baru yang
lebih murah dan efisien.
 Merancang strategi MAS yang lebih efesien dan efektif
 Integrasi yang lebih erat antara pendekatan genetika molekuler dengan
pemuliaan tanaman
 Perbaikan manajemen data
- MARKA MOLEKULER -
Menurut Semagn et al (2006), definisi marka (penanda) molekuler adalah
sekuen DNA yang dapat diidentifikasi, dan terdapat pada lokasi tertent pada genom,
dan dapat diwariskan dari satu generasi ke generasi berikutnya. Ibaratnya sebuah
barcode, keberadaan marka molekular tersebut secara prinsip memiliki perbedaan,
sehingga untuk memilih dan pengaplikasian harus dengan hati-hati. Definisikan marka
genetik merupakan gen yang terekspresi dan membentuk fenotip, biasanya mudah
dibedakan, digunakan untuk identifikasi individu atau sel yang membawanya, atau
sebagai probe untuk menandai inti, kromosom, atau lokus.
Kemudian Recee and Haribabu (2007) berpendapat bahwa marka molekuler
adalah DNA yang teridentifikasi, ditemukan pada lokasi tertentu pada genom,
diwariskan dari generasi ke generasi berukutnya dengan mengikuti hukum pewarisan
sifat. Sehingga dari beberapa pengertian tersebut dapat disimpulakan pengertian
Marker molekular merupakan sekuen DNA yang teridentifikasi pada genom dan dapat
diwariskan dari satu generasi ke generasi berikutnya dengan mengikuti hukum
pewarisan sifat.
Marker molekular dapat dinggap sebagai bagian yang tidak mudah mengalami
perubahan akibat aktifitas genetik seperti mutasi dan insersi atau proses seleksi alam.
Sehingga pada proses evolusi daerah tersebutlah yang tetap akan diwariskan oleh
ancestor (leluhur) kepada keturunan berikutnya. Marka molekular memiliki beberapa
kelebihan antara lain:

1. Marka molekular tidak dipengaruhi oleh faktor lingkungan yang sangat bervariasi
sehingga marka molekular merupakan daerah yang conserve.
2. Marka molekular terdapat pada semua genom, sehingga banyak ditemukan pada
semua genom individu yang akan dilihat polimorfismenya.
3. Marka molekular sangat conserve sehingga perubahan yang terjadi sangatlah
sedikit, maka dapat dijadikan penanda bahwa organisme tersebut masih dalam
satu kelompok atau tidak dilihat dari marke tersebut.
Marker molekular pada aplikasinya sangatlah beragam, sehingga untuk memilih
Marka molekular harus disesuaikan dengan organisme yang akan diteliti dan pada DNA
mana yang akan dianalisis sekuennya. Marker molekular dapat diaplikasikan pada
beberapa genom DNA yang terdapat pada nukleus, mitokondria, kloroplas, atau organel
lain (Recee and Haribabu, 2007).
Menurut Varma (2011) pemilihan marka berdasarkan atas mode pewarisan,
sensitivitas, perbandingan terhadap suatu masalah, dan reprodusibilitas. Marka
molekular dibagi atas marka dominan dan marka kodominan. Marka ko-dominan
adalah salah satu marka yang dapat mengidentifikasi semua alel yang ada pada suatu
lokus tertentu, sedangkan marker dominan hanya mengungkap alel dominan tunggal
saja tetapi pada lokus yang sama. Data ko-dominan umumnya lebih tepat daripada data
dominan tetapi marka dominan biasanya membutuhkan waktu lebih cepat dan lebih
mudah mendapatkan data. Macam-macam marka (penanda) molekular yang sering
digunakan yakni marka mtDNA, single nucleotide
polymorphisms (SNPs), allozyme, restriction fragment length
polymorphisms (RFLPs), microsatellite atau simple sequence repeats (SSRs), random
amplified polimorphic DNA (RAPD), dan amplified fragment length
polymorphisms (AFLPs). Berikut adalah penjelasan jenis marka (penanda) molekuler
beserta penjelasan:

1. Marka Molekuler mtDNA


Polimorfisme DNA mitokondria (mtDNA) digunakan dalam filogenetik dan analisis
diversitas genetik. Haploid mtDNA dibawakan oleh mitokondria di dalam sitoplasma,
pewarisan maternal dan laju mutasi yang tinggi. Polimorfisme dalam urutan daerah
hipervariabel dari D-loop atau kontrol daerah mtDNA telah memberikan kontribusi besar
terhadap identifikasi nenek moyang liar dari spesies domestik, pembentukan pola
geografis keanekaragaman genetik, dan pemahaman domestikasi ternak.
Adanya mtDNA dapat menggambarkan bahwa perkembangan sekuens DNA yang
informatif mampu menjawab level populasi. Marka ini digunakan untuk mempelajari
filogeografi intraspesifik yang fokus pada pola hasil variasi dari salah satu sejarah atau
barrier untuk aliran gen dalam populasi, yang diinisialkan dengan penggunaan mtDNA.
Sekuens mtDNA dibatasi oleh mtDNA genom yang terdiri dari pewarisan lokus
uniparental tunggal. Perluasan penggunaan marker mtDNA (Gambar 1) yaitu
marka ribosomal DNA (12S rDNA dan 16S rDNA), marka pengkode gen protein (antara
lain: cytochrome b, cytochrome oksidase subunit I dan II, NADH dehydrogenase
subunit), dan kontrol region marker.
Gambar 1. Marka molekuler mtDNA.
2. Marka Molekuler Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs)
Marka ini merupakan mutasi titik dimana satu nukleotida disubstitusi oleh nukleotida lain
pada lokus tertentu. SNP merupakan tipe yang lebih umum untuk membedakan sekuen
diantara alel, kodominan di alam, dan menandakan marka polimorfik dari suatu sumber
yang tidak pernah habis untuk penggunannya pada resolusi tinggi dalam pemetaan
genetik suatu karakter (Gambar 2). Deteksi marka SNP bersifat kodominan, hal ini
didasarkan pada amplifikasi primer yang memiliki basis pada informasi sekuen untuk
gen yang lebih spesifik. Kelebihan dari teknik SNP adalah lebih mudah diterapkan jika
dibandingkan dengan teknik SSR maupun AFLP. Selain itu kelebihannya adalah lebih
berguna pada beberapa lokus SNP yang memiliki posisi yang sangat berdekatan yang
dapat mendefinisikan adanya haplotipe dan pengembangan haplotype tags.
Kekurangan marka molekuler SNP adalah membutuhkan informasi sekuen genetik
untuk suatu gen yang menjadi target analisis serta membutuhkan pengadaan alat dan
bahan yang membutuhkan biaya tinggi (Azrai, 2005).
Gambar 2. Informasi urutan DNA untuk identifikasi SNP pada tingkat variasi individu
dengan spesies yang sama.

3. Marka Molekuler Restriction Fragment Length Polymorphisms (RFLPs)


Marka (penanda) molekuler RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) adalah
marka (penanda) ko-dominan, sangat dapat dipercaya dalam
analisis linkage dan breeding serta dapat ditentukan dengan mudah jika karakter
terdapat dalam bentuk homozigot atau heterozigot. Keunggulan dari marka RFLP
(Gambar 3) adalah konsistensi yang tinggi, sifat pewarisan ko-dominan, dapat diulang
antar laboratorium, memberikan marka pada lokus yang spesifik, tidak memerlukan
informasi sekuen, dan relatife mudah dilakukan scoring karena adanya perbedaan yang
cukup besar antar fragmen. Akan tetapi penerapan RFLP memerlukan DNA dalam
jumlah yang cukup besar untuk proses pemotongan dengan enzim restriksi. Selain itu,
penggunaan digunakan isotop radioaktif dengan harga yang relatif mahal serta
berbahaya, dan waktu yang diperlukan untuk pengujian juga cukup lama (Varma,
2011).
Gambar 3. Proses pemotongan urutan DNA dengan enzim restriksi berdasarkan marka
molekuler RFLP.
Keterbatasan RFLP dikarenakan beberapa faktor (1) pada beberapa spesies tingkat
polimorfisme DNA-nya sangat rendah, (2) menyita banyak tenaga dan waktu, (3)
kuantitas dan kualitas DNA yang diperlukan sangat tinggi, (4) prosedur hibridisasinya
rumit sehingga menyulitkan otomatisasi, dan (5) membutuhkan koleksi probe untuk
spesies yang belum pernah dieksplorasi sebelumnya.

4. Marka Molekuler Mikrosatelit atau Simple Sequence Repeats (SSRs)


Marka mikrosatelit yang juga dikenal dengan Simple Sequence Repeats (SSRs) adalah
kelas terkecil dari sekuen berulang (Gambar 4). Marka molekuler SSR adalah salah
satu marka yang telah dikembangkan pada komoditas tanaman pangan dan
perkebunan, marka molekuler ini telah dibuktikan memiliki keefektifan yang baik untuk
proses pengorganisasian meteri genetik berdasarkan jarak genetik serta pemetaan gen.
Pada saat ini SSRs merupakan marka yang banyak dipilih oleh peneliti genetika
molekuler karena sifatnya sangat polimorfik bahkan untuk spesies maupun galur yang
memiliki hubungan kekerabatan yang dekat; membutuhkan DNA dalam jumlah kecil;
dan dapat dilakukan secara otomatis.
Gambar 4. Contoh urutan sekuens (urutan) DNA pada mikrosatelit tanaman.
Kelebihan dari marka SSRs yakni:

1. Metode yang digunakan relatif sederhana serta dapat dikerjakan secara otomatis.
2. Memiliki marka yang kebanyakan monolokus serta mengikuti sistem hereditas
Hukum Mendel.
3. Terdapat kandungan informasi yang lebih mendalam.
4. Melimpahnya pasangan primer SSR yang cukup banyak di pasaran.
5. Biaya lebih efesien pergenotipe dan primernya.

5. Marka Molekuler Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD)


Penanda molekular RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) adalah aplikasi PCR
yang digunakan untuk untuk mendeteksi adanya suatu polimorfisme DNA dalam suatu
populasi atau antarpopulasi. Penanda RAPD pertama kali ditemukan untuk mendeteksi
adanya polimorfisme dalam suatu segmen DNA. Teknik PCR RAPD dapat mendeteksi
DNA polimorfik yang disebabkan oleh tidak adanya amplifikasi pada suatu lokus yang
disebabkan oleh adanya perbedaan urutan basa nukleotida pada titik penempelan
primer. Hal ini akan menyebabkan primer tidak dapat menempel pada bagian tersebut
sehingga tidak terjadi amplifikasi. Polimorfisme yang dihasilkan dengan teknik PCR
RAPD disebabkan adanya perubahan basa nukleotida, delesi, dan insersi (William et
al., 1990; Semagn et al., 2006).

Prinsip kerja dari metode PCR RAPD adalah mengaplikasikan PCR dengan cara
mengamplifikasi urutan nukleotida dengan menggunakan primer acak. Primer yang
digunakan adalah oligonukleotida yang terdiri dari 5–10 nukleotida. Keunggulan dari
teknik PCR RAPD adalah hanya dibutuhkan kuantitas sampel DNA yang sedikit, hemat
biaya, mudah dipelajari, dan primer yang mudah didapatkan. Sedangkan kelemahannya
adalah tingkat reproduksibilitasnya rendah, sensitif terhadap variasi konsentrasi DNA,
dan memerlukan optimasi suhu dan primer pada saat pengujian (Azrai, 2005;
McPherson & Møller, 2006).
Beberapa faktor yang mempengaruhi reproduksibilitas reaksi PCR RAPD adalah
kualitas dan kuantitas DNA, buffer PCR, konsentrasi MgCl2, rasio primer terhadap
template, suhu annealing, enzim Taq polimerase, dan mesin PCR yang digunakan.
Namun untuk mengurangi hal tersebut dapat diatasi dengan memenuhi standar
protokol ekstraksi DNA untuk meminimalisir kontaminan, melakukan optimasi,
melakukan seleksi primer dengan reproduksibilitas pita yang tinggi, dan menggunakan
bahan PCR yang terpercaya (Wolff et al., 1993; Semagn et al., 2006).
Metode RAPD mampu mendeteksi adanya polimorfisme pada DNA antarspesies
maupun antarpopulasi berdasarkan pita hasil amplifikasi pada suatu lokus di untaian
DNA. Adanya pita polimorfik pada hasil amplifikasi menunjukkan adanya perbedaan
komponen nukleotida. Dalam untaian DNA, nukleotida yang berbeda bisa dikarenakan
adanya peristiwa delesi maupun insersi pada DNA. Faktor tersebutlah yang
menyebabkan pita RAPD menunjukkan hasil polimorfik. Data pita DNA yang diperoleh
pada umumnya akan dianalisa dengan menggunakan data biner dengan melakukan
skoring, yakni skor 1 untuk pita yang muncul dan skor 0 untuk pita yang tidak muncul.
Hal inilah metode penggunaan RAPD disebut dengan sifat dominan karena hanya
mendeteksi alel per lokus (Willian et al., 1992; Naurala & Srivastava, 2005). Selanjutnya
hasil skoring tersebut dapat dianalisis sesuai dengan kebutuhan dengan menggunakan
bantuan software komputer seperti program GenAlEx (Peakall & Smouse, 2007) dan
program POPGENE (Yeh et al., 1999).
Pemanfaatan penanda molekular dengan teknik PCR RAPD banyak dilakukan
untuk kegiatan pemuliaan tanaman yakni menyeleksi tanaman krisan hibrida (Huang et
al., 2000) dan analisis variasi somaklonal dan karakter molekular pada kulitivar
tanaman krisan (Minano et al., 2009). Mendeteksi adanya efek mutagenesis pada kultur
embrio kedelai (Hoffmann et al., 2004), mengidentifikasi keragaman genetik
antarkultivar barley (Fernández et al., 2002), mengkonstruksi peta interspesifik pada
genom tomat (Saliba-Colombani et al., 1999), dan mendeteksi polimorfisme pada
tanaman jarak akibat radiasi sinar gamma (Dhakshanamoorthy et al., 2010). PCR
RAPD juga digunakan untuk analisis molekular persilangan interspesifik pada tanaman
mawar (Kaul et al., 2009), mengetahui segregasi F1 persilangan interspesifik pada
tanaman anggur (Luo, 2002) dan juga digunakan untuk identifikasi gen resisten
tanaman kacang hijau terhadap penyakit (Ferreira, et al., 2000).

6. Marka Molekuler Amplified Fragment Length Polymorphisms (AFLPs)


AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphisms) adalah marka molekuler yang
didasarkan adanya amplifikasi yang selektif yang berasal dari potongan DNA. Potongan
tersebut merupakan hasil restriksi dari total suatu genom dengan menggunakan enzim
restriksi endonuklease (Gambar 5). Hasil amplifikasi tersebut kemudian dipisahkan
dengan metode elektroforesis dan selanjutnya dianalisis dengan menggunakan
otoradiografi atau pewarnaan perak. Marka molekuler AFLP dapat dikategorikan
sebagai marka kodominan meskipun pada seringkali dianggap sebagai marka dominan.
Hal tersenut dikarenakan adanya kesulitan dalam membedakan intensitas pita hasil
analisis antara dominan homozigot dan heterozigot.
Gambar 5. Prosedur AFLP.

Anda mungkin juga menyukai