STERILISASI DAN PEMBUATAN MEDIA

I. TUJUAN

Melakukan pembuatan media dan mempersiapkan peralatan untuk kerja

mikrobiologi dan melakukan sterilisasi dengan autoclave

II. DASAR TEORI

Media atau medium adalah suatu bahan yang terdiri dari campuran zat-zat hara (nutrient)
yang berguna untuk membiakkan mikroba. Dengan menggunakan bermacam-macam media
dapat dilakukan isolasi, perbanyakan, pengujian sifat-sifat fisiologis dan perhitungan
sejumlah mikroba. Supaya mikroba dapat tumbuh baik dalam suatu media, maka medium
tersebut harus memenuhi syarat-syarat yaitu mengandung nutisi dasar seperti sumber karbon,
sumber nitrogen, mineral (Fosfor, Magnesium, Kalsium, Natrium), dan vitamin (Sutedjo,
1991).

Mikroorganisme dapat ditumbuhkan dan dikembangkan pada suatu substrat yang disebut
medium. Medium yang digunakan untuk menumbuhkan dan mengembangbiakkan
mikroorganisme tersebut harus sesuai susunanya dengan kebutuhan jenis-jenis
mikroorganisme yang bersangkutan. Beberapa mikroorganisme dapat hidup baik pada
medium yang sangat sederhana yang hanya mengandung garam anargonik ditambah sumber
karbon organik seperti gula. Sedangkan mikroorganime lainnya memerlukan suatu medium
yang sangat kompleks yaitu berupa medium ditambahkan darah atau bahan-bahan kompleks
lainnya (Volk dan Wheeler, 1993).

Nutrien agar adalah medium umum untuk uji air dan produk dairy. NA juga digunakan
untuk pertumbuhan mayoritas dari mikroorganisme yang tidak selektif, dalam artian
mikroorganisme heterotrof. Media ini merupakan media sederhana yang dibuat dari ekstrak
beef, pepton, dan agar. NA merupakan salah satu media yang umum digunakan dalam
prosedur bakteriologi seperti uji biasa dari air, sewage, produk pangan, untuk membawa stok
kultur, untuk pertumbuhan sampel pada uji bakteri, dan untuk mengisolasi organisme dalam
kultur murni dengan cara disterilisasi dengan autoklaf pada 121°C selama 15 menit (Fathir,
2009).

Media dibedakan menjadi:

1. Media umum, yaitu media yang dapat dipergunakan untuk pertumbuhan dan
perkembangbiakan satu atau lebih kelompok mikroba secara umum.
2. Media pengaya, yaitu dipergunakan dengan maksud “memberikan
kesempatan” terhadap suatu jenis atau kelompok mikroba untuk tumbuh menjadi
cepat.
3. Media selektif, yaitu media yang hanya dapat ditumbuhi oleh satu atau lebih
jenis mikroba tertentu tetapi akan menghambat atau mematikan untuk jenis-jenis
lainnya.
 4. Media diferensiasi, yaitu media yang dipergunakan untuk pengujian senyawa
atau benda tertentu dengan bantuan mikroba.
5. Media penguji, yaitu media yang dipergunakan untuk pengujian senyawa atau
benda tertentu dengan bantuan mikroba.
6. Media enumerasi, yaitu media yang dipergunakan untuk menghitung jumlah
mikroba pada suatu bahan.(Suriawiria, 2005).

Garis besar pembuatan media yang tersusun atas beberapa bahan adalah sebagai
berikut:

a. Mencampur bahan – bahan, dilarutkan dalam air suling dan dipanaskan dalam
pemanas air supaya larutannya homogen.
b. Menyaring dengan kertas saring, kain, atau kapas. Untuk media agar atau
gelatin, penyaringan harus dilakukan dalam keadaan panas.
c. Menentukan dan mengatur pH.
d. Memasukkan media ke dalam tempat tertentu. Sebelum disterilkan, media
dimasukkan ke dalam erlenmeyer atau wadah lain yang bersih, kemudian ditutup
kapas atau kertas sampul (kertas perkamen) supaya tidak basah sewaktu
disterilkan.
e. Sterilisasi umumnya dilakukan dengan udara panas dalam autoclave pada suhu
121° C selama 15- 30 menit (Sutedjo, 1991).

PH merupakan faktor yang sangat mempengaruhi suatu keberhasilan dalam pembuatan

medium sehingga kondisi pH yang terlalu basa atau terlalu asam tidak cocok untuk dijadikan
medium mikroba karena mikroba tidak dapat hidup pada kondisi tersebut. Medium
didiamkan atau disimpan selama 2 x 24 jam untuk menyakinkan bahwa medium masih steril,
karena selain pH sebagai penentu tumbuhnya mikroba, alat dan medium yang steril juga
menentukan (Dwidjoseputro, 1994).

Sterilisasi adalah proses atau kerja untuk membebaskan suatu bahan seperti medium
pertumbuhan mikroba ataupun peralatan laboratorium dari semua bentuk kehidupan.
Sterilisasi merupakan suatu proses untuk membunuh semua jasad renik yang ada, sehingga
jika ditumbuhkan di dalam suatu medium tidak ada lagi jasad renik yang dapat berkembang
biak. Sterilisasi harus bisa membunuh jasad renikyang paling tahan panas seperti spora
bakteri (Fardiaz, 1992).

Hampir semua tindakan yang dilakukan dalam diagnosa mikrobiologis, sterilisasi sangat
diutamakan baik alat-alat yang siap pakai maupun medianya. Suatu alat atau bahan dikatakan
steril apabila alat atau bahan tersebut bebas dari mikroba baik dalam bentuk vegetatif maupun
spora. Oleh karena itu, bagi seorang pemula di bidang mikrobiologi sangat perlu mengenal
teknik sterilisasi, pembuatan media serta teknik penanaman, hal ini semua merupakan dasar-
dasar kerja dalam laboratorium mikrobiologi.

Sterilisasi berarti proses pemusnahan bakteri dengan cara membunuh mikroorganisme.

Dalam kegiatan penelitian mikroba, digunakan alat dan medium yang steril, maka sterilisasi
ini adalah usaha untuk membebaskan alat atau bahan-bahan dari segala macam kehidupan
atau kontaminasi oleh mikroba. Sterilisasi ini dapat dilakukan dengan cara-cara sebagai
berikut:

1. Pemanasan, meliputi:

a. Sterilisasi dengan pemijaran (pembakaran alat-alat di atas lampu spiritus

sampai pijar).
b. Sterilisasi dengan udara panas (kering). Temperatur yang digunakan 170°C –
180°C selama 2 jam.
c. Sterilisasi dengan uap air panas. Digunakan untuk cairan dengan suhu 100°C.
d. Sterilisasi dengan uap panas bertekanan, menggunakan otoklaf dengan suhu
121°C selama 12 – 30 menit.

2. Penyaringan

Dilakukan terhadap bahan cair yang sangat peka terhadap pemanasan (misal:
serum darah, toksin, larutan garam fisiologis) dan tidak dapat disterilkan dengan
pemanasan tinggi. Untuk itu digunakan filter bakteri, misalnya Berkeled filter,
Chamberland filter.

3. Sterilisasi Bahan Makanan

Sterilisasi bahan makanan dapat dilakukan dengan cara memasukkan ke dalam

uap air panas selama 1 jam dengan suhu 100°C diulang selama tiga kali. Cara lain
adalah dapat disterilkan dengan menggunakan autoklaf (Pustekkom, 2005).

Faktor–faktor yang mempengaruhi sterilisasi pemanasan:

1. jenis pemanasan, kering atau basah

2. suhu dan waktu
3. jumlah organisme yang ada
4. apakah organisme tersebut memiliki kemampuan untuk membuat spora
5. jenis bahan yang mengandung organisme yang harus dibunuh
(Gupte, 1990):

Autoklaf digunakan sebagai alat sterilisasi uap dengan tekanan tinggi. Penggunaan
autoklaf untuk sterilisasi, tutupnya jangan diletakkan sembarangan dan dibuka-buka karena
isi botol atau tempat medium akan meluap dan hanya boleh dibuka ketika manometer
menunjukkan angka 0 serta dilakukan pendinginan sedikit demi sedikit. Medium yang
mengandung vitamin, gelatin atau gula, maka setelah sterilisasi medium harus segera
didinginkan. Cara ini untuk menghindari zat tersebut terurai. Medium dapat langsung
disimpan di lemasi es jika medium sudah dapat dipastikan steril (Dwidjoseputro, 1994).

III. METODOLOGI
a. Alat & Bahan
Alat :
1. Tabung reaksi
2. Labu Erlenmeyer
 3. Beaker Gelas
4. Piet Tetes
5. Gelas Ukur
6. pH meter
7. Autoclave
8. Alumunium foil
9. Kapas
10. Koran
11. Cawan Petri

Bahan:
1. Media NA
2. Media NB

b. Cara Kerja
1. Sterilisasi Alat
Tabung reaksi, labu Erlenmeyer, ditutup dengan kapas berbalut kassa dan alumunium
foil. Piring petri, pinset, blue tip, yellow tip, dibungkus kertas payung

Disteririlisasi dengan autoclave 121°C, 20 menit

Dikeringkan dalam oven

2. Pembuatan Media
Ditimbang masing-masing medium sesuai kebutuhan dan ketentuan yang tertera pada
label medium

Dilarutkan medium tersebut pada sebagian aquadest

pH medium diatur dengan penambahan HCl dan NaOH

Setelah pH sesuai, sisa sir dicampur homogen, dibagi dalam wadah yang sesuai

Ditutup wadah medium dengan kapas berbalut kassa dan alumunium foil

Strerilisasi dengan autoclave 121°C, 15 menit

Untuk membuat medium padat ditambah agar sebanyak 1,5-2% b/v sebelum
 sterilisasi dilakukan

Medium yang tidak langsung digunakan disimpan dalam refrigerator

Untuk membuat media agar miring, segera setelah sterilisasi selesai media
dimiringkan dengan kemiringan yang sesuai, biarkan memadat

IV. DATA PENGAMATAN

1. Sterilisasi Alat
a. Piring petri = 15 buah
b. Gelas ukur 10 mL = 6 buah
2. Pembuatan Media
a. Larutan NA yang dilarutkan dalam 550 mL air dibagi ke dalam:
11 labu Erlenmeyer berukuran 100 mL masing-masing 50 mL, dan
labu terakhir 60 mL
b. Larutan NB yang dilarutakn ke dalam 40 mL air dibagi ke dalam:
19 tabung reaksi masing-masing 2 mL pada 16 tabung reaksi pendek, 1
ml pada tabung reaksi pendek, dan 4 mL pada tabung reaksi panjang
 Piring petri yang akan
Larutan
disterilisasi
media NA dan NB yang akan
disterilisasi

V. PEMBAHASAN

Autoklave merupakan alat sterilisasi untuk media agar mikroorganisme dapat tumbuh dan
berkembang. Di laboratorium terbagi menjadi dua yaitu yang digunakan untuk sterilisasi alat
dan medium yang akan dipakai, serta yang digunakan untuk destruksi atau sterilisasi kotor.
Rongga di dalam autoklave tidak boleh terlalu penuh diisi dengan benda-benda yang akan
disterilisasikan agar dapat terjadi aliran uap yang cukup baik.

Alat dan media yang dimasukkan

ke dalam autoclave Autoclave
 Sterilisasi tidak hanya dilakukan pada awal percobaan saja, tetapi juga perlu dilakukan
setelahnya pada bahan yang sudah selesai dipakai dengan cara destruksi. Destruksi adalah
suatu cara untuk merusak/menghancurkan bakteri penelitian yang tidak digunakan lagi.
Berfungsi agar bahan tersebut tidak menimbulkan bahaya bagi lingkungan yang
dikenai/dikontaminasi olehnya.

Sterilisasi merupakan proses penting yang harus dilalui sebelum melakukan penelitian
yang berhubungan dengan mikroorganisme. Sterilisasi dilakukan pada semua alat dan dan
bahan yang akan digunakan dalam percobaan, baik peralatan laboratorium maupun medium
pertumbuhan mikroba. Melalui sterilisasi, seluruh mikroba patogen dapat mati, sehingga
tidak sempat berkembang biak dan tidak dapat mengkontaminasi apa yang akan diujikan.
Sterilisasi pada percobaan ini merupakan sterilisasi secara fisik yang menggunakan panas
dari dalam autoklav, di mana panas yang digunakan berasal dari uap air sehingga disebut
strerilisasi basah. Dengan kondensasi akan terbentuk embun yang dapat menyebabkan
keadaan lembab yang cukup untuk membunuh kuman, sehingga bahan menjadi steril.

Pada percobaan ini, alat yang disterilisasi ialah piring petri, gelas ukur, serta media
yang telah dibuat. Piring petri dibungkus dengan koran hingga rapat dan ditumpuk bersama
agar bungkusan tidak terbuka. Pembungkusan dengan koran ini bertujuan agar piring petri
tidak rusak dan tidak tergores saat dimasukkan ke dalam autoclave, serta tidak dimasuki
kontaminan di udara ketika dikeluarkan dari alat.

Untuk sterilisasi gelas ukur, setelah dibersihkan lubang gelas ukur ditutupi kapas dan
alumunium foil. Tujuannya agar semua alat yang disterilisasi benar-benar steril dari mikroba
dan tidak ada lagi spora mikroba yang masuk. Alumunium foil digunakan karena tahan air
sehingga dapat menahan uap air dari autoclave masuk.

Percobaan selanjutnya adalah pembuatan dan sterilisasi media serta larutan pengencer.
Media yang digunakan adalah Nutrien Agar dan Nutrien Broth. Nutrien Agar adalah medium
umum untuk uji air dan produk pangan. Nutrien juga digunakan untuk pertumbuhan dari
mikroorganisme yang tidak selektif, dalam artian mikroorganisme heterotrof. Media ini
merupakan media sederhana yang dibuat dari ekstrak beef, pepton dan agar. Lalu Nutrien
Broth adalah media untuk mikroorganisme yang berbentuk cair. Kegunaan dari Nutrien Broth
tidak jauh berbeda dengan Nutrien Agar. Pembuatan media Nutrien Broth dilakukan terlebih
dahulu karena Nutrien Broth tidak mengandung agar sehingga dapat mudah larut dalam
aquades dan waktu yang dibutuhkan untuk melarutkan Nutrien Broth sangat cepat.

Untuk membuat media Nutrien Broth, media Broth yang telah disediakan dimasukkan ke
dalam labu erlenmeyer dan dilarutkan dalam 40 ml aquades. Larutan yang dihasilkan
berwarna kuning keruh. Warna kuning keruh ini berarti larutan masih belum steril. Lalu
larutan Nutrien Broth dipanaskan menggunakan hot plate hingga larut sempurna. Setelah
dilakukan pemanasan, larutan NB dibagi kedalam tabung reaksi. Yaitu 17 tabung reaksi
pendek sebanyak masing-masing 2 ml, dan 2 tabung reaksi panjang sebanyak masing-masing
4 ml. Namun, pada percobaan ini hanya 16 tabung reaksi pendek yang terisi sebanyak 2 ml,
sisa 1 tabung reaksi hanya berisi 1 ml, hal ini dapat disebabkan kurang telitinya dalam
penuangan larutan maupun menguapnya air saat pemanasan.
 Sedangkan untuk membuat media Nutrien Agar dibutuhkan 500 ml aquades. Namun
karena kurang berhati-hati air yang digunakan menjadi 550 ml. Nutrien agar dilarutkan
dengan aquades dan menghasilkan larutan yang berwarna kuning tua keruh. Warna kuning
tua keruh ini berarti larutan masih belum steril sehingga dipanaskan juga menggunakan hot
plate hingga berwarna bening. Pemanasan dilakukan sambil diaduk menggunakan magnetik
stirrer yang bertujuan agar Nutrien Agar larut sempurna. Setelah dilakukan pemanasan,
dibagi ke dalam 11 labu Erlenmeyer berukuran 100 ml masing-masing 50 ml. karena
kelebihan air saat pelarutan, labu terakhir menjadi lebih banyak yaitu 60 ml. Kemudian, labu
Erlenmeyer ditutup dengan kapas yang dibungkus kain kasa dan dilapisi dengan
menggunakan alumunium foil. Tujuan ditutup kapas dan alumunium foil agar proses
sterilisasi media Nutrien Broth dan Nutrien Agar berjalan lancar dan menghasilkan media
yang benar-benar steril. Setelah itu labu Erlenmeyer dimasukkan kedalam autoclave dengan
suhu 121℃ selama 15-20 menit.

VI. KESIMPULAN
1. Sterilisasi adalah proses penghilangan mikroorganisme untuk menjaga
kemurnian suatu kerja mikrobiologi agar diperoleh hasil yang sesuai.
2. Sterilisasi pada percobaan ini menggunakan autoclave dengan suhu 121°C
selama 20 menit.
3. Alat yang disterilisasikan yaitu 15 buah piring petri, dan 6 buah gelas ukur 10
ml.
4. Medium ialah suatu bahan yang terdiri dari campuran zat-zat hara (nutrient)
yang berguna untuk membiakkan mikroba.
5. pH dan suhu mempengaruhi pembuatan media.
6. Medium yang dibuat yaitu medium Nutrien Agar dan Nutrien Broth.
7. Medium yang dihasilkan berwarna kuning jernih kecoklatan sebanyak 19
tabung reaksi untuk medium NB dan 11 labu Erlenmeyer untuk medium NA.
8. Medium juga disterilisasi agar tidak terkontaminasi.

VII. DAFTAR PUSTAKA

Anna, 2010, Percobaan 2 Teknik Sterilisasi Dan Pembuatan Media,
http://choalialmu89.blogspot.com/2010/11/percobaan-2-teknik-sterilisasi-dan.html
diakses pada 15 Mei 2014 pukul 16.30 WIB.
Nikku, 2010, Sterilisasi Alat dan Bahan Pada Pengujian Mikrobiologi,
http://nikku92.wordpress.com/2010/10/21/sterilisasi-alat-dan-bahan-pada-
pengujian-mikrobiologi/ diakses pada 15 Mei 2014 pukul 16.30 WIB.
Pratiwi,Sylvia, 2004, Mikrobiologi Farmasi, Erlangga: Jakarta.
Waluyo,Lud, 2008, Teknik dan Metode Dasar dalam Mikrobiologi, UMM
Press: Jakarta.

Yogyakarta, 8 Mei 2014

Asisten, Praktikan,

1.Anthia Dinti S. (09626)

 2.Mirza Amrina (09627)
3.Febilla Restu R. (09629)
( ) 4. Ferlita Aprillia (09631)