UNIVERSIDAD TÉCNICA DE AMBATO

FACULTAD DE CIENCIA E INGENIERÍA EN ALIMENTOS

CARRERA DE INGENIERÍA BIOQUÍMICA

LABORATORIO X TALLER SIMULACIÓN CAMPO

NOMBRE:
o Andrea Mejía

CARRERA: Ingeniería Bioquímica

ASIGNATURA: Bioingeniería
NIVEL: Noveno PARALELO: A
ÁREA ACADÉMICA: Profesional DOCENTE: MSc. Patricio Orozco
CICLO ACADÉMICO: Septiembre 2017- Febrero 2018

I. TEMA

EXTRACCIÓN DE ADN DE TRIGO

II. OBJETIVOS
General:
 Extraer ADN a partir de material vegetal de trigo (Triticum aestivum)
Específicos:
 Cuantificar la cantidad de ADN extraído, por medio de espectrofotometría.
 Determinar la pureza del ADN, luego del proceso de extracción.
III. METODOLOGÍA

Extracción de ADN

Se añadió 300 l de buffer al tejido fresco recolectado de cada material y se maceró con un pistilo
cada uno de los tubos eppendorf con las muestras. Seguidamente se añadió 700 l de buffer a
cada uno de los tubos con el material ya macerado. Se procedió a incubar a 65 °C por 1 hora
agitando cada 30 minutos. Se centrifugó a una velocidad de 13200 rpm por 15 minutos. Al
sobrenadante se le añadió 600 l de Cloroformo – Alcohol isopropílico (24:1). A continuación,
se centrifugó a 13200 rpm por 5 minutos y se realizó lavados continuos para extraer todo el ADN
y se tomó el sobrenadante. Se adicionó un volumen igual o mayor de etanol al 100% (600-700uL)
agitando por inmersión. Se mantuvo la mezcla en refrigeración a -20°C durante una hora. Se
centrifugó por 4 minutos a 13200 rpm hasta obtener un pellet. Se retiró el etanol al 100% y realizó
dos lavados con 500 uL de etanol 70% a la pastilla de ADN formada. Se secó en la microestufa
por 30 minutos a 37°C. Finalmente, se resuspendió el ADN en 80 l de tampón de extracción y
se mantuvo en baño María durante 20 minutos a 65°C.

CUANTIFICACIÓN DE ADN

Se calibró el NanoDrop™ utilizando la solución buffer de la extracción y para el análisis se colocó

2uL de muestra resuspendida y se utilizó el software del equipo para obtener los valores de
cantidad de ADN obtenido, y los valores de A260 y A280 para verificar la pureza de este.

IV. DISCUSIÓN Y RESULTADOS

Para romper la pared celular vegetal de las hojas de trigo se utilizó un método mecánico, como se
puede observar en la Figura 1, en este caso la molienda provoca la disrupción celular y liberó el
ADN al medio con buffer para su posterior extracción. Según García, Mariezcurrena, Gutiérrez,
Bernal, & Pinzón (2012) mencionan que, con este método se obtienen muestras de ADN
genómico con buenos rendimientos y purezas.

Figura 1. Molienda de las hojas de trigo

El buffer CTAB 2X está formado por una serie de compuestos, los cuales tienen diferentes
funciones, y contiene varios reactivos entre ellos CTAB (bromuro de hexadeciltrimetilamonio)
que es un detergente catiónico que tiene la propiedad de precipitar ácidos nucléicos y
polisacaridos ácidos en soluciones de baja concentración iónica. Pero en soluciones de alta
concentración iónica el CTAB forma complejos con las proteínas y polisacáridos pero no precipita
ácidos nucleicos. Bajo estas condiciones las proteínas y los polisacáridos neutros permanecen en
solución, el cual le da estabilidad al pH de la solución, además, desestabiliza la membrana celular
provocando una mayor lisis. (PROBIOTEK, s/f)
Otro reactivo que estuvo presente en el buffer fue el z-mercaptoetanol, que según Mazo (2011)
dice que es un agente reductor que bloquea la acción de los fenoles, que corresponden a sustancias
que son oxidadas después de la ruptura de la pared celular, que tienden a unirse y precipitarse con
el ADN, de tal forma que se observa un pellet de color verde oscuro o marrón de consistencia
viscosa como se observa en la Figura 2.

El EDTA (etilendiaminotetraacético) es otro compuesto que tiene la función dentro del buffer de
unir a los cationes metálicos en la solución eliminando los cationes solubles y cationes de las
enzimas ADNasas, las cuales degradan el ADN; el Tris-HCl Tris (hidroximetil) aminometano,
mantiene un pH constante entre 7.5 y 8.2. Y el PVP de igual forma se utiliza para la extracción y
purificación de ADN por su capacidad de enlace de hidrógeno con los derivados fenólicos (L. C.
Mazo, 2011)

Figura 2. Formación de pellet y extracción de ADN

Los alcoholes que se emplearon fueron cloroformo y alcohol isopropílico que su función fue diluir
a los compuestos covalentes, principalmente lípidos; esto provocó que el ADN se precipite en
forma de una cadena blanca compacta a manera de hilos como se observa en la figura 3, además,
conjuntamente con el etanol al 100% lavaron al ADN de las sales residuales (Granados, 2014).

Figura 3. Precipitación de las hebras de ADN

La incubación de ácidos nucléicos/sal/etanol se sometió a -20ºC para provocar una mejor
compactación del pellet de ADN purificado (Saldaña & Salazar, 2007). Como se observa en la
figura 4.

Figura 4. Obtención de ADN purificado

Según Aguilar, Alonso, & Barrero (2011) en las preparaciones de los ácidos nucleicos son
frecuentes las impurezas de naturaleza proteica, pero es posible estimar el grado de impurezas de
origen proteico a partir del cociente A260/A280, dado que el máximo de absorbancia de las
proteínas se encuentra en λ ~ 280 nm. La presencia de proteínas en la muestra hará que el cociente
A260/A280 sea menor que el esperado para ácidos nucleicos puros (valor esperado < 2), en este
caso se obtuvo un valor de 2.06 el cual es un valor de pureza de ADN óptima, de igual forma los
contaminantes como carbohidratos, compuestos fenólicos y aromáticos, así como la turbidez,
absorben a 230 nm y 320 nm; por lo que se estima la relación A260/A230 (valor ideal > 2), el
valor obtenido fue de 2.24 es decir también se encuentra dentro de la pureza óptima de ADN
como se puede observar en la Tabla 1.
Tabla 1. Datos del ADN obtenido del software de NanoDrop™

Muestra 11 Límite de aceptabilidad

Concentración de ácidos nucleicos (ng/ul) 1290.2 -

A260 25.805 -

A280 12.512 -

260/280 2.06 <2

260/230 2.24 >2

Fuente: Laboratorio de investigación FCIAL

V. CONCLUSIONES

• Se extrajo ADN a partir de las hojas de trigo (Triticum aestivum), se aplicó un método
mecánico para provocar la lisis celular y la posterior salida del ADN hacia el buffer de
extracción CTAB 2X, posteriormente se realizó la precipitación y purificación del material
genético.

• Se cuantificó el ADN extraído del trigo, por medio de espectrofotometría utilizando el

equipo NanoDrop™, resultando 1290.2 ng/uL el mismo que es un valor aceptable y lo que
quiere decir que el proceso de molienda resultó efectivo y en el proceso de extracción no
se tuvo pérdidas significativas del material genético.

• Se determinó la pureza del ADN, luego del proceso de extracción por medio del coeficiente
de las absorbancias A260 y A280, el valor de A260/A280 fue 2.06 lo que demuestra que
no hay contaminación por proteínas en el ADN extraído, la relación A260/A230 tuvo un
valor de 2.24 eso quiere decir que no hay contaminación por carbohidratos, compuestos
fenólicos y aromáticos. Luego de determinar estos valores se puede concluir que la muestra
cumple con los niveles de pureza necesaria para utilizarla para posibles investigaciones.
VI. RECOMENDACIONES

 Contar con material adecuado para la ejecución de la práctica.

 Durante la extracción de ADN es importante tener en cuenta pasos
correspondientes a incubación y precipitación, siendo innecesario y poco
eficiente el extender los tiempos ni aumentar las temperaturas con el fin de
obtener mayor cantidad de ADN
 Evitar contaminar los reactivos al momento de colocarlos en la muestra

VII. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Aguilar, A., Alonso, G., & Barrero, M. (2011). Estandarización del método de extracción de

ácidos nucleicos en muestras comerciales enlatadas de atún (Thunnus spp). Rev. Venez.

Cien. Tecnol. de Alim, 2(1), 061–072.

García, A., Mariezcurrena, M., Gutiérrez, A., Bernal, R., & Pinzón, D. (2012). Comparación de

técnicas de extracción de ADN a partir de granos de trigo cultivados en el estado de

méxico. Universidad Autónoma del Estado de México.

Granados, D. (2014). Extracción de ADN mediante el uso de CATAB 2X. Recuperado a partir

de http://www.academia.edu/7472007/Extracci%C3%B3n_de_ADN

Mazo, L. (2011). Evaluación y comparación de 3 protocolos de extracción y amplificación del

ADN contenido en exsicados de orquídeas conservadas en colecciones de herbario

(B.S. thesis).

PROBIOTEK. (s/f). CTAB (Bromuro de hexadeciltrimetilamonio). Recuperado a partir de

http://www.probiotek.com/productos/reactivos/ctab/

Saldaña, G. A., & Salazar, E. G. (2007). Aislamiento de ADN de calidad para la amplificación

al azar de adn polimórfico de mango. Agronomía Tropical, 57(4), 281–286.