Anda di halaman 1dari 30

MAKALAH

BIOTEKNOLOGI

PROSEDUR DAN TEKNIK MENGGUNAKAN PCR DAN


MENGGANDAKAN DNA

Oleh:
Dinita Firda Labiba (01311740000058)
Vencka Azzahra Putri (01311740000059)
Sabrina Fany R (01311740000060)
Ayunda Novita Rani (01311740000062)
Rosi Yulia K (01311740000063)
Shifa Syafira Rachmat (01311740000065)
Titah Rigel Anjalani (01311740000067)

INSTITUT TEKNOLOGI SEPULUH NOPEMBER


SURABAYA
2019

i
KATA PENGANTAR

Assalamualaikum warahmatullahi wabarakatuh.

Ucapan syukur Alhamdulillah kehadirat Tuhan Yang Maha Esa atas segala
rahmat dan nikmat yang telah diberikan sehingga makalah dengan judul “Prosedur
dan Teknik menggunakan PCR dan Menggandakan DNA” ini selesai dikerjakan
dengan baik dan tepat waktu. Selesainya makalah ini tentu tidak hanya menjadi
tujuan penulis, melainkan adanya pengetahuan yang bermanfaat baik bagi penulis
maupun bagi pembaca.
Makalah ini merupakan bagian dari tugas mata kuliah Bioteknologi 2019
di Departemen Biologi Institut Teknologi Sepuluh Nopember. Tak lupa penulis
ingin mengucapkan terima kasih kepada Bapak Nurul Jadid dan Ibu Noor Nailis
Sa’adah sebagai dosen pengampu mata kuliah Bioteknologi 2019.

Harapan penulis, semoga makalah ini dapat bermanfaat bagi pembaca


meskipun terdapat kekurangan didalamnya, terutama bermanfaat dalam
memberikan pengetahuan dasar mengenai Bioteknologi kepada pembaca,
khususnya pengetahuan mengenai penggunaan PCR dan menggandakan DNA.

Wassalamualaikum warahmatullahiwabarakatuh.

Surabaya, 18 Nopember 2019

Penulis

ii
DAFTAR ISI

HALAMAN JUDUL ................................................................................................i


KATA PENGANTAR ..............................................................................................ii
DAFTAR ISI ..........................................................................................................iii
BAB I. PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang ................................................................................................1
1.2 Rumusan Masalah ...........................................................................................2
1.3 Tujuan Penelitian ............................................................................................2
1.4 Manfaat Penelitian ..........................................................................................2
BAB II. TINJAUAN PUSTAKA
2.1 PCR .................................................................................................................3
2.2 Kelebihan dan Kekurangan serta manfaat PCR dalam beberapa bidang.........5
2.3 Komponen Penting dalam PCR.......................................................................7
2.4.Bagian-bagian pada Alat PCR.........................................................................9
2.5 Proses Sintesis dan Penggandaan DNA.........................................................10
2.6 Real Time PCR..............................................................................................12
2.7 DNA Fingerprint……………........................................................................15
2.8 Study Kasus………………...........................................................................17
BAB III. KESIMPULAN
3.1 Kesimpulan ...................................................................................................26
DAFTAR PUSTAKA ........................................................................................xxvii

iii
BAB I
PENDAHULUAN
1.1. Latar Belakang

Reaksi berantai polymerase (Polymerase Chain Reaction, PCR) adalah suatu


metode enzimatis untuk amplifikasi DNA dengan cara in vitro. PCR ini pertama
kali dikembangkan pada tahun 1985 oleh Kary B. Mullis. Amplifikas DNA pada
PCR dapat dicapai bila menggunakan primer oligonukleotida yang disebut
amplimers. Primer DNA suatu sekuens oligonukleotida pendek yang berfungsi
mengawali sintesis rantai DNA. PCR memungkinkan dilakukannyan
pelipatgandaan suatu fragmen DNA. Umumnya primer yang digunakan pada PCR
terdiri dari 20-30 nukleotida. DNA template (cetakan) yaitu fragmen DNA yang
akan dilipatgandakan dan berasal dari patogen yang terdapat dalam spesimen
klinik. Enzim DNA polimerase merupakan enzim termostabil Taq dari bakteri
termofilik Thermus aquaticus. Deoksiribonukleotida trifosfat (dNTP) menempel
pada ujung 3’ primer ketika proses pemanjangan dan ion magnesium
menstimulasi aktivasi polymerase (Yusuf, 2010). Dalam ”mesin PCR”, terjadi
proses sintesis dan penggandaan DNA yang terdiri dari tiga tahap : Denaturation,
Annealing dan Extension. Pada jaman dahulu, sebelum dibuat ”mesin PCR” yang
canggih seperti sekarang ini (lihat gambar), ”mesin PCR” yang ada merupakan
rangkaian alat sederhana, yakni berupa tiga buah inkubator yang suhunya diatur
sedemikian rupa, sehingga mendekati kondisi yang diinginkan: Denaturation,
Annealing dan Extension) (Aryani dan Kusumawaty, 2007).
PCR sekarang merupakan teknik umum dan sering sangat diperlukan yang
digunakan dalam laboratorium penelitian medis dan biologi untuk berbagai
aplikasi. Reaksi rantai polimerase adalah teknik yang kuat yang dengan cepat
menjadi salah satu teknik yang paling banyak digunakan dalam biologi molekuler
karena cepat, murah dan sederhana. Teknik ini menguatkan fragmen-fragmen
DNA spesifik dari jumlah kecil bahan DNA sumber, bahkan ketika sumber DNA
itu kualitasnya relatif buruk.4 PCR; metode cepat dan mudah untuk menghasilkan
salinan tak terbatas dari setiap fragmen DNA, adalah salah satu perkembangan
ilmiah yang benar-benar layak superlatif kuno seperti "revolusioner" dan
"terobosan. Dari kepraktisan harian diagnosis medis ke kerangka teoritis
sistematika, dari pengadilan dari studi hukum ke lapangan tentang perilaku
hewan, PCR mengambil analisis dari sejumlah kecil materi genetik bahkan materi
genetik yang rusak untuk tingkat presisi dan keandalan yang baru (Joshi dan
Deshpande,2010).

1
2

1.2. Rumusan Masalah


1. Bagaimana teknik penggunaan PCR dan menggandakan DNA?
2. Apa saja kelebihan dan kekurangan serta manfaat menggunakan PCR
pada setiap bidang
1.3. Tujuan
1. Mengetahui teknik penggunaan PCR dan menggandakan DNA
2. Mengetahui kelebihan dan kekurangan penggunaan serta manfaat PCR di
setiap bidang
1.4. Manfaat
1. Sebagai literatur tambahan mengenai teknik penggunaan PCR dan
penggandaan DNA
2. Menjadi bahan pembelajaran secara singkat dalam hal Bioteknologi
khususnya Teknik penggunaan PCR dan menggandakan DNA
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA

2.1 PCR
PCR adalah suatu teknik yang melibatkan beberapa tahap yang berulang
(siklus) dan pada setiap siklus terjadi duplikasi jumlah target DNA untai
ganda. Untai ganda DNA templat (unamplified DNA) dipisahkan dengan
denaturasi termal dan kemudian didinginkan hingga mencapai suatu suhu
tertentu untuk memberi waktu pada primer menempel (anneal primers) pada
daerah tertentu dari target DNA. Polimerase DNA digunakan untuk
memperpanjang primer (extend primers) dengan adanya dNTPs (dATP, dCTP,
dGTP dan dTTP) dan buffer yang sesuai. Umumnya keadaan ini dilakukan
antara 20-40 siklus. Target DNA yang diinginkan (short ”target” product)
akan meningkat secara eksponensial setelah siklus keempat dan DNA non-
target (long product) akan meningkat secara linier. Komponen- komponen
yang diperlukan pada proses PCR adalah templat DNA; sepasang primer,
yaitu suatu oligonukleotida pendek yang mempunyai urutan nukleotida yang
komplementer dengan urutan nukleotida DNA templat; dNTPs
(Deoxynucleotide triphosphates); buffer PCR; magnesium klorida (MgCl2)
dan enzim polimerase DNA. Proses PCR melibatkan beberapa tahap yaitu: (1)
pra-denaturasi DNA templat; (2) denaturasi DNA templat; (3) penempelan
primer pada templat (annealing); (4) pemanjangan primer (extension) dan (5)
pemantapan (post- extension). Tahap (2) sampai dengan (4) merupakan
tahapan berulang (siklus), di mana pada setiap siklus terjadi duplikasi jumlah
DNA (Handoyo dan Rudiretna, 2010).
Prinsip dasar PCR sederhana. Satu molekul DNA digunakan untuk
menghasilkan dua salinan, kemudian empat, kemudian delapan dan
seterusnya. Penggandaan berkelanjutan ini dilakukan oleh protein spesifik
yang dikenal sebagai polimerase, enzim yang mampu merangkai blok
pembangun DNA individu untuk membentuk untaian molekul yang panjang.
Untuk melakukan pekerjaannya, polimerase memerlukan pasokan blok
pembangun DNA, yaitu nukleotida terdiri dari empat basa adenin (A), timin
(T), sitosin (C) dan guanin (G). Mereka juga membutuhkan fragmen kecil dari
DNA, yang dikenal sebagai primerrim, yang mereka pasang blok bangunan
serta molekul DNA yang lebih panjang untuk berfungsi sebagai template
untuk membangun untai baru. Jika ketiga bahan ini disuplai, enzim akan
membuat salinan templat yang tepat (Joshi dan Deshpande, 2010). Teknik
PCR dapat dimodifikasi ke dalam beberapa jenis diantaranya:


1. Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP); metode ini


digunakan untuk membedakan organisme berdasarkan analisis model derifat

3
dari perbedaan DNA (Yusuf, 2010).
2. Inverse-PCR, metode ini digunakan ketika hanya satu sekuen internal yang
diketahui. Template didigesti dengan enzim restriksi yang memotong bagian
luar daerah yang akan diamplifikasi, fragmen restriksi yang dihasilkan
ditempelkan dengan ligasi dan diamplifikasi dengan menggunakan sekuen
primer yang memiliki titik ujung yang memiliki jarak yang jauh satu sama lain
dengan segmen eksternal yang telah tergabung. Metode ini khusus digunakan
untuk mengidentifikasi ”sekuen antara” dari beragam gen (Yusuf, 2010).

3. Nested-PCR, proses ini memungkinkan untuk mengurangi kontaminasi
pada produk selama amplifikasi dari penyatuan primer yang tidak diperlukan.
Dua set primer digunakan untuk mendukung metode ini, set kedua
mengamplifikasi target kedua selama proses pertama berlangsung. Sekuens
DNA target dari satu set primer yang disebut primer inner disimpan di antara
sekuens target set kedua dari primer yang disebut sebagai outer primer. Pada
prakteknya, reaksi pertama dari PCR menggunakan outer primer, lalu reaksi
PCR kedua dilakukan dengan inner primer atau nested primer menggunakan
hasil dari produk reaksi yang pertama sebagai target amplifikasi. Nested primer
akan menyatu dengan produk PCR yang pertama dan menghasilkan produk
yang lebih pendek daripada produk yang pertama (Yusuf, 2010).
4. Quantitative-PCR; digunakan untuk pengukuran berulang dari hasil
produk PCR. Metode ini secara tidak langsung digunakan untuk mengukur
kuantitas, dimulai dari jumlah DNA, cDNA, atau RNA. Hasil dari metode ini
juga menampilkan copy dari sampel (Yusuf, 2010).
5. Reverse Transcriptase (RT-PCR); metode ini digunakan untuk amplifikasi,
isolasi atau identifikasi sekuen dari sel atau jaringan RNA. Metode ini dibantu
oleh reverse transcriptase (mengubah RNA menjadi cDNA), mencakup
pemetaan, menggambarkan kapan dan dimana gen diekspresikan (Yusuf,
2010).
6. Random Amplified Polymorphic DNA ( RAPD ) bertujuan untuk
mendeteksi polimorfisme pada tingkat DNA. Metode ini dikembangkan oleh
Welsh and Mc Clelland (1990) dengan cara mengkombinasikan teknik PCR
menggunakan primer – primer dengan sequens acak untuk keperluan
amplifikasi lokus acak dari genom (Yusuf, 2010).

Gambar 1. Alat PCR (Aryani dan Kusumawaty, 2007)

4
Gambar 2. Contoh formula, kondisi, mesin dan prinsip kerja serta visualisasi hasil
(Aryani dan Kusumawaty, 2007)

2.2 Kelebihan dan Kekurangan serta manfaat PCR dalam beberapa bidang
Kelebihan Teknik PCR yaitu PCR digunakan secara luas untuk diagnosis
berbasis molekuler, misalnya deteksi virus, bakteri, protozoa, dan cacing parasit.
PCR juga dapat digunakan sebagai alternatif gold standard apabila parasit yang
hidup tidak ditemukan dalam tubuh.12 DNA hospes dan parasit memiliki urutan
yang berbeda, sehingga PCR dapat mendeteksi keberadaan parasit dalam tubuh
secara spesifik. PCR dapat mendeteksi DNA parasit dalam sampel yang berjumlah
sedikit. PCR dapat membedakan spesies parasit tunggal dengan adanya primer
spesifik untuk DNA target. Primer yang digunakan di PCR relatif lebih sederhana
dibandingkan dengan LAMP, karena hanya satu pasang primer forward dan 17r
everse untuk menempel pada gen target. Teknik PCR mempunyai tingkat
spesifisitas yang relatif tinggi. Hal ini didasarkan pada penggunaan primer. Teknik
PCR hanya membutuhkan sedikit sampel DNA dan deteksinya tidak dipengaruhi
oleh tahap perkembangan dan lingkungan (Nurwidayati, 2015). Kekurangan
teknik PCR yaitu pemeriksaan dengan PCR memiliki k ekurangan diantaranya
adalah proses PCR harus diawali dengan preparasi sampel yang cukup rumit dan
reagen yang mahal. Proses PCR memerlukan mesin pengatur suhu (thermal
cycler) dan waktu relatif lebih lama dari LAMP, yaitu sekitar 3 – 4 jam untuk 35
siklus. Hasil PCR tidak dapat dilihat secara langsung, harus diproses lagi dengan
elektroforesis dan dilihat dengan alat gel documentation. Pemeriksaan dengan
PCR tidak dapat membedakan apakah parasite dalam tubuh masih hidup atau mati
(Nurwidayati, 2015).
Manfaat PCR dalam berbagai bidang yaitu PCR dapat dipergunakan untuk
berbagai keperluan, baik untuk analisis maupun untuk sintesis polinukleotida.
Manfaat PCR menurut Suharsono (2006) adalah identifikasi suatu gen atau DNA
yang spesifik,perbanyakan gen atau DNA untuk berbagai keperluan, Kajian
keragaman genetic berdasarkan penanda molekuler, pengurutan DNA, Sintesis
sidik jari DNA sebagai penciri suatu individu/klon/varietas, Analisis forensic, dan
Analisis paternitas (keturunan) (Gusrina, 2012)
- Identifikasi forensic
Seseorang yang terlibat kejahatan (baik pelaku maupun korban), atau

5
korban kecelakaan/bencana kadang sulit dilakukan.Jika identifikasi secara
fisik sulit atau tidak mungkin lagi dilakukan, maka DNA dapat diambil
dari bagian tubuh manapun, kemudian dilakukan analisa PCR untuk
mengamplifikasi bagian-bagian tertentu DNA yang disebut fingerprints
alias DNA sidik jari, yaitu bagian yang unik bagi setiap orang. Hasilnya
dibandingkan dengan DNA sidik jari keluarganya yang memiliki pertalian
darah, misalnya ibu atau bapak kandung.Jika memiliki kecocokan yang
sangat tinggi maka bisa dipastikan identitas orang yang dimaksud
(Gusrina, 2012)
- Identifikasi kesehatan
Penyakit Influenza A (H1N1) yang sebelumnya disebut flu babi sedang
mewabah saat ini. Penyakit berbahaya seperti ini memerlukan diagnosa
yang cepat dan akurat seperti PCR. Teknologi PCR saat ini memungkinkan
diagnosa dalam hitungan jam dengan hasil akurat. Disebut akurat karena
PCR mengamplifikasi daerah tertentu DNA yang merupakan ciri khas
virus Influenza A (H1N1) yang tidak dimiliki oleh virus atau makhluk
lainnya (Gusrina, 2012)
- Bidan pertanian
Di bidang pertanian, terutama berkaitan dengan kebutuhan pokok manusia
seperti pangan, teknologi PCR telah mampu berkontribusi nyata seperti
melakukan perbaikan varietas-varietas padi melalui rekayasa genetik,
sehingga tercipta padi dengan kualitas unggul baik dari sisi nutrisi yang
dikandungnya maupun daya adaptasi yang lebih mumpuni dibandingkan
padi sejenis hasil perkawinan alami (Gusrina, 2012)
- Bidang Ekonomi
Dari sisi ekonomi, ditemukannya teknologi PCR telah mendorong
tumbuhnya industri-industri bioteknologi dunia seperti Abbot Laboratories
(US), Becton Dickinson (US), Qiagen (Netherlands), Promega (US),
Sigma-Aldrich (US), Roche Diagnostics (Swisterland), Siemens
Healthcare (Germany), dan Thermo Fisher Scientific (US) dengan omset
yang sangat fantastis. Keuntungan pasar hampir sebagian besar diperoleh
dari penjualan enzim polimerase untuk PCR (Gusrina, 2012)
- Uji Diagnostik Molekuler
Uji diagnostik molekuler menggunakan teknik PCR telah membawa suatu
revolusi dalam dunia veteriner, penelitian, manajemen kebun binatang,
penangkaran hewan, dan fasilitas-fasilitas lainnya yang bergerak di bidang
kesehatan hewan. Teknik PCR ini mampu melakukan uji diagnostik
terhadap agen-agen patogen secara sensitif dan spesifik dalam waktu yang
relatif lebih singkat dibanding uji-uji diagnostik lainnya. Teknik molekuler
ini merupakan perangkat yang sangat efektif dalam mendiagnosis penyakit
yang biasa menyerang anjing, kucing dan hewan peliharaan lainnya
(Gusrina, 2012)

6
2.3 Komponen penting dalam PCR
Pada proses PCR diperlukan beberapa komponen utama adalah (Yusuf,
2010):
a. DNA cetakan, yaitu fragmen DNA yang akan dilipatgandakan. DNA
cetakan yang digunakan sebaiknya berkisar antara 105 – 106 molekul. Dua
hal penting tentang cetakan adalah kemurnian dan kuantitas (Yusuf, 2010).
Templat DNA ini dapat berupa : DNA kromosom, DNA plasmid ataupun
fragmen DNA apapun asal di dalam DNA templat tersebut mengandung
fragmen DNA target yang dituju. Penyiapan DNA templat untuk proses
PCR dapat dilakukan dengan menggunakan metode lisis sel ataupun
dengan cara melakukan isolasi DNA kromosom atau DNA plasmid dengan
menggunakan metode standar yang ada. Pemilihan metode yang
digunakan di dalam penyiapan DNA templat tergantung dari tujuan
eksperimen. Pembuatan DNA templat dengan menggunakan metode lisis
dapat digunakan secara umum, dan metode ini merupakan cara yang cepat
dan sederhana untuk pendedahan DNA kromosom ataupun DNA plasmid.
Prinsip metode lisis adalah perusakan dinding sel tanpa harus merusak
DNA yang diinginkan. Oleh karena itu perusakan dinding sel umumnya
dilakukan dengan cara memecahkan dinding sel menggunakan buffer lisis.
Selain dengan cara lisis, penyiapan DNA templat dapat dilakukan dengan
cara mengisolasi DNA kromosom ataupun DNA plasmid menurut metode
standar yang tergantung dari jenis sampel asal DNA tersebut diisolasi.
Metode isolasi DNA kromosom atau DNA plasmid memerlukan tahapan
yang lebih kompleks dibandingkan dengan penyiapan DNA dengan
menggunakan metode lisis. Prinsip isolasi DNA kromosom atau DNA
plasmid adalah pemecahan dinding sel, yang diikuti dengan pemisahan
DNA kromosom / DNA plasmid dari komponen-komponen lain. Dengan
demikian akan diperoleh kualitas DNA yang lebih baik dan murni.

b. Oligonukleotida primer, yaitu suatu sekuen oligonukleotida pendek (18 –


28 basa nukleotida) yang digunakan untuk mengawali sintesis rantai DNA.
Dan mempunyai kandungan G + C sebesar 50 – 60% (Yusuf, 2010).
Oligonukleotida primer (desain primer) memegang peranan penting untuk
spesififisitas maksimal dan efisiensi PCR. Primer yang baik ditentukan
oleh beberapa sifat/karakter primer (Sasmito dkk, 2014) :
 Panjang Primer : Desain primer yang diperlukan untuk PCR
adalah sepasang primer yang dikenal dengan forward primer dan
reverse primer. Primer yang diperoleh merupakan rangkaian basa
nukleotida yang unik dan diusahakan memiliki ukuran pendek
untuk meminimalkan biaya. Panjang primer berkisar 18-30 basa,
didasarkan pada pertimbangan kombinasi acak yang mungkin

7
ditemukan pada satu urutan genom.
 Primer Melting Temperature (Tm) : Primer Melting Temperature
(Tm) atau suhu leleh merupakan temperatur yang diperlukan oleh
primer untuk mengalami disosiasi / lepas ikatan. Suhu leleh primer
yang digunakan harus sama untuk memastikan kinerja yang
konsisten pada pasangan primer.
 Primer Annealing Temperature (Ta) : Primer Annealing
Temperature (Ta) merupakan suhu yang diperkirakan agar primer
dapat berkaitan dengan template (DNA) secara stabil. Suhu aneling
yang tinggi akan menyulitkan terjadinya ikatan primer sehingga
menghasilkan produk PCR yang kurang efisien. Sebaliknya, suhu
aneling yang terlalu rendah menyebabkan terjadinya penempelan
primer pada DNA di tempat yang tidak spesifik.Nilai suhu aneling
yang sebanding dengan suhu leleh menyebabkan suhu aneling
tidak dimasukkan dalam perhitungan keoptimalan desain primer.
 Selisih Primer Melting Temperature (∆Tm) : Pasangan primer
sebaiknya tidak memiliki selisih suhu leleh yang tinggi. Pasangan
primer dengan selisih suhu leleh yang lebih dari 5°C menyebabkan
penurunan proses amplifikasi, atau bahkan memungkinkan tidak
terjadi proses amplifikasi (Sasmito dkk, 2014).
 Product Length : Jarak antara ujung 5’ kedua primer dikenal dengan
istilah amplicon atau product length. Pada umumnya, product length
product length yang digunakan adalah <2000 basa. Jarak ini dirasa
cukup untuk proses amplifikasi pada template (Sasmito dkk, 2014).

c. Deoksiribonukelotida trifosfat (dNTP). dNTPs merupakan suatu campuran


yang terdiri atas dATP (deoksiadenosin trifosfat), dTTP (deoksitimidin
trifosfat) , dCTP (deoksisitidin trifosfat) dan dGTP (deoksiguanosin
trifosfat). Dalam proses PCR dNTPs bertindak sebagai building block
DNA yang diperlukan dalam proses ekstensi DNA. dNTP akan menempel
pada gugus –OH pada ujung 3’ dari primer membentuk untai baru yang
komplementer dengan untai DNA templat. Konsentrasi optimal dNTPs
untuk proses PCR harus ditentukan (Handoyono dan Rudiretna, 2001).
d. Enzim DNA Polimerase, yaitu enzim yang melakukan katalisis reaksi
sintesis rantai DNA. Enzim ini diperoleh dari Eubacterium yang disebut
Thermus aquaticus, spesies ini diisolasi dari taman Yellowstone pada
tahun 1969. Enzim polimerase taq tahan terhadap pemanasan berulang-
ulang yang akan membantu melepaskan ikatan primer yang tidak tepat dan
meluruskan wilayah yang mempunyai struktur sekunder (Yusuf, 2010).
Enzim polimerase DNA berfungsi sebagai katalisis untuk reaksi
polimerisasi DNA. Pada proses PCR enzim ini diperlukan untuk tahap
ekstensi DNA. Enzim polimerase DNA yang digunakan untuk proses PCR

8
diisolasi dari bakteri termofilik atau hipertermofilik oleh karena itu enzim
ini bersifat termostabil sampai temperatur 95 ℃. Aktivitas polimerase
DNA bergantung dari jenisnya dan dari mana bakteri tersebut diisolasi .
Sebagai contoh adalah enzim Pfu polimerase (diisolasi dari bakteri
Pyrococcus furiosus) mempunyai aktivitas spesifik 10x lebih kuat
dibandingkan aktivitas spesifik enzim Taq polimerase (diisolasi dari
bakteri Thermus aquaticus). Penggunaan jenis polimerase DNA berkaitan
erat dengan buffer PCR yang dipakai (Handoyono dan Rudiretna, 2001).
e. Komponen pendukung lain adalah senyawa buffer. Larutan buffer PCR
umumnya mengandung 10 – 50 mM Tris-HCl pH 8,3-8,8 (suhu 20o C);
50 mM KCl; 0,1% gelatin atau BSA (Bovine Serum Albumin); Tween 20
sebanyak 0,01% atau dapat diganti dengan Triton X-100 sebanyak 0,1%;
disamping itu perlu ditambahkan 1,5 mM MgCl2 (Yusuf, 2010).

2.4 Bagian-bagian pada Alat PCR


Reaksi PCR yang meliputi tiga fase utama ini berlangsung didalam suatu
alat yang secara otomatis dapat melakukan perubahan suhu sesuai program PCR
yang disebut Thermal Cycler atau mesin PCR. Ketika dilakukan metode PCR
untuk amplifikasi, pada setiap tahapan denaturasi, annealing, dan elongasi
memerlukan suhu tertentu yang berbeda agar dapat berjalan dengan baik.
Pemanasan didapatkan dari penangas air dengan suhu yang berbeda-beda, dan
ketika masa inkubasi dipindahkannya sampel secara manual. Penemuan alat
amplifikasi Thermal Cycler membuat pengerjaan PCR lebih mudah dengan
pengubahan suhu secara otomatis. Komponen utama pada Thermal Cycler, adalah
peltier yaitu panduan dari dua logam semikondukter yang bila dialiri arus listrik
dapat menurunkan atau menaikkan suhu di dalam kamar alat, tergantung arah arus
listrik yang mengalirinya(Listiawan, 2008) Mesin terbaru PCR menggunakan
dasar peltier effect, yang memungkinkan blok dalam mesin melakukan pemanasan
dan pendinginan tabung PCR dengan cara pembalikan arah arus listrik. Untuk
mencegah terjadinya penguapan, mesin dilengkapi pemanas pada tutup yang bisa
diatur; biasanya diatur pada suhu 105 C. (Yuda, 2013).

9
(Gambar .1 Thermocyler dan bagiannya) (Susan, 2003)

Hal yang paling penting untuk dipertimbangkan saat merancang dan


melengkapi laboratorium untuk PCR yaitu bagaimana meminimalkan resiko
kontaminasi dan memastikan hasil yang akurat. Maka diperlukan ruangan untuk
persiapan reagen, persiapan sampel, PCR (pemisahan tahap primer maupun
sekunder) dan pemrosesan pasca-PCR dengan kelengkapan peralatan kontak yang
khusus, dan pakaian pelindung. Sarung tangan sekali pakai harus tersedia untuk
perubahan sering untuk menghindari kontaminasi silang, dan bahan kontrol harus
dimasukkan dalam setiap langkah untuk memantau masalah kontaminasi alat lain
yang menjadi komponen utama dalam peletakkan larutan yang nantinya berisi
enzim, komponen, dan Strain DNA yaitu; Microtubes, tabung satu strip, piringan
microtiter yang terdapat hingga total 384 sumur, kaca benda, capillaries(hal ini
berhubungan dengan distribusi panas yang beragam serta laju peningkatan suhu
untuk kinerja yang konsisten), dan tip yang dihubungkan dengan pipet tradisional,
pipet ini biasanya lebih mudah digunakan daripada pipet perpindahan positif.
(Susan,2003).

(Gambar .2 Pipetes dan sumur PCR) (Susan, 2003)

Langkah pada pelaksanaan PCR primer dan sekunder harus dipisahkan,


lebih baik dilakukan pada ruangan yang berbeda; dengan thermocyler yang
berbeda pula. Namun pelaksanaan ini akan tergantung pada tata letak ruang dan
peralatan yang tersedia. Reaksi primer dipisahkan karena mengandung campuran
asam nukleat yang harus dirakit dan ditempatkan pada thermocyler yang sesuai
setelah cycle selesai, dipindahkan pada PCR sekunder yang mengumpulkan reaksi
dan ditempatkan pada cyclers yang diddedikasikan untuk proses. Peralatan
otomatis atau terintegrasi harus diposisikan dengan thermocycler sekunder untuk
mengurangi kontaminasi (Susan, 2003).

2.5 Proses Sintesis dan Penggandaan DNA


Terdapat tiga tahapan penting dalam proses PCR yang selalu terulang
dalam 30-40 siklus dan berlangsung dengan cepat :

10
Denaturasi
Di dalam proses PCR, denaturasi awal dilakukan sebelum enzim taq
polimerase ditambahkan ke dalam tabung reaksi. Denaturasi DNA merupakan
proses pembukaan DNA untai ganda menjadi DNA untai tunggal. Ini biasanya
berlangsung sekitar 3 menit, untuk meyakinkan bahwa molekul DNA
terdenaturasi menjadi DNA untai tunggal. Denaturasi yang tidak lengkap
mengakibatkan DNA mengalami renaturasi (membentuk DNA untai ganda lagi)
secara cepat, dan ini mengakibatkan gagalnya proses PCR. Adapun waktu
denaturasi yang terlalu lama dapat mengurangi aktifitas enzim Taq polymerase.
Aktifitas enzim tersebut mempunyai waktu paruh lebih dari 2 jam, 40 menit, 5
menit masing-masing pada suhu 92,5; 95 dan 97,5°C (Yusuf, 2010).

Annealing (penempelan primer)


Sintesis DNA ini berlangsung dari arah 5’ ke 3’. Agar sintesis DNA dapat
berlangsung dengan baik maka dalam reaksi tersebut diperlukan adanya enzim
DNA polymerase, misalnya Taq (Thermus aquaticus) polymerase dan MgCl2,
sementara kebutuhan energi dan nukleotida terpenuhi dari dNTPs (terdiri dari :
dTTP, dGTP, dATP dan dCTP). Kriteria yang umum digunakan untuk merancang
primer yang baik adalah bahwa primer sebaiknya berukuran 18 – 25 basa,
mengandung 50 – 60 % G+C dan untuk kedua primer tersebut sebaiknya sama.
Sekuens DNA dalam masing-masing primer itu sendiri juga sebaiknya tidak saling
berkomplemen, karena hal ini akan mengakibatkan terbentuknya struktur
sekunder pada primer tersebut dan mengurangi efisiensi PCR. Waktu annealing
yang biasa digunakan dalam PCR adalah 30 – 45 detik. Semakin panjang ukuran
primer, semakin tinggi temperaturnya. Reaksi sintesis DNA pada tahap ini
tergantung pada suhu annealing dari primer yang digunakan. Kisaran temperatur
penempelan yang digunakan adalah antara 36°C sampai dengan 72°C, namun
suhu yang biasa dilakukan itu adalah antara 50 – 60°C (Yusuf, 2010).

Pemanjangan Primer (Extention)


Selama tahap ini Taq polymerase memulai aktivitasnya memperpanjang
DNA primer dari ujung 3’. Kecepatan penyusunan nukleotida oleh enzim tersebut
pada suhu 72°C diperkirakan 35 – 100 nukleotida/detik, bergantung pada buffer,
pH, konsentrasi garam dan molekul DNA target. Dengan demikian untuk produk
PCR dengan panjang 2000 pasang basa, waktu 1 menit sudah lebih dari cukup
untuk tahap perpanjangan primer ini. Biasanya di akhir siklus PCR waktu yang
digunakan untuk tahap ini diperpanjang sampai 5 menit sehingga seluruh produk
PCR diharapkan terbentuk DNA untai ganda (Yusuf, 2010).
Reaksi-reaksi tersebut di atas diulangi lagi dari 25 – 30 kali (siklus)
sehingga pada akhir siklus akan diperoleh molekul-molekul DNA rantai ganda
yang baru yang merupakan hasil polimerasi dalam jumlah yang jauh lebih banyak
dibandingkan dengan jumlah DNA cetakan yang digunakan. Banyaknya siklus

11
amplifikasi tergantung pada konsentrasi DNA target dalam campuran reaksi. Pada
akhirnya maka akan diperoleh produk PCR, berupa sekuen DNA yang diinginkan
dalam jumlah yang berlipat ganda, yakni sebanyak 2n (n = banyaknya siklus PCR
yang digunakan). Selanjutnya, produk PCR yang diperoleh dapat disimpan pada
suhu 4oC, sampai saatnya tiba untuk dianalisis lebih lanjut. Untuk melihat hasil
amplifikasi DNA tersebut, maka produk PCR yang diperoleh dimigrasikan pada
gel agarose (elektroforesis). Umumnya, hasil amplifikasi DNA dengan PCR ini
dipengaruhi beberapa faktor, yaitu : kualitas dan kuantitas DNA, temperatur
annealing primer, kualitas dan konsentrasi primer, konsentrasi MgCl2, dNTP,
enzim DNA polymerase, dan jumlah siklus PCR yang digunakan. (Yusuf, 2010).

Gambar 1. Siklus PCR (1) Denaturasi pada suhu 90° – 95°C; (2) Annealing pada
suhu 37o 65°C; (3) Elongasi pada suhu 72°C ; (4) Siklus pertama selesai (Yusuf,
2010).

2.6 Real Time PCR


Untuk mendeteksi RNA, PCR real time telah banyak digunakan salah
satunya untuk analisis ekspresi gen (mRNA) dan dijadikan sebagai gold standard
pada kuantifikasi RNA karenateknik ini memiliki sensitivitas yang tinggi (Jung et

12
al., 2013). Namun, teknik PCR real time memiliki kelemahan seperti memerlukan
kit dan bahan yang mahal serta perlu teknik yang kompeten untuk mendapatkan
hasil yang akurat. Seiring dengan kemajuan teknologi, pengembangan teknik PCR
konvensional pun telah banyak digunakan terutama dalam bidang riset salah
satunya untuk mendeteksi level ekspresi gen (mRNA) menggunakan semi
kuantitatif Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR).
Untuk sampel RNA, proses PCR diawali dengan tahap transkripsi balik
(reverse transcriptase) dimana molekul mRNA dirubah menjadi molekul cDNA
(complementary DNA), kemudian molekul cDNA dijadikan template pada proses
amplifikasi. Hasil dari amplifikasi DNA dipisahkan melalui elektroforosis agarosa
dengan menggunakan fluorescence dye sebagai penanda amplikon DNA, dan
intensitas pita DNA diukur menggunakan software digital densitometri. Didalam
setiap pengujian RT-PCR sangat penting menggunakan internal kontrol untuk
menganalisis hasil level ekspresi gen yang akan dinormalisasi dengan internal
kontrol tersebut, selain itu juga internal kontrol digunakan sebagai kontrol kualitas
pengujian (Hewajuli & Darmayanti, 2014).
Reaksi selama fase eksponensial dapat dipantau dengan mencatat jumlah
emisi fluoresen pada setiap siklus. Peningkatan hasil amplifikasi PCR pada fase
eksponensial berhubungan dengan jumlah inisiasi target gen. Makin tinggi tingkat
ekspresi target gen maka deteksi emisi fluoresen makin cepat terjadi. Jumlah
siklus amplifikasi diperlukan untuk menghasilkan produk PCR berdasarkan
fluoresensi di awal fase eksponensial PCR serta untuk melewati garis ambang
fluoresensi/siklus threshold (Ct). Jumlah siklus yang diperlukan untuk mencapai
ambang batas disebut Ct. Siklus Ct adalah prinsip dasar dari PCR real time dan
sebagai bagian yang sangat penting untuk memperoleh data yang akurat. Nilai Ct
PCR real time sangat berkorelasi dengan kuantitas urutan DNA target (Hewajuli
& Darmayanti, 2014).
Reaksi PCR real time dapat dilakukan satu tahap (one step real time PCR)
maupun dua tahap (two step real time PCR). Keseluruhan reaksi sintesis cDNA
sampai amplifikasi PCR dalam PCR real time satu tahap dilakukan dalam satu
tabung. Polymerase Chain Reaction (PCR) real time satu tahap dapat
meminimalkan variasi perlakuan laboratorium karena reaksi kedua enzim terjadi
dalam satu tabung. Reaksi reverse transcriptase pada proses PCR real time dua
tahap dilakukan terpisah dari pengujian PCR real time (Hewajuli & Darmayanti,
2014). Modifikasi PCR real time telah dikembangkan untuk meningkatkan kerja
dari PCR real time seperti PCR real time multiplek. Saat ini, telah tersedia kit
komersial untuk PCR real time multiplek yang memungkinkan untuk kombinasi
beberapa pengujian dalam satu reaksi. Polymerase Chain Reaction (PCR)
multiplek adalah amplifikasi secara berkelanjutan dua atau lebih DNA atau cDNA
target dalam satu reaksi tabung dan hanya dapat dilakukan dengan menggunakan
probe berlabel spesifik pada setiap urutan DNA target. Kelebihan dari PCR
multiplek adalah jumlah sampel yang dibutuhkan lebih sedikit sehingga berguna

13
apabila jumlah sampel yang tersedia dalam jumlah terbatas dan kemampuannya
untuk menggabungkan pengujian dalam satu sistem internal kontrol (Hewajuli &
Darmayanti, 2014).

14
15

2.7 DNA Fingerprint


DNA atau asam dioxyribosa merupakan kompleks molekul yang
mengandung seluruh informasi penting penyusun sebuah organisme. DNA
merupakan materi yang diturunkan. Setiap sel dalam tubuh manusia memiliki
DNA yang sama. Informasi DNA disimpan sebagai kode yang terdiri dari empat
basa nitrogen: Adenin (A), Timin (T), Sitosin (C) dan Guanin (G). Urutan ini
menentukan informasi yang tersedia untuk membangun dan memelihara suatu
organisme. Ukuran genom manusia adalah sekitar 3.107 megabase (Mb) tetapi
hanya sekitar 1,2 persen dari total genom yang dikodekan untuk protein, ini
adalah sekitar 20.000 gen, sementara 98,8 persen adalah bukan kode DNA2,3,
yang berarti tidak mengkodekan protein. Dalam kelompok ini, kita memiliki,
misalnya, sejumlah variabel pengulangan tandem (VNTR), yang merupakan
urutan berulang dari 9 hingga 100 pasangan basa (bp), yang memainkan peran
kunci dalam elaborasi sidik jari DNA. Mengetahui karakteristik DNA utama,
spesifisitas adalah kunci kemunculan analisis DNA (Garcia dan Karla, 2017).
Banyak teknik lain yang digunakan untuk menentukan penanda biologis,
seperti HLA dan zat golongan darah, telah berhasil diterapkan untuk tujuan
identifikasi. Semua didasarkan pada pengecualian, di mana marker diuji sampai
perbedaan ditemukan. Faktor-faktor lain yang mendukung analisis DNA adalah
kemampuan untuk secara cepat mereplikasi urutan sejuta kali lipat atau lebih
secara in vitro, dan stabilitas relatif DNA. Intinya adalah bahwa analisis DNA saja
dapat menjadi tes yang pasti. Setelah teknik menjadi rutin, ada sedikit keraguan
bahwa, asalkan spesimen yang cocok dapat diperoleh, sidik jari DNA akan
menjadi tes tunggal terbaik untuk membedakan individu (Garcia dan Karla,
2017).
Pada tahun 1980, Wyman dan White memiliki konsep dasar untuk
berdasarkan pada pengamatan lokus DNA polimorfik yang ditandai dengan
sejumlah fragmen panjang-panjang variabel yang disebut polimorfisme panjang-
panjang (RFLPs), yang merupakan sekuens spesifik di mana enzim restriksi
memotong DNA . Namun, sejarah DNA dimulai pada tahun 1985 dengan makalah
“Daerah Minisatellite Hipervariabel Dalam DNA Manusia” yang ditulis oleh Alec
Jeffreys. Jeffreys dan rekan kerjanya menganalisis gen mioglobin manusia ketika
mereka menemukan sebuah wilayah yang terdiri dari urutan 33-basa-pasangan
diulang empat kali. Pengulangan tandem ini disebut sebagai minisatellite dan
daerah serupa sebagai hypervariable karena jumlah pengulangan tandem adalah
variabel baik di dalam lokus maupun antar lokus. Pada tahun 1987, Nakamura
menciptakan istilah variabel jumlah pengulangan tandem (VNTR) untuk
menggambarkan lokus individu di mana alel terdiri dari pengulangan tandem yang
bervariasi dalam jumlah unit inti. Ketika DNA diisolasi, dibelah dengan enzim
tertentu, dan hibridisasi dalam kondisi ber-stringitas rendah dengan probe yang
terdiri dari pengulangan inti, kompleks fragmen DNA terdeteksi. Profil ini
tampaknya unik untuk setiap individu. Pengulangan inti yang berbeda kemudian
16

diisolasi dan digunakan untuk menghasilkan sejumlah probe berbeda yang


berguna untuk sidik jari. Sidik jari DNA memiliki aplikasi pertama pada tahun
1985 dalam kasus keturunan (Garcia dan Karla, 2017).
Dalam kasus yang tidak biasa ini, seorang ibu dengan anak laki-lakinya
yang berusia 13 tahun ditangkap di bandara ketika mereka tiba di Inggris dari
Ghana karena pihak berwenang berpikir bahwa dia bukan putranya. Sidik jari
DNA yang diterapkan pada keduanya menunjukkan bahwa, secara efektif, mereka
mengatakan yang sebenarnya. Aplikasi pertama sidik jari DNA dalam identifikasi
forensik terjadi kemudian pada tahun yang sama, dalam kasus yang dengan indah
mencontohkan kekuatan bukti DNA untuk menghubungkan adegan kejahatan,
untuk mengecualikan tersangka, dan untuk mendukung hukuman. Seorang
tersangka ditangkap karena diduga melakukan pemerkosaan ganda dan bunuh diri
pada 2 anak di bawah umur. Sidik jari DNA menggunakan sampel semen yang
tersisa di TKP menunjukkan bahwa seorang pria bertanggung jawab atas kedua
kejahatan tersebut, tetapi itu bukan tersangka yang ditangkap. Dia dibebaskan dan
pelakunya ditangkap. Saat ini, teknik ini masih digunakan untuk membuat profil
DNA masing-masing individu untuk mengklarifikasi beberapa kejahatan atau
pengujian keturunan (Garcia dan Karla, 2017).
Sidik Jari DNA adalah teknologi yang digunakan untuk mengidentifikasi
individu berdasarkan karakteristik molekuler DNA. Lebih spesifik, metode ini
menggunakan VNRT karena jumlah pangkalan dan pengulangan dalam lokus
adalah unik untuk setiap individu. Sebagai contoh, seseorang dapat memiliki
dalam genomnya urutan gatagata dan ini berulang 10 kali dan yang lain dapat
memiliki urutan yang sama tetapi hanya mengulangi 5 kali. Teknik ini digunakan,
seperti yang telah kita lihat sebelumnya, dalam pengujian induk dan kasus
forensik tetapi dapat digunakan untuk genetika antropologis, zoologi, dan botani
di antara disiplin ilmu lainnya. Yang penting, teknik Sidik Jari DNA sangat
sensitif, yang berarti dapat juga menghasilkan data bahkan dari setengah
(sebagian) bahan biologis yang terdekomposisi (Garcia dan Karla, 2017).
Langkah-langkahnya melibatkan teknik-teknik lain yang digunakan dalam
Biologi Molekuler, seperti reaksi rantai polimerase (PCR) dan elektroforesis.
Berikut ini adalah langkah-langkah untuk menghasilkan sidik jari DNA (Garcia
dan Karla, 2017),
1. DNA diekstraksi dari inti sel apa pun di dalam tubuh.
2. Molekul DNA dipecah dengan bantuan restriksi enzim endonuklease
(disebut pisau kimia) yang memotong mereka menjadi fragmen. Fragmen
DNA juga mengandung VNTR.
3. Fragmen dipisahkan menurut ukuran oleh gel elektroforesis dalam gel
agarosa.
4. Fragmen-fragmen DNA untai tunggal yang terpisah dipindahkan ke
membran nilon. Probe DNA radioaktif yang memiliki urutan basa berulang
yang melengkapi VNTR yang mungkin dituangkan di atas membran nilon.
17

Beberapa dari mereka akan mengikat VNTR untai tunggal. Metode


hibridisasi DNA dengan probe disebut Southern Blotting.
5. Membran nilon dicuci untuk menghilangkan probe tambahan.
6. Sebuah film sinar-X terpapar pada membran nilon untuk menandai
tempat-tempat di mana probe DNA radioaktif telah terikat pada fragmen-
fragmen DNA. Tempat-tempat ini ditandai sebagai pita gelap ketika film
sinar-X dikembangkan. Ini dikenal sebagai autoradiografi.
7. Pita gelap pada film sinar-X mewakili sidik jari DNA (profil DNA).

Gambar 1. Cara Kerja DNA fingerprinting (Garcia dan Karla,


2017).

Sejak Alec Jeffreys mengembangkan teknik sidik jari DNA, telah


digunakan dalam berbagai bidang ilmiah. Dalam penyelidikan forensik telah
membantu mengirim ke penjahat penjara, dan mengidentifikasi korban kejahatan,
bencana alam, perang. Perselisihan ayah telah diselesaikan berkat metode ini.
Selain itu, disiplin ilmu sebagai genetika antropologis, zoologi, dan botani antara
lain telah mendorong penelitian profil untuk menafsirkan asal dan perilaku
beberapa spesies. (Garcia dan Karla, 2017).

2.8 Study Case


STUDY CASE : “Identifikasi dan Aplikasi Marka Berbasis PCR untuk
Identifikasi Varietas Padi dengan Palatabilitas Tinggi”
PENDAHULUAN
Padi (Oryza sativa) menempati posisi penting sebagai tanaman pangan yang
menjadi sumber makanan pokok sebagian besar penduduk dunia. Kalau penduduk
negara subtropik seperti Korea Selatan, Jepang, Taiwan, dan sebagian daerah Cina
memilih beras japonica sebagai konsumsi pangan hariannya, di lain pihak
penduduk negara Asia Tenggara lebih suka beras indica karena sesuai dengan cara
memasak dan tipe masakan. Jumlah plasma nutfah padi dan spesies. kerabatnya
18

tersebar dalam koleksi yang sangat besar, melebihi 400 ribu di seluruh dunia.
Meskipun diversifikasi padi umumnya berdasarkan sifat genetik dan morfo-
fisiologi, karakter mutu rasa beras atau palatabilitas juga menjadi salah satu
kriteria penting sebagai pembeda diversitas.
Palatabilitas beras dipengaruhi oleh varietas, penanganan pascapanen,
pengolahan hasil, dan proses memasak. Palatabilitas beras yang bagus khususnya
japonica biasanya dicirikan oleh kandungan protein dan amilosa yang rendah
(Blakeney et al., 2001), sehingga menjadikan beras lebih pulen dan tidak pera.
Karena mutu rasa beras sangat dipengaruhi oleh sifat fisika-kimia beras (Li et al.,
2003), maka otomatis banyak faktor genetik berperan di sini. Beberapa gen yang
terlibat dalam sintesis pati, asam amino, gula amino, dan lipid berpengaruh
terhadap sifat fisikokimia pati beras yang selanjutnya menentukan palatabilitas
beras.
Mengingat pentingnya menjaga mutu rasa beras dan kemurnian dari
tercampurnya dengan beras bermutu rasa lebih rendah, identifikasi beras dengan
mutu rasa tinggi diperlukan. Pada umumnya beras dengan palatabilitas tinggi
memiliki kemudahan dalam pengolahan, aroma dan rasanya juga enak, namun
harganya mahal. Identifikasi beras berdasarkan mutu dirasa penting bagi petani
sebagai produsen, pihak konsumen, pedagang, industri makanan, dan pemerintah
(Ohtsubo dan Nakamura, 2007). Oleh karena itu perlu mengembangkan teknologi
hemat waktu dan cepat dalam identifikasi dan diversifikasi varietas padi
berdasarkan palatabilitas terutama padi dengan mutu rasa tinggi.
Pada era sekarang metode untuk identifikasi varietas berdasarkan
polimorfisme DNA atau sidik jari DNA telah dikembangkan seiring kemajuan
ilmu biologi. Marka DNA memiliki keuntungan jelas karena berdasarkan
sampling fragmen dalam genom. Beberapa jenis marka DNA yang umum
digunakan untuk analisis sidik jari DNA adalah RFLP (Restriction Fragmen
Length Polymorphism), RAPD (Random Amplified Polymorphism DNA), SSR
(Single Sequence Repeat), AFLP (Amplified Fragmen Length Polymorphism),
STS (Sequence-Tagged Site), SCAR (Sequence Characterized Amplified Region),
dan SNP (Single Nucleotide Polymorphism). Analisis RFLP telah digunakan
untuk membedakan jenis indica dan japonica dari O. sativa. Karena pita DNA
selain target amplikon lain di RAPD juga muncul, maka modifikasi menjadi
marka STS atau SCAR yang dikembangkan berdasarkan RAPD lebih dianjurkan.
Marka STS berhasil dikembangkan dari AFLP dan RAPD untuk mengidentifikasi
lokasi kromosom untuk gen ketahanan patogen pada padi. Primer STS hasil
pengembangan dari RAPD yang telah digunakan untuk mengidentifikasi varietas
padi premium Jepang, Koshihikari dan galur isogeniknya, digunakan dalam
penelitian ini dan diobservasi pada varietas padi japonica dan indica.
Penelitian ini bertujuan untuk (1) identifikasi varietas beras japonica dan
indica premium yang mempunyai palatabilitas tinggi; (2) menguji marka STS
terpaut palatabilitas pada padi japonica (Korea Selatan dan Cina) dan indica
19

Indonesia; (3) membuat profil sidik jari varietas padi indica dan japonica
berdasarkan marka yang terpaut sifat palatabilitas beras; dan (4) mengetahui
fungsi fragmen yang dihasilkan oleh marka STS yang merupakan modifikasi
marka RAPD.
BAHAN DAN METODE :
1. Materi Genetik
Penelitian dilakukan di Laboratorium Crop Molecular Breeding, Seoul
National University (SNU), Korea Selatan dan Laboratorium Rice Flavor,
Balai Besar Penelitian Tanaman Padi sejak 2007 sampai 2009. Sebanyak
22 varietas padi japonica koleksi Laboratorium Crop Molecular Breeding,
SNU, Korea Selatan, dan 24 varietas indica hasil pemuliaan di Indonesia
koleksi BB Biogen digunakan dalam penelitian ini. Populasi RILs terdiri
dari 40 galur yang berasal dari persilangan tetua padi japonica, yaitu
Suwon 365 dan Chucheong, koleksi Rural Development Administration
(RDA), Suwon, Korea Selatan, juga digunakan untuk pengujian.

2. Uji Organoleptik
Uji organoleptik dilakukan sebanyak tiga ulangan. Parameter uji
palatabilitas yang dievaluasi meliputi kilap, aroma, rasa, kepulenan,
tekstur, dan palatabilitas (total nilai mutu rasa).
Uji organoleptik untuk beras indica dilakukan dengan cara yang sama
dalam mempersiapkan sampel beras. Pengujian terhadap total peubah yang
meliputi kilap, warna, aroma, kepulenan, dan rasa. Nilai organoleptik yang
digunakan untuk kedua jenis grup padi tersebut adalah uji perjenjangan
atau uji ranking (urutan), yang berfungsi untuk mengetahui perbedaan dan
perubahan mutu rasa/palatabiltas beras. Rataan urutan terendah (nilai 1)
memiliki palatabilitas tertinggi, sedangkan rataan urutan tertinggi
menunjukkan palatabilitas terendah.

3. Isolasi DNA
Daun tanaman yang berumur 5 minggu setelah tanam digunakan untuk
isolasi DNA. Sebelum ekstraksi DNA, daun padi muda dan sehat yang
dipanen dibekukan dalam nitrogen cair dan disimpan pada suhu -80oC.
Jaringan daun digerus dalam nitrogen cair menjadi serbuk halus,
selanjutnya DNA genomik diekstraksi menggunakan metode CTAB.
Kualitas dan kuantitas DNA yang diukur menggunakan spektrofotometer
Nano DropR ND-1000 (Nano Drop, Willington, Delaware, USA) dan
dimigrasikan pada 0,8% gel agarosa.

4. Analisis STS dan Amplifikasi PCR


Dua puluh primer STS hasil pengembangan dari RAPD berdasar genom
padi japonica yang dirancang untuk identifikasi varietas premium di
20

Jepang, Koshihikari (Ohtsubo et al., 2002; 2003; Ohtsubo dan Nakamura,


2007) digunakan dalam studi ini. Daftar sekuen primer STS yang
digunakan dalam penelitian ini tercantum di artikel sebelumnya (Lestari et
al., 2009). Analisis genotipe dilakukan melalui amplifikasi DNA dengan
mesin PTC-200 Peltier Thermal Cycler (MJ Research, Inc.USA) dengan
skema amplifikasi terdiri dari 35 siklus (96oC selama 1 menit, 62oC
selama 1 menit, dan 72oC selama 2 menit) dan perpanjangan final pada
72oC selama 5 menit. Produk PCR divisualisasikan menggunakan
elektroforesis 3% gel agarosa untuk mendapatkan resolusi yang lebih baik.
Semua amplifikasi DNA untuk sekuensing, dilakukan dalam total 35 siklus
yang terdiri dari denaturasi 95°C selama 1 menit, annealing pada 60°C
selama 30 detik, dan perpanjangan pada suhu 72°C selama 1 menit.

5. Kloning dan Sekuensing


Untuk mengidentifikasi sekuen amplikon yang diproduksi oleh tiap primer
STS, pita DNA target yang teramplifikasi di varietas padi indica dan
japonica dielusi dari gel agarosa. Hasil elusi gel dimurnikan dengan Kit
elusi gel (Intron Bioteknologi, Korea Selatan), kemudian dikloning ke
dalam vektor pGEM-T Easy dan ditransformasikan ke dalam sel kompeten
Escherichia coli DH5α yang dibuat menurut protokol Sambrook dan
Russell (2001). Plasmid diisolasi menggunakan Kit Pemurnian plasmid
DNA-spin (Intron Bioteknologi, Korea Selatan) dan sekuensing dengan
mesin sekuenser DNA, ABI-3700 DNA mengikuti instruksi dari
perusahaan (Biosystems Terapan, Inc). Sekuensing dilakukan dua arah
(forward dan reverse) kecuali ukuran amplikon lebih kecil dari 700 kb.
Sekuensing dilakukan sebanyak 2 ulangan untuk kevalidan hasil sekuen.
Urutan nukleotida hasil sekuensing dipisahkan dari nukleotida kontaminan
seperti vektor atau primer universal saat sekuensing, dan dikonfirmasikan
keberadaan primer forward dan reverse untuk amplifikasi PCR ke sekuen
target. Sekuen tiap primer yang disusun berdasarkan primer forward dan
reverse disejajarkan dengan program BioEdit (http://
www.mbio.ncsu.edu/BioEdit/) khususnya pairwise alignment, secara
spesifik yaitu, optimal GLOBAL alignment untuk memperoleh total
panjang sekuen amplikon target.

6. Pembuatan Profil Sidik Jari DNA


Hasil amplifikasi primer STS dalam penelitian ini yang merupakan marka
dominan, menghasilkan pita DNA “ada” (positif) dan “tidak ada”
(negatif). Pola pita yang dihasilkan tersebut dikonversi ke dalam nilai
biner sebagai 1 (positif, ada pita DNA) dan 0 (negatif, tidak ada pita
DNA). Profil sidik jari DNA unik tiap varietas dibuat berdasarkan hasil
amplifikasi primer dalam nilai biner yang berurutan dari kiri ke kanan
21

sesuai urutan 20 primer yang digunakan, sehingga menampilkan sistem


nilai digital.

7. Analisis Homologi
Pencarian homologi dilakukan dengan membandingkan urutan sekuen
amplikon dengan semua urutan sekuen di database non-redundant
menggunakan program BLASTX (http://www.ncbi.nih.gov/ BLAST).
Urutan sekuen yang menunjukkan homologi tidak signifikan kemudian
dibandingkan lagi terhadap database nukleotida menggunakan program
BLASTN. Berdasarkan analisis program BLAST, hasil homologi gen yang
teridentifikasi dapat diketahui dari nilai signifikansi yang ditunjukkan oleh
nilai E. Nilai E semakin mendekati nol (0) menunjukkan signifikansinya
makin tinggi. Selain itu tingkat homologi fragmen dengan gen yang
teridentifikasi tersebut ditunjukkan

Hasil dan Pembahasan

Uji organoleptic Palatabilitas Beras


Untuk mendukung ketepatan hasil pengujian mutu rasa beras, grup panelis
dibedakan sesuai kebi- asaan konsumsi grup kultivar padi. Dalam penelitian ini,
panelis orang Korea melakukan uji varietas japo- nica dan sebaliknya orang
Indonesia untuk varietas indica. Mutu rasa beras merupakan salah satu faktor yang
menentukan tingkat penerimaan konsumen. Hasil evaluasi organoleptik
menunjukkan bahwa Koshihikari (beras premium di Jepang) dan Ilpum
menunjukkan palatabilitas terting- gi di antara varietas Korea. Rojolele
menunjukkan mutu rasa tertinggi dibandingkan dengan varietas padi Indonesia
lainnya (Tabel 1). Tekstur nasi pulen merupakan faktor yang menentukan mutu
rasa beras. Beras yang menunjukkan palatabilitas tinggi biasanya mempunyai
tekstur pulen dan sebaliknya untuk nasi pera. Perlin- dungan beberapa varietas
padi premium dengan pala- tabilitas tinggi terutama beras di pasaran dari unsur
pencampuran ataupun kasus salah pelabelan dirasa sangat perlu. Analisis sidik jari
DNA menggunakan marka molekuler yang mudah aplikasinya, cepat dan tidak
mahal biayanya penting dilakukan (Lestari et al., 2012).

Tabel 1. Nilai digital konversi dari pola pita DNA berdasarkan 20 marka STS sebagai
profil sidik jari DNA varietas dan urutan palatabilitas dari 22 varietas padi japonica dan
24 varietas indica (Lestari et al., 2012).
22

Analisis Genotipe dengan Primer STS terpaut Palatabilitas


Penelitian sebelum- nya menunjukkan bahwa pendekatan marka moleku-
ler berbasis PCR dengan primer STS yang digunakan dalam penelitian ini berhasil
mengidentifikasi padi japonica premium yang memiliki palatabilitas tinggi.
Kombinasi primer STS tersebut dengan beberapa marka fungsional yang ber-
hubungan dengan sifat fisiko-kimia pati beras, mampu mendeteksi mutu rasa
beras japonica. Marka STS yang berlatar belakang genom padi japonica
diharapkan dapat diaplikasikan pada padi indica khususnya varietas Indonesia
(Lestari et al., 2012).
Berdasarkan total 20 primer yang diobservasi, beberapa primer (B1, B43,
dan G81) memberi petun- juk pola monomorpik hanya di padi indica namun tidak
di japonica. Dengan demikian ada kespesifikan primer pada varietas, khususnya
primer yang spesifik pada padi varietas japonica, yaitu ada 11 primer meliputi B1,
B43, G22, M2CG, P5, T16, B7, G49A, G81, J6, dan M11. Pola pita yang
dihasilkan oleh 20 marka STS pada 22 varietas japonica dan 24 varietas indica
dalam nilai digital ditunjukkan pada Tabel 1. Varietas Koshihikari (Jepang), Ilpum
(Korea Selatan), dan Rojolele (Indonesia) yang masing-masing tertinggi
palatabilitasnya menunjukkan profil sidik jari DNA spesifik (Tabel 1). Contoh
pola pita yang dihasilkan oleh primer STS ini khususnya Koshihikari ditampil-
kan pada Gambar 1. Pola pita DNA di varietas Koshihikari dalam studi ini sama
dengan hasil obser- vasi sebelumnya. Beberapa primer STS tersebut terutama
G81, G49A, dan WKA9L juga berhasil mengidentifikasi galur-galur hasil per-
silangan dengan tetua Koshihikari yaitu galur-galur Koshihikari Niigata BLs. Pola
pita tunggal hasil PCR dari marka STS ter- sebut terbukti sangat membantu dalam
proses identi- fikasi maupun teknik pengulangannya. Berdasarkan survei
polimorpisme pada tetua varietas japonica, Suwon 365, dan Chucheong, terseleksi
3 primer (E30, F6, dan J6) yang menunjukkan polimorfisme pada progeni dengan
perbedaan palatabilitas. Dengan demi- kian marka ini memberi peluang untuk
digunakan sebagai MAB (marker-assisted breeding) meskipun masih memerlukan
validasi (Lestari et al., 2012).

Gambar 1. Pola pita DNA yang dihasilkan primer STS pada


varietas Koshihikari (Lestari et al., 2012).

Analisis Profil Sidik Jari DNA


Varietas Koshihikari, Ilpum, dan Rojolele menun- jukkan mutu rasa
tertinggi sesuai asal negara berda- sarkan uji organoleptik. Total 20 marka STS
mampu mendiskriminasi beras premium berdasarkan kelom- pok kultivar, yaitu
23

indica dari Indonesia (Rojolele) dan japonica (Koshihikari dan Ilpum) dari
varietas dengan palatabilitas lebih rendah. Profil sidik jari dalam nilai digital
memudahkan dalam identifikasi ketiga varietas tersebut dan juga varietas lainnya
(Tabel 1). Nilai digital tersebut dapat digunakan sebagai identitas varietas yang
berbasis palatabilitas. Seleksi marka STS terpaut palatabilitas beras yang berbasis
genom varie- tas japonica dari studi sebelumnya mempermudah dalam pengujian
pada varietas padi indica dalam pembuatan set marka untuk identitas varietas
berda- sarkan palatabilitas. Pola pita dari marka STS dikon- versi ke dalam sistem
biner (satu/ada pita DNA dan nol/tidak ada pita DNA) sesuai urutan marka memu-
dahkan pembacaaan identitas varietas (Gambar 2) (Lestari et al., 2012).
Koshihikari berhasil didiskriminasi dari varietas japonica Jepang lainnya
berdasarkan set primer yang dikembangkan. Mengacu hasil observasi primer STS
pada padi japonica premium tersebut, maka total primer tersebut juga dicobakan
pada padi indica dari Indonesia. Profil sidik jari DNA beras premium Korea
Selatan, Ilpum, dihasilkan dari sembilan primer, yaitu A6+A7+B1+B43+F6+J6+
E30+G49A+P3. Sementara nilai digital dari pola pita primer STS yang dihasilkan
menunjukkan bahwa hanya 12 primer (A6+A7+B1+B43+E30+F6+G4+G28+
T16+G81+P3) yang menghasilkan amplikon positif pada varietas Rojolele. Profil
sidik jari tersebut unik pada varietas Rojolele. Posisi fragmen penanda sidik jari
DNA spesifik yang dihasilkan dari 12 primer STS dalam genom padi Rojolele
ditampilkan pada Gambar 3. Posisi amplikon 12 primer STS di genom Rojolele
se- bagian besar di lengan pendek kromosom khususnya primer G28, B43, F6, P3,
A6, M2CG, A7, dan T16 dan sisanya di lengan panjang kromosom 1, 9, dan 11.
Posisi ke-12 fragmen STS di genom Rojolele berada di contiq spefisik varietas
tersebut. Terbukti bahwa mar- ka STS berbasis genom mampu mengidentifikasi
beras dengan palatabilitas tinggi di Indonesia (Lestari et al., 2012).
Gabungan marka STS dengan marka fungsional untuk gen-gen yang
terpaut sifat fisiko-kimia pati be- ras mungkin lebih prospektif untuk tujuan
evaluasi palatabilitas. Penggunaan secara khusus ke-20 marka STS tersebut lebih
cenderung untuk identifikasi beras berbasis palatabilitas daripada mendeteksi
palatabilitas beras (Lestari et al., 2012).

Gambar 2. Diagram air pembuatan nilai digital data biner untuk profil
sidik jari DNA sebagai identitas spesifik varietas beras premium (Lestari et
al., 2012).
24

Gambar 3. Posisi fragmen profil sidik jari DNA berdasarkan marka STS
di genom padi Rojolele (Lestari et al., 2012).

Identifikasi Fragmen Primer STS


Analisis homologi fragmen dari primer STS di- lakukan untuk
mengidentifikasi urutan dan fungsi gen yang diduga berhubungan dengan
palatabilitas beras. Selang ukuran sekuen dari primer tersebut kurang lebih antara
1.450-1.800 bp untuk kedua varietas grup japonica dan indica. Dari total 14
primer yang teramplifikasi baik di japonica maupun indica. Analisis homologi
menunjukkan bahwa primer STS tersebut tidak ada asosiasinya dengan gen terkait
palatabilitas beras. Hasil analisis homologi fragmen dari primer STS ditampilkan
pada Tabel 3. Sebagian besar fragmen menunjukkan homologi tinggi (>95). secara
signifikan dengan daerah genom padi (Lestari et al., 2012).

Tabel 3. Analisis homologi sekuen dari primer STS untuk megetahui fungsi
gennya di padi (Lestari et al., 2012).

Kesimpulan
Varietas padi japonica Kosihikari dan Ilpum, serta varietas indica Rojolele
teridentifikasi sebagai varietas dengan palatabilitas tinggi. Marka STS yang
berbasis genom padi japonica berhasil diaplikasikan untuk identifikasi padi indica
Indonesia yang mempunyai palatabilitas tinggi dengan identitas unik. Profil sidik
jari DNA varietas padi indica dan japonica termasuk beras premium (Rojolele,
25

indica dan Ilpum, japonica) berhasil dibuat dengan menggunakan set marka STS
yang terpaut palatabilitas dalam nilai digital. Analisis homologi menunjukkan
bahwa fragmen hasil amplifi- kasi primer STS yang merupakan hasil modifikasi
dari RAPD tidak terpaut dengan gen-gen pada padi yang mengontrol mutu rasa
beras, dan terletak secara acak di genom padi. Pendekatan dalam studi ini dapat
di- aplikasikan untuk identifikasi beras premium lainnya melalui eksplorasi marka
yang spesifik terpaut palata- bilitas terutama dari segmen target di genom padi
(Lestari et al., 2012).
BAB III
KESIMPULAN
2.1 Kesimpulan

26
DAFTAR PUSTAKA

Aryani, A dan Kusumawaty, D. 2007. PRINSIP-PRINSIP POLYMERASE CHAIN


REACTION (PCR) DAN APLIKASINYA. Kursus Singkat Isolasi dan
amplifikasi DNA : (71-74)

Garcia, D. and Karla M. 2017. DNA Fingerprinting. Bionatura, Vol. 2(4)


Gusrina. 2012. Genetika dan Reproduksi Ikan. Yogyakarta : Deepublish
Hewajuli, D. A. dan Dharmayanti. 2014. “Perkembangan Teknologi
Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction dalam
Mengidentifikasi Genom Avian Influenza danNewcastle Diseases”.
WARTAZOA. Vol. 24 No. 1 : 16-29 ..
Jung, U., JiangX., Kaufmann, S. H. E. And Volker P. 2013. “A Universal TaqMan-
based RT-PCR Protocol for Cost-Efficient Detection of Small Noncoding
RNA”. RNA, 19:1864-1873.
Lestari, P., Andari R., dan Hee J. K. 2012. Identifikasi dan Aplikasi Marka
Berbasis PCR untuk Identifikasi Varietas Padi dengan Palatabilitas
Tinggi. Jurnal AgroBiogen, Vol. 8(2):69-77
Listiawan, I. 2008. Penuntun Praktikum Biologi Molekuler. P.T. Nutrilab
Pratama, Jakarta. Hal: 28-39.
MCDONAGH, Susan. Equipping and establishing a PCR laboratory. In: PCR
Protocols. Humana Press, 2003. p. 15-19.
Nurwidayati, A. 2015. Aplikasi Teknik Diagnosis Schistosomiasis Berbasis
Molekuler. Jurnal Vektor Penyakit, Vol. 9 No. 1, 2015 : 29 - 35
Sasmito, D.E.K., Kurniawan, R dan Muhimmah I. 2014. Karakteristik Primer
pada Polymerase Chain Reaction (PCR) untuk Sekuensing DNA. Jurnal
Unitas. 9(1) : 17-29.
Yuda, P. 2013. Diktat Kuliah; Teknologi Molekuler. Fakultas
Teknobiologi Universitas Atma Jaya Yogyakarta, Yogyakarta
Yusuf, Z.K. 2010. Polymerase Chain Reaction (PCR). Saintek. Vol 5(6): 1-6

xxvii