BAB I

PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Mikroorganisme yang ada di alam ini mempunyai morfologi, struktur dan
sifat-sifat yang khas, begitu pula dengan bakteri. Bakteri yang hidup hampir tidak
berwarna dan kontras dengan air, dimana sel-sel bakteri tersebut
disuspensikan.Titik kecil yang mudah luput dari mata justru lebih esensial dari
pada apapun seperti halnya bakteri. Salah satu cara untuk mengamati bentuk sel
bakteri sehingga mudah untuk diidentifikasi adalah salah satunya dengan teknik
pewarnaan sederhana. Ada 3 macam bentuk bakteri yaitu : batang (basil tunggal,
diplobasil, streptobasil, dan palisade), bulat (monokokus, diplokokus, tetrakokus,
sarcina, streptokokus, dan stafilkokus), dan sprilal (spiral dan vibrio).
Bakteri tahan asam (BTA) merupakan bakteri yang memiliki ciri-ciri yaitu
berantai karbon (C) yang panjangnya 8 - 95 dan memiliki dinding sel yang tebal
yang terdiri dari lapisan lilin dan asam lemak mikolat, lipid yang ada bisa
mencapai 60% dari berat dinding sel. Bakteri yang termasuk BTA antara lain
Mycobacterium tuberculose, Mycobacterium bovis, Mycobacterium leprae,
Nocandia meningitidis, dan Nocandia gonorrhoeae. Mycobacterium tuberculose
adalah bakteri patogen yang dapat menyebabkan penyakit tuberculose, dan
bersifat tahan asam sehingga digolongkan sebagai bakteri tahan asam (BTA).
Penularan Mycobacterium tuberculose terjadi melalui jalan pernafasan.
Pewarnaan tahan asam memilahkan kelompok Mycobacterium dan Nocandia
dengan bakteri lainnya. Kelompok bakteri ini disebut bakteri tahan asam karena
dapat mempertahankan zat warna pertama (carbol fuchsin) sewaktu dicuci
dengan larutan pemucat (alkohol asam). Larutan asam terlihat berwarna merah,
sebaliknya pada bakteri yang tidak tahan asam karena larutan pemucat (alkohol
asam) akan melakukan reaksi dengan carbol fuchsin dengan cepat, sehingga sel
bakteri tidak berwarna.
Dinding bakteri yang tahan asam mempunyai lapisan lilin dan lemak yang
sukar ditembus cat. Oleh karena pengaruh fenol dan pemanasan maka lapisan
lilin dan lemak itu dapat ditembus cat basic fuchsin. Pada waktu pencucian
lapisan lilin dan lemak yang terbuka akan merapat kembali. Pada pencucian
 dengan asam alkohol warna fuchsin tidak dilepas. Sedangkan pada bakteri tidak
tahan asam akan luntur dan mengambil warna biru dari methylen blue.
Sebagai tenaga analis kesehatan dibutuhkan keterampilan dalam membuat
spesimen yang berguna dalam pemeriksaan spesimen di laboratorium. Bakteri
umumnya memiliki warna yang transparan maka dari itu diperlukan pewarnaan
bakteri agar bentuk dan struktur bakteri dapat terlihat lebih jelas jika diamati
dengan mikroskop cahaya. Hal tersebut yang melatarbelakangi penulis untuk
mengangkat permasalahan ini sebagai masalah yang akan dibahas dalam laporan
praktikum dengan judul “Pewarnaan Bakteri Tahan Asam (BTA) ”.
1.2 Maksud Dan Tujuan Praktikum
Adapun maksud dan tujuan praktikum yaitu untuk mengetahui teknik
pewarnaan BTA metode Ziehl Neelseen dan metode Kinyoun Gabbet.
1.3 Manfaat Praktikum
Agar mahasiswa dapat mengetahui teknik pewarnaan pewarnaan BTA metode
Ziehl Neelseen dan metode Kinyoun Gabbet. Serta mahasiswa dapat membeda-
kan bakteri tahan asam (BTA) yang positif dan negatif.
 BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Pengertian Bakteriologi
Bakteriologi merupakan ilmu yang mempelajari tentang kehidupan dan
klasifikasi bakteri. Bakteriologi dapat dikatakan juga sebagai biologi bakteri. Di
dalamnya dipelajari struktur anatomi bakteri sel bakteri, klasifikasi, cara kerja sel
bakteri, interasksi antarsel bakteri, dan juga tanggapan bakteri terhadap
perubahan pada lingkungan hidupnya. Bakteriologi merupakan satu bagian
penting dalam mikrobiologi. Bakteri memiliki nilai ekonomi penting dalam
kehidupan manusia dan demikian pula dengan bakteriologi. Pengetahuan dalam
cabang ilmu ini bermanfaat dalam pengobatan, hygiene, ilmu pangan dan gizi,
pertanian, dan industri (terutama industri fermentasi). (Dini,N. 2014)
2.2 Pengertian Bakteri
Bakteri berasal dari kata latin bacterium (jamak, bacteria) adalah kelompok
raksasa dari organisme hidup. Mereka sangatlah kecil (mikroskopi) dan
kebanyakan uniseluler, dengan struktur sel yang relatif sederhana tanpa
nukleus/inti sel, sitoskeleton, dan organel lain seperti mitokondria dan kloroplas.
Bakteri merupakan organisme yang termasuk ke dalam domain prokariotan
dan berukuran sangat kecil (mikroskopik), serta memiliki peran besar dalan
kehidupan di bumi.
Struktur sel bakteri relatif sederhana yaitu tanpa nukleus atau inti sel,
kerangka sel, dan organel-organel lain seperti mitokondria dan kloroplas.
2.3 Tujuan Pewarnaan
Pewarnaan bertujuan untuk memperjelas sel bakteri dengan menempelkan zat
warna ke permukaan sel bakteri. Zat warna dapat mengabsorbsi dan membiaskan
cahaya, sehingga kontras sel bakteri dengan sekelilingnya ditingkatkan. Zat
warna yang digunakan bersifat asam atau basa. Pada zat warna basa, bagian yang
berperan dalam memberikan warna disebut kromotor dan mempunyai muatan
positif. Sebaliknya pada zat warna basa lebih banyak digunakan karena muatan
negatif banyak ditemukan pada permukaan sel. Contoh zat warna asam antara
lain Crystal Violet, Methylene Blue, Safranin, Base Fuchsin, Malachite Green
dan lain-lain. Sedangkan zat basa antara lain Eosin, Congo Red, dan lain-lain.
(Irawan, 2008).
2.4 Faktor – faktor yang Mempengeruhi Pewarnaan
Faktor-faktor yang mempengaruhi pewarnaan bakteri yaitu fiksasi, peluntur
warna, substrat, intensifikasi, pewarnaan dan penggunaan warna penutup. Suatu
preparat yang sudah menyerap warna, kemudian dicuci dengan asam encer maka
zat warna terhapus. Sebaliknya terdapat juga preparat yang tahan terhadap asam
encer. Bakteri-bakteri ini disebut bakteri tahan asam, dan ini merupakan ciri khas
bagi suatu spesies. (Dwidjoseputro, 1994).
Langkah-langkah utama dalam persiapan spesimen mikroba untuk
pemeriksaan mikroskopik adalah :
1. Penempatan olesan atau lapisan specimen pada kaca objek.
2. Fiksasi olesan pada kaca objek.
3. Aplikasi pewarna tunggal (pewarnaan sederhana) atau serangkaian larutan
pewarna atau reagen. (Pelczar, 1986).
2.5 Tekhnik Pewarnaan Bakteri
Teknik pewarnaan pada bakteri dapat dibedakan menjadi empat macam yaitu
pengecatan sederhana, pengecatan negatif, pengecatan diferensial, dan
pengecatan struktural. Pemberian warna pada bakteri atau jasad-jasad renik lain
dengan menggunakan larutan tunggal suatu pewarnaan pada lapisan tipis, atau
olesan, yang sudah difiksasi, dinamakan pewarnaan sederhana. Prosedur
pewarnaan yang menampilkan perbedaan di antara sel-sel microbe atau bagian-
bagian sel microbe disebut teknik pewarnaan diferensial. Sedangkan pengecatan
strukturan hanya mewarnai satu bagian dari sel sehingga dapat membedakan
bagian-bagian dari sel. Termasuk dalam pengecatan ini adalah pengecatan
endospora, flagella dan pengecatan kapsul. (Waluyo, 2010).
Pada umumnya, olesan bakteri terwarnai mengungkapkan ukuran, bentuk,
susunan dan adanya struktur internal seperti spora dan butiran zat pewarna
khusus diperlukan untuk melihat bentuk kapsul ataupun flagella, dan hal-hal
terperinci tertentu di dalam sel. Zat pewarna adalah garam yang terdiri atas ion
positif dan ion negatif, yang salah satu diantaranya berwarna. (Volk dan Whleer,
1998).

2.6 Morfologi Bakteri

 Secara bahasa, morfologi artinya pengetahuan tentang bentuk. Morfologi
dalam bidang ilmu biologi ialah ilmu tentang bentuk organisme terutama hewan
dan tumbuhan yang mencakup bagian-bagiannya. Bakteri dapat dibedakan
menjadi tiga bentuk utama, yaitu :
2.6.1 Bentuk Bulat (Kokus)
Bakteri berbentuk bulat (kokus = sferis / tidak bulat betul) dibagi
menjadi bentuk-bentuk sebagai berikut :
1. Monokokus, berbentuk bulat, satu-satu, contohnya Monococcus
gonorhoe.
2. Diplokokus, bentuknya bulat bergandengan dua-dua, misalnya
Diplococcus pneumonia.
3. Monokokus, berbentuk bulat, satu-satu, contohnya Monococcus
gonorhoe.
4. Diplokokus, bentuknya bulat bergandengan dua-dua, misalnya
Diplococcus pneumonia.
5. Streptokokus, memiliki bentuk bulat bergandengan seperti rantai,
sebagai hasil pembelahan sel kesatu atau dua arah dalam satu garis.
6. Tetrakokus, berbentuk bulat terdiri atas 4 sel yang tersusun dalam
bentuk bujur sangkar sebagai hasil pembelahan sel kedua arah.
7. Sarkina, berbentuk bulat terdiri atas 8 sel yang tersusun dalam bentuk
kubus sebagai hasil pembelahan sel ketiga arah, contohnya Sarcina sp.
8. Stafilokokus, berbentuk bulat, tersusun seperti kelompok buah anggur
sebagai hasil pembelahan sel kesegala arah. Contohnya Staphylococcus
sp.
9. Mikroococcus, jika kecil dan tunggal.
2.6.2 Bentuk Batang (Basil)
Bakteri bentuk batang dapat dibedakan ke dalam bentuk batang panjang
dan batang pendek, dengan ujung datar atau lengkung. Bentuk batang dapat
dibedakan lagi atas bentuk batang yang mempunyai garis tengah sama atau
tidak sama diseluruh bagian panjangnya. Selain itu bakteri bentuk batang
juga dapat dipisahkan sebagai berikut :
1. Basil tunggal, berupa batang tunggal, contohnya Escherichia coli dan
Salmonella typi.
2. Diplobasil, berbentuk batang bergandengan dua-dua. Contohnya
Diplobacillus sp.
3. Streptobasil, berupa batang bergandengan seperti rantai. Contohnya
Streptobacillus moniliformis dan Azotobacter sp.

2.6.3 Bentuk Lengkung (Spiral)

Spiral dibagi menjadi :
1. Koma (Vibrio), berbentuk lengkungan kurang dari setengah lingkaran.
Contohnya Vibrio colerae, penyebab penyakit kolera.
 2. Spiral, berupa lengkungan lebih dari setengah lingkaran, contohnya
Spirillium minor yang menyebabkan demam dengan perantara gigitan
tikus atau hewan pengerat lainnya.
3. Spirooseta, berupa spiral yang halus dan lentur. Contohnya Treponema
pallidum, penyebab penyakit sifilis.

2.7 Pewarnaan BTA

Pewarnaan BTA dapat dibedakan menjadi 2 golongan, yaitu bakteri tahan
asam yang akan tetap mengikat zat pewarnaan primer (karbol fuksin) dan tidak
akan dilepas pada pencucian alkohol asam, serta tidak akan mengikat zat warna
sekunder (methylen blue), sedangkan bakteri tidak tahan asam akan melepaskan
zat warna primer pada pencucian alkohol asam dan akan mengikat zat warna
sekunder. Ada beberapa cara mewarnai bakteri tahan asam yaitu. Menurut Ziehl-
Neelseen, menurut Tan Thiam Hok (1957) yang disebut juga pewarnaan
Kinyoun-Gabbet, pserta pewarnaan dengan Auramen-Phenol Fluorchrome.
Teknik pewarnaan ini dapat digunakan untuk mendiagnosa keberadaan bakteri
penyebab tuberkulosis yait Mycobacterium tuberculosis. Ada beberapa cara
pewarnaan tahan asam, namun yang paling bayak adalah cara menurut Ziehl-
Neelseen (Hadiotomo, 1990).
2.8 Menurut Ziehl Neelseen
Bakteri genus mycobacterium dan beberapa spesies nocardia pada dinding
selnya mengandung banyak zat lipoid (lemak) sehingga bersifat permiable
dengan pewarnaan biasa. Bakteri tersebut bersifat tahan asam (+) terhadap
 pewarnaan tahan asam. Pewarnaan tahanasam dapat digunakan untuk membantu
menegakkan diagnosa tuberkulosis. Pewarnaan tahan asam menggunakan larutan
ziehl neelseen A (cat karbol fuchsin), Ziehl-Neelseen B (alkohol asam : HCl 3%
dalam metanol 95%) dan Ziehl-Neelseen C (cat biru metilen). Hasil pewarnaan
maka bakteri tahan asam akan berwarna merah dan bakteri tidak tahan asam akan
berwarna biru. (Lay, B.W, 1994).
2.9 Menurut Kinyoun Gabbet
Dinding bakteri yang tahan asam mempunyai lapisan lilin dan lemak yang
sukar ditembus cat. Oleh karena pengaruh fenol dan kadar cat yang tinggi maka
lapisan lilin dan lemak itu dapat ditembus cat basic fuchsin. Pada waktu
pencucian lapisan lilin dan lemak yang terbuka akan merapat kembali. Pada
pencucian dengan asam alkohol warna fuchsin tidak dilepas. Sedangkan pada
bakteri tidak tahan asam akan luntur dan mengambil warna biru dari methylen
blue. (Lay, B.W, 1994).
2.10Mycobactereria
Mycobacteria adalah bakteri aerob berbentuk batang, yang tidak
membentuki spora. Walaupun tidak mudah diwarnai bakteri ini tahan terhadap
penghilangan warna (deklorisasi) oleh asam atau alkohol dan karena itu
dinamakan basil tahan asam. Ciri-ciri khas Mycrobacterium tuberculosisi dalam
jaringan, basil tuberkel merupakan batang ramping lurus berukuran kira-kira 0,4
x 3 µm. Pada perbenihan buatan terlihat bentuk coccus dan filamen.
Mycobacteria tidak dapat diklasifikasikan sebagai gram positif atau gram negatif.
Sekali diwarnai denganzat warna basa, warna tersebut tidak dapat dihilangkan
dengan alkohol, meski dibubuhi dengan iodium. Basil tuberkel yang sebenarnya
ditandai oleh sifat tahan asam misalnya 95 % etil alkohol yang mengandung 3 %
asam hidroklorida (asam alkohol) den dengan cepat akan menghilangtkan warna
semua bakteri kecuali Mycobacteria. Sifat tahan asam ini bergantung pada
integritas struktur selubung berlilin. Pada dahak atau irisan jaringan,
Mycobacteria dapat dioperlihatkan karena memberi fluoresensi kuning jingga
setelah diwarnai dengan zat warna fluorokrom (misalnya auramin, rodamin) (Staf
Pengajar FKUI, 1994).
Mycobacterium tuberculosis berbentuk batang lurus atau agak bengkok
dengan ukuran 0,2 - 0,4 x 1 – 4 µm. Pewarnaan Ziehl-Neelsen dipergunakan
untuk identifikasi bakteri tahan asam. Kuman ini tumbuh lambat, koloni tampak
setelah lebih kurang 2 minggu bahkan kadang-kadang setelah 6-8 minggu.
Suhuoptimum 37oC, tidak tumbuh pada suhu 25oC atau lebih dari 40oC. medium
padat yang biasa dipergunakan adalajh Lowenstein-Jensen. PH optimum 6,4 -
7,0. Mycobacterium tidak tahan panas, akan mati pada 6oC selama 15-20 menit.
Biakan dapat mati jika terkena sinar matahari langssung selama 2 jam. Dalam
dahak dapat bertahan hidup 8-10 hari. Biarkan bail ini dalam suhu kkamar dapat
hidup 6-8 bulan dan dapat disimpan dalam lemari dengan suhu 20 oC selama 2
tahun. Mykrobakteri tahan terhadap berbagai khemikalia dan desinfektan antara
lain phenol 5 % asam sulfat 15 %, asam sitrat 3 % dan NaOH 4%. Basil ini
dihancurkan oleh iodium tinetur dalam 5 menit, dengan alkohol 80 % akan
hancur dalam 2-10 menit (Lay, 1994).
Mycobacterium tuberculosis menyebabkan tuberculosis dan merupakan
patogen yang berbahaya bagi manusia. Mycobacterium leprae menyebabkan
lepra. Micobacterium avium-intracellulare (kompleks M. avian)dan mikobakteria
apitik lain yang sering menginfeksi pasien AIDS, adalah patogen ortunistik pada
orang-orang dengan fungsi imun yang terganggu lainnya, dan kadang-kadang
menyebabkan penyakit pada pasien dengan sistem imun yang normal
(Syahrurachman, 1994).
Micobacterium tuberculosis dan sering digunakan dalam “Screening TBC”.
Efektifitas dalam menemukan infeksi TBC dengan uji tuberkulin adalah lebih
dari 90 %. Uji tuberkulin dibaca setelah 48-72 jam (saat ini dianjurkan 72 jam)
setelah penyuntikan. Indurasi diperiksa dengan cara palpasi untuk menentukan
tepi indurasi, ditandai dengan alat tulis, kemudian diukur dengan alat pengukur
transparan, diameter transversal indurasi yang terjadi dan dinyatakan hasilnuya
dalam milimeter (Sechlegel, 1994).
 Untuk waktu yang lama diasumsikan bahwa infeksi tuberkulosis (TB)
melindungi infeksi berikutnya. Bahkan, vaksinasi terhadap penyakit menular
didasarkan pada prinsip ini. Namun, pada tahun 1976 sudahh ada indikasi
anekdotal bahwa pasien TB bisa terinfeksi kembali dengan strain tuberkulosis
lain Mycobacteria dan bahwa infeksi dengan beberapa strain ada. Menggunakan
phage, Bates et al. menemukan jenis fag berbeda Mycobacterium tuberculosis di
host tunggal. Terjadinya infeksi dengan menggunakan teknik sidik jari DNA,
pertama pada pergantian abad pada pasien yang dipilih oleh Yeh et al. dan
Braden dkk. dan kemudian baru-baru ini dalam yang lebih besar masuk dalam
populasi pasien. Pengenalan molekul teknik yang ditawarkan kemungkinan baru
untuk mempelajari sejarah alam infeksi TB lebih luas. PCR penargetan tertentu
dominan Mycobacterium tuberculosis keluarga genotipe dikembangkan, dan
dengan menerapkan metode ini untuk bahan klinis, Warren et al. menemukan
bahwa tingkat terjadinya “infeksi campuran,” yaitu, infeksi dengan beberapa
strain tuberculosis, sebesar 19 % dari pasien yang diperiksa di Afrika Selatan
(Huyen, Mai, dkk, 2012).
Pada tahun 1898, Harvard patologi Theobald Smith menunjukkan bahwa
basil tuberkulum terisolasi dari manusia berbeda secara signifikan dari basil
diisolasi dari ternak dalam kapasitas mereka untuk menyebabkan penyakit pada
spesies binatang yang berbeda. Akhirnya, dua basil diberi status spesies terpisah,
dengan Mycobacterium tuberculosis menunjuk patogen manusia yang khas, dan
Mycobacterium bovis mengacu pada bentuk sapi. Karena Mycobacterium bovis
memiliki kapasitas untuk menyebabkan penyakit pada berbagai spesies hewan,
termassuk manusia, itu awalnya dianggap menunjukkan kisaran inang yang lebih
luas dari pada Mycobacterium tuberculosis. Namun, analisis genomik komparatif
baru-baru ini telah mengungkapkan seperti tingkat tinggi keragaman genetik di
Mycobacterium bovis bahwa genetika populasi modern saat ini
mempertimbangkan spesies yang akan terdiri dari beberapa ekotipe, masing-
masing yang disesuaikan dengan spesies tertentu host hewan. Beberapa ekotipe
ini telah diberikan sebutan spesies yang berbeda. Sebagai contoh,
Mycobacterium microty adalah patogen voles, Mycobacterium pinnipedii patogen
dari anjing laut dan singa laut, dan Mycobacterium caprae patogen kambing
(Hershberg, et.,al, 2008).
Mycobacterium tidak dapat diwarnai dengan cara Gram, tetapi jika berhasil
maka hasilnya adalah Gram positif. Perlakuannya dengan cara pemanasan,
pencucian dengan cara menggunakan air mengalir, pemberian zat warna dan
pemberian alkohol. Tujuan pencucian dengan menggunakan alkohol adalah
supaya warna merah yang tersisa setelah ditetesi karbol fuchsin hilang.
Sedangkan perlakuan pencucian dengan menggunakan air mengalir bertujuan
untuk menutup kembali lemaknya. Pemberian zat warna seperti karbol fuchsin
dan metilen blue bertujuan untuk mematikan bakteri Mycrobacterium
tuberculosis. Zat warna yang dapat membutuh Mycobacterium tuberculosis
adalah Malachite green. Hasil preparat menunjukan sel berwarna merah dengan
dengan background biru, hal ini disebabkan karen karbol fuchsin bersifat asam
sehingga dapat diserap oleh dinding sel bakteri tersebut. Sedangkan metilen biru
bersifat basa sehingga tidak dapat diserap oleh dinding tidak dapat diserap oleh
dinding sel bakteri (Pelczar dan Chan, 1986).
 BAB III
METODE PRAKTIKUM
3.1 Alat
1. Lampu bunsen
2. Lidi
3. Baki pewarnaan
4. Pipet
5. Kaca objek
3.2 Bahan
1. Sputum/dahak
2. Methylen blue
3. Karbol fuksin
4. Asam alkohol
5. Larutan Kinyoun
6. Larutan gabbet
7. Oil imersi
3.1 Prosedur Kerja
A. Metode Zielh-Neelsen
1. Menyiapkan alat dan bahan yang akan digunakan
2. Diambil kaca sediaan yang bersih, bebas lemak, dan tidak ada goresan
3. Lampu spritus dinyalakan
4. Dengan menggunakan sepotong lidi steril yang telah ditumbuk
menyerupai serabut disalah satu ujung lidi, ambil bagian sputum lalu
diletakkan pada kaca sediaan
5. Dibuat pulasan yang tipis pada permukaan yang telah dibersihkan.
6. Pulasan bakteri dikeringkan, kemudian dilakukan fiksasi 2-3 berturut-turut
pada ujung api bunsen, lalu didinginkan.
7. Letakkan sediaan diatas rak pewarnaan dengan apusan menghadap keatas.
8. Tuangkan karbol fuksin sampai menutupi seluruh permukaan kaca sediaan
 9. Memanaskan preparat secara hati-hati selama 5 menit sampai terlihat uap
(Jangan sampai mendidih)
10. Bilas dengan air. Kaca objek yang dipanaskan harus didinginkan terlebih
dahulu sebelum dibilas.
11. Pucatkan dengan asam alkohol sampai warna merah dari fuksin hilang
12. Sediaan dicuci dengan air
13. Tuangkan larutan Methylen blue di atas sediaan diamkan selama 1 menit
14. Bilas apusan dengan air keran
15. Keringkan, lalu amati pada mikroskop dengan pembesaran lensa objektif
100 x dengan menambahkan oil imersi.
B. Metode Kinyoun-Gabbet
1. Menyiapkan alat dan bahan yang akan digunakan
2. Diambil kaca sediaan yang bersih, bebas lemak, dan tidak ada goresan
3. Lampu spritus dinyalakan
4. Dengan menggunakan sepotong lidi steril yang telah ditumbuk
menyerupai serabut disalah satu ujung lidi, ambil bagian sputum lalu
diletakkan pada kaca sediaan
5. Dibuat pulasan yang tipis pada permukaan yang telah dibersihkan.
6. Pulasan bakteri dikeringkan, kemudian dilakukan fiksasi 2-3 berturut-turut
pada ujung api bunsen, lalu didinginkan.
7. Sediaan diwarnai dengan larutan Kinyoun selama 3 menit, cuci dengan air
8. Kemudian sediaan diwarnai dengan larutan gabbet selama 1 menit, cuci
dengan air, keringkan.
9. Setelah kering, sediaan diamati dibawah mikroskop dengan pembesaran
objektif 100x menggunakan oil imersi
 BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Hasil

No Metode Gambar Keterangan

Metode Ziehl Hasil yang di

Neelsen peroleh negative

Metode Hasil yang di

Kinyoun Gabbet peroleh negative

4.2 Pembahasan

Pada praktikum kali ini dilakukan pewarnaan tahan asam untuk

mengidentifikasi dan mengamati bakteri yang bersifat tahan asam, bakteri ini
disebut tahan asam karena akan mempertahankan zat warna perimer ketika
ditambahkan larutan asam, bakteri ini memiliki rantai karbon 8-95 dan dinding
selnya terdiri dari lapisan lilin, asam lemak mikolat, dan lipid sampai 60 % dari
berat dinding selnya, sehingga dengan tebalnya kadar lipid pada dinding sel
menyebabkan bakteri ini sulit untuk dilakukan dengan pewarnaan biasa dan perlu
perwarnaan khusus. Sebelum melakukan praktikum dilakukan teknis aseptis, hal
ini bertujuan untuk mencegah atau meminimaliskan adanya kontaminasi
mikroorganisme baik pada sampel atau praktikan sendiri. Bakteri yang termasuk
BTA antara lain Mycobacterium tuberculose, Mycobacterium bovis,
Mycobacterium leprae, Mycobacterium avium, Nocandia meningitidis, dan
Nocandia gonorrhoeae. Mycobacterium tuberculose adalah bakteri patogen yang
dapat menyebabkan penyakit tuberculosis, dan bersifat tahan asam sehingga
digolongkan sebagai bakteri tahan asam (BTA). Penularan Mycobacterium
tuberculose terjadi melalui jalan pernafasan. Teknik pewarnaan ini dapat
digunakan untuk mendiagnosa keberadaan bakteri penyebab tuberkulosis
yaitu Mycobacterium tuberculosis.
Mycobacterium tuberculose merupakan bakteri gram positif (+), batang sedikit
bengkok, panjang atau pendek, tidak berspora, tidak berkapsul, pertumbuhan
sangat lambat 2 - 8 minggu, suhu optimal 37 - 38 oC. Mycobacterium tahan
terhadap asam dan alkali dibanding dengan kuman lain sehingga apabila bahan
spesimen mengandung kuman lain dapat dibunuh dengan mudah sehingga
spesimen menjadi lebih murni.
Metode pewarnaan yang digunakan yaitu fase Observasi Laboratorik, dimana
secara teknis penglihatan pada lapangan pandang di mikroskop, memiliki
perbedaan dimana metode Ziehl Neelsen jauh sangat baik dibandingkan dengan
metode Kinyoun-Gabbet, yakni: pada Kinyoun-Gabbet latar malah berwarna
keunguan, lekosit ungu, buram/kabur, sedang bakteri merah pucat. Dan pada hasil
metode Ziehl Neelsen tampak latar berwarna biru, lekosit biru dan jelas, bakteri
merah jelas/merah bagus.
Pada praktikum pertama menggunakan metode pewarnaan Ziehl Neelsen untuk
identifikasi dan pengamatan bakteri tahan asam, karena metode ini merupakan
salah satu metode pengujian bakteri tahan asam yang cukup sederhana dan
memiliki spesipisitas dan sensitivitas yang cukup tinggi. Pewarnaan tahan asam
menggunakan larutan ziehl-Neelsen A (cat karbol fuchsin), Ziehl-Neelsen B
(alkohol asam :HCL 3% dalam metanol 95%) dan ziehl –neelsen C (cat biru
metilen). Hasil pewarnaan maka bakteri tahan asam akan berwarna merah dan
bakteri tidak tahan asam akan berwarna biru.
 Pada praktikum hal yang pertama dilakukan adalah pengolesan sampel pada
kaca preparat secara aseptis dalam hal ini sampel yang digunakan merupakan
sputum/dahak dari pasien J, Kemudiaan menyalakan api spiritus untuk melakukan
fiksasi dan menjaga agar lingkungan pada proses pemindahan sampel dari kotak
dahak ke kaca preparat tetap dalam keadaan steril atau mencegah kontaminan lain
masuk ke dalam sampel. Tujuan fiksasi untuk merekatkan sel bakteri pada preparat
objek, setelah itu sampel yang telah difiksasi digenangi denga karbol fuksin
selama 5 menit dan dilakukan pemanasan, lama waktu yang dibutuhkan bertujuan
untuk agar zat warna karbol fuksin ini dapat berpenetrasi secara sempurna ke
dalam dinding sel bakteri, dan dimana karbol fuksin ini merupakan zat pewarna
primer yang mengandung fucsin basa dan fenol, sehingga dengan adanya fenol
pada karbol fuksin ini dapat berfungsi untuk melunakan lapisan lilin pada dinding
sel bakteri sehingga cat warna fuksin dapat masuk ke dalam sel, hal ini tentu
dibantu dengan proses pemanasan yang mengakibatkan terbukanya pori-pori
lemak yang menutupi dinding sel bakteri sehingga fungsi fenol pada karbol fuksin
dapat berjalan dengan baik, namun pada pemanasan ini sampel harus dijaga jangan
sampai mengering atau terlalu panas karena akan menyebabkan bakteri mati dan
tidak akan dapat teridentifikasi. Selanjutnya dilakukan pencucian dengan
mengaliri aquadest pada sampel, hal ini bertujuan untuk mencegah adanya
kelebihan zat warna pada sampel, kemudian ditambahkan asam alcohol selama 15
detik, penambahan ini diperlukan untuk melakukan pemucatan pada bakteri yang
dimana hal ini akan menentukan bakteri tersebut tahan asam atau tidak dimana jika
bakteri bersifat tahan asam, bakteri tersebut tidak akan melepaskan zat warna
primer sebelumnya, namun jika non BTA maka bakteri akan melepaskan zat warna
primernya. Penambahan asam alcohol ini tidak boleh dilakukan secara berlebihan
karena akan menyebabkan overdekolorization sehingga BTA dan non BTA tidak
dapat dipisahkan, namun jangan pula terlalu sedikit dalam penambahan asam
alcohol pada bakteri karena akan menyebabkan underdecolorization yang dapat
menyebabkan zat warna pada non BTA tidak seluruhnya terlepas yang
mengakibatkan terjadinya ketidak akuratan dalam proses identifikasi dan
pengamatan apda sampel. Selanjutnya dialiri aquadest untuk menutup pori-pori
bakteri sehingga tidak terjadi lagi proses pemucatan oleh asam alcohol. Kemudian
preparat digenangi dengan metilen blue yang berfungsi sebgai pewarna tandingan,
dimana pewarna ini yang akan menunjukan adanya bakteri non tahan asam, karena
bakteri ini akan melepaskan pewarna primer dan menyerap pewarna sekunder atau
tandingan. Kemudian dibilas dengan aquadest dan dikeringkan dengan kertas
bibulous atau tissu yang berfungsi unuk menyerap kelebihan aquadest pada
sampel. , Setelah ditambahkan minyak emersi dilakukan pengamatan dengan
menggunakan mikroskop pada perbesaran 10 x 100, Selain itu, minyak emersi
juga mempunyai indeks bias yang mendekati atau identik dengan kaca,sehingga
dapat memfokuskan sampel bakteri pada pengamatan mikroskop.
Berdasarkan hasil praktikum ini diperoleh hasil pengamatan latar belakang
berwarna biru tetapi sampel tersebut negative tidak terdapat bakteri
Mycobacterium tuberculose. Bakteri ini bersifat pathogen di dalam tubuh baik
pada manusia maupun hewan, dan bersifat kronis karena membutuhkan waktu
yang lama agar menimbulkan infeksi pada hostnya, berbentuk batang langsing,
lurus atau berbentuk filament. Bakteri ini bersifat aerobik, tidak membentuk spora,
non motil, tahan asam, dan merupakan bakteri gram positif.
Pada praktikum kedua menggunakan metode pewarnaan Kinyoun & Gabbet.
Pewarnaan Kinyoun & Gabbet berbeda dari Ziehl-Neelsen yaitu bahwa tidak
diperlukan pemanasan terhadap warna primer (Larutan Kinyoun). Digunakan
reagen fuksin-karbol yang lebih pekat sehingga zat warna dapat menembus
mikroba sehingga tidak diperlukan pemanasan. Teknik pewarnaan Tan Thiam Hok
(Kinyoun-Gabber) menggunakan larutan Kinyoun dan Gabber. Komposisi larutan
Kinyoun yaitu fuchsin basis 4g, fenol 8ml, alkohol 95% 20ml, H 2O destilata
(100ml) dan larutan gabbett yaitu methylen blue 1gr, H 2SO4 96 % 20 ml, alkohol
absolut 30 ml, dan H2O destilata 50 ml.
Pada praktikum ini hal yang pertama dilakukan sama seperti pada metode Ziehl
Neelseen , yaitu membuat preparat dan memfiksasi. Setelah melakukan fiksasi ,
sediaan diwarnaai dengnan larutan kinyon selama 3 menit dan lama waktu yang
dibutuhkan bertujuan untuk agar zat warna kinyon ini dapat berpenetrasi secara
sempurna ke dalam dinding sel bakteri, dan dimana kinyon ini mengandung fucsin
basa dan fenol, sehingga dengan adanya fenol pada kinyon ini dapat berfungsi
untuk melunakan lapisan lilin pada dinding sel bakteri sehingga cat warna fuksin
dapat masuk ke dalam sel. Selanjutnya dilakukan pencucian dengan mengaliri
aquadest pada sampel, hal ini bertujuan untuk mencegah adanya kelebihan zat
warna pada sampel, kemudian ditambahkan gabbet selama 1 menit, dimana gabbet
mengandung metilen blue yang berfungsi sebgai pewarna tandingan, dimana
pewarna ini yang akan menunjukan adanya bakteri non tahan asam, karena bakteri
ini akan melepaskan pewarna primer dan menyerap pewarna sekunder atau
tandingan. Kemudian dibilas dengan aquadest dan dikeringkan dengan kertas
bibulous atau tissu yang berfungsi unuk menyerap kelebihan aquadest pada
sampel., Setelah ditambahkan minyak emersi dilakukan pengamatan dengan
menggunakan mikroskop pada perbesaran 10 x 100, Selain itu, minyak emersi
juga mempunyai indeks bias yang mendekati atau identik dengan kaca, sehingga
dapat memfokuskan sampel bakteri pada pengamatan mikroskop.
berdasarkan hasil praktikum ini diperoleh hasil pengamatan latar belakang
berwarna biru tetapi sampel tersebut negative tidak terdapat bakteri
Mycobacterium tuberculose. Bakteri ini bersifat pathogen di dalam tubuh baik
pada manusia maupun hewan, dan bersifat kronis karena membutuhkan waktu
yang lama agar menimbulkan infeksi pada hostnya, berbentuk batang langsing,
lurus atau berbentuk filament. Bakteri ini bersifat aerobik, tidak membentuk spora,
non motil, tahan asam, dan merupakan bakteri gram positif.

BAB V
PENUTUP
 Saran

DAFTAR PUSTAKA

Dini. N. 2014. Pengertian Entomologi Bakteriologi. http://diniersmansa.blogspot.co

m/2014/08/pengertian-entomologi-bakteriologi-dan.html?m%3D1&hl=id-ID.
Diakses pada tanggal 29 Maret 2018

Dwidjoseputro, D. 1998. Dasar-dasar Mikrobiologi. Malang : Djambatan.

Hadiotomo, Ratna Siri. 1990. Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek Jakarta : Pt
Gramedia.

Hershberg, et.,al. 2008. High Functional Diversity in Mycobacterium tuberculosis

Driven by Genetic Drift and Human Demography. PloS Biol 6(12): e311.
doi:10.1371/journal.pbio.0060311.

Huyen, Mai, dkk. 2012. Mixed Tuberculosis Infections in Rular South Vietnam.
Journal of Clinical Microbiology.

Irawan. 2008. Teknik Pewarnaan Mikroba. http://wordbiology.wordpress.com.

Diakses pada tanggal 29 Maret 2018.

Lay, B.W. 1994. Analisis Mikroba di Laboratorium. Jakarta : PT. Raga Grafindo
Persada.

Pelczar. 1986. Dasar-dasar Mikrobiologi 1. UI Press, Jakarta.

Pelczar dan Chan. 1986. Elements of Mycrobiology. New York : Mc grow-Hill Book
Company.
Sechlegel, H.G. And Schimt, K. 1994. Mikrobiologi Umum. Yogyakarta :UGM Press.

Staf pengajar FKUl. 1994. Buku Ajar Mikrobiologi Kedokteran. Jakarta : Binawa
Aksara.

Syahrurachman, dkk. 1994. Buku Ajar Mikrobiologi Kedokteran Edisi Revisi. Jakarta
: UI Press.

Volk dan Whleer. 1998. Mikrobiologi Dasar Jilid I. Jakarta : Erlangga.

Wuloyo, lud. 2010. Buku Petunjuk Praktikum Mikrobiologi Umum. UMM. Malang.