Anda di halaman 1dari 24

MAKALAH BIOTEKNOLOGI FARMASI

“REKAYASA GENETIKA”

DISUSUN OLEH

KELOMPOK 1

SYAMSUL LAKAHORO G 701 17 041

NADA MELENIA G 701 17 111

RINI SAPUTRI G 701 17 003

NINA KARLINA MAARUF G 701 17 209

JURUSAN FARMASI

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

UNIVERSITAS TADULAKO

PALU

2019
KATA PENGANTAR
Segala puji syukur kehadirat Allah SWT. Shalawat dan salam selalu
tercurahkan kepada Rasulullah SAW. Berkat limpahan rahmatnya penyusun
mampu menyelesaikan tugas makalah ini guna memenuhi tugas mata kuliah
Bioteknologi farmasi.

Dalam penyusunan materi ini, banyak sekali hambatan atau kesulitan yang
kami hadapi. Namun kami selaku penyusun sangat menyadari bahwa seluruh
kelancaran dalam pembuatan dan penyusunan materi ini tidak lain dan tidak
bukan berkat bantuan, dorongan, dan bimbingan dari orang tua, sehingga segala
hambatan-hambatan yang kami alami dapat teratasi.

Makalah ini disusun agar memberikan wawasan yang lebih luas lagi
kepada pembaca yang khususnya adalah mahasiswa universitas tadulako, yang
dikhususkan lagi bagi mahasiswa jurusan farmasi fakultas MIPA. Kami selaku
penyusun sadar bahwa makalah ini masih banyak kekurangan dan sangat jauh dari
kata sempurna. Oleh karena itu, kepada dosen pembimbing mata kuliah ini kami
meminta masukan-masukan demi memperbaiki pembuatan makalah kami di masa
mendatang dan mengharap kritik serta saran dari seluruh pembaca.

Palu, 19 Oktober 2019

Penyusun
DAFTAR ISI

SAMPUL .................................................................................................................

KATA PENGANTAR .............................................................................................

DAFTAR ISI ............................................................................................................

BAB I PENDAHULUAN ........................................................................................

A. Latar belakang ...............................................................................................


B. Rumusan masalah .........................................................................................
C. Tujuan ..........................................................................................................

BAB II TINJAUAN PUSTAKA ..............................................................................

A. Sruktur Gen Eukariotik dan Prokariotik .......................................................


B. Prinsip Utama Ekspresi Gen ........................................................................
C. Rekayasa Genetika .......................................................................................

BAB III PENUTUP ..................................................................................................

A. Kesimpulan ...................................................................................................
B. Saran .............................................................................................................

DAFTAR PUSTAKA ...............................................................................................


BAB I

PENDAHULUAN

A. Latar Belakang
Rekayasa genetika adalah suatu usaha memanipulasi sifat genetik suatu
mahluk hidup untuk menghasilkan mahluk hidup yang memiliki sifat yang
diinginkan. Rekayasa genetika dapat dilakukan dengan menambah,
mengurangi, atau menggabungkan dua materi genetik (DNA) yang berasal
dari dua organisme berbeda. Rekayasa genetika mengambil gen secara
langsung dari satu organisme dan memasukkan ke organisme lain. Proses ini
jauh lebih cepat, dapat digunakan untuk menyisipkan gen-gen dari organisme
apapun (bahkan organisme dari berbagai domain dan mencegah agar gen yang
tidak diinginkan tidak ikut ditambahkan (Sarwat, A, 2018).

Ilmu yang mendasari berkembangnya rekayasa genetika adalah genetika.


Genetika adalah ilmu tentang keturunan. Dalam ilmu genetika dipelajari
bagaimana sifat keturunan itu diwariskan kepada anak cucu, serta variasi yang
akan timbul di dalamnya. Gen merupakan ruas DNA yang digunakan sebagai
model atau sandi dalam pembentukan RNA atau protein. Gen inilah yang akan
menentukan karakter setiap mahluk hidup dengan cara membentuk protein
atau enzim yang mengkatalis metabolisme. Teori tentang gen ini dikemukakan
oleh Mendel sebagai bapak genetika yang mengemukakan teori gen dimana
sifat mahluk hidup ditentukan oleh satu gen dengan adanya pewarisan sel
(Gusriani, 2018).

B. Rumusan Masalah
1. Bagaimanakah struktur gen eukariotik dan prokariotik?
2. Bagaimanakah prinsip utama ekspresi gen?
3. Apa itu rekayasa genetika?
C. Tujuan
1. Mengetahui struktur gen eukariotik dan prokariotik
2. Mengetahui prinsip utama ekspresi gen
3. Mengetahui rekayasa genetika
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA

A. Struktur Gen Eukariotik dan Prokariotik


Gen (dari bahasa Belanda: gen) adalah unit pewarisan sifat
bagi organisme hidup. Bentuk fisiknya adalah urutan DNA yang
melekat/berada di suatu protein, polipeptida, atau seuntai RNA yang
memiliki fungsi bagi organisme yang memilikinya. Batasan modern gen
adalah suatu lokasi tertentu pada genom yang berhubungan dengan pewarisan
sifat dan dapat dihubungkan dengan fungsi sebagai regulator (pengendali),
sasaran transkripsi, atau peran-peran fungsional lainnya. Penggunaan "gen"
dalam percakapan sehari-hari (misalnya "gen cerdas" atau "gen warna
rambut") sering kali dimaksudkan untuk alel: pilihan variasi yang tersedia oleh
suatu gen. Meskipun ekspresi alel dapat serupa, orang lebih sering
menggunakan istilah alel untuk ekspresi gen yang secara fenotipik berbeda.

Gambar 1. Struktur Gen

1. Struktur gen
Gen merupakan fragment DNA yang da pat ditranskripsikan menjadi
RNA dan diterjemahkan menjadiprotein, yang selanjutnya mampu
mempengaruhiproses fisiologi tanaman maupun fenotipenya. Pada
dasarnya gen tersusun oleh empat komponen:
a. Regulator. Merupakan bagian dari gen ya ng berperan dalam pola
aktivasi suatu gen (pada rangkaian fisiologis apa, kondisi apa, fase
perke mbangan apa, atau pada organ apa). Regulator terdapat pada
awal sebuah gen mendahului promotor. Regulator terdiri dari tiga
elemen responsif yaitu HSE (Heat Shock response Element), GRE
(Glucocorticoid Response Element ) dan SRE ( Serum Response
Element).
b. Promotor. Merupakan bagian dari gen yang berperan dalam
penentuan utas yang akan dikode untuk dit raskripsikan dan kapan
titik awal transkripsi akan dilakukan. Letak promotor berada
sebelum titik awal transkripsi, sehingga jarak dari titik inisiasi
dinotasikan de ngan tanda '-', atau disebut arah downstream.
Promotor yang paling umum terdapat da lam gen tanaman adalah
TATA box. Selain TATA box (TATAAA, 10 bp), jenis promotor
lainnya adalah CAAT box (GGCCAATCT, 22 bp), GC box (
GGGCGG, 20bp), Octamer (ATTTGCAT, 20 bp), kB
(GGGACTTTCC, 10 bp) dan ATF (GTGACGT, 20 bp).
c. Transcribed Region. Merupakan bagian gen ya ng akan
ditranskripsikan menjadi RNA. Bagian ini dimulai dari titik awal
transkripsi (start s ite) hingga titik akhir transkripsi ( termination
site ). Notasi mulai start site adalah `+' atau uptream. Dalam
bagian i ni terdapat bagian ya ng akan dibawa keluar dari inti sel
yang disebut exon, dan bagian yang akan tetap ditinggalkan di
dalam i nti sel, yang disebut intron. Pada bagian exon mRNA,
terdapat bagian yang akan diterjemahkan menjadi rantai asam
amino ( Open Reading Frame/ORF ) dan bagian yang tidak
diterjemahkan (Un-translated Region/UTR).
d. Terminator. Merupakan bagian sekuens DNA dari suatu gen yang
memberi tanda kepada enzim penyus un RNA (RNApolymerase)
untuk menghentikan proses pemanjangan rantai RNA.
2. Sel Eukariotik
Pada sel eukariotik, gen dibedakan menjadi 3 macam kelas yakni:
a. Gen kelas I
Meliputi gen-gen yg mengkode 18SrRNA, 28SrRNA dan 5,8SrRNA
(ditranskripsi oleh RNA polimerase I). Pada gen kelas I terdapat dua
macam promoter yaitu promoter antara (spacer promoter) dan
promoter utama.
b. Gen kelas II
Meliputi semua gen yang mengkode protein dan beberapa RNA
berukuran kecil yang terdapat di dalam nukleus (ditranskripsi oleh
RNA polimerase II). Promoter gen kelas II terdiri atas 4 elemen yaitu
sekuens pemulai (initiator) yg terletak pada daerah inisiasi transkripsi,
elemen hilir (downstream) yang terletak disebelah hilir dari titik awal
transkripsi, kotak TATA dan suatu elemen hulu (upstream).
c. Gen kelas III
Meliputi gen-gen yg mengkode tRNA, 5SrRNA dan beberapa RNA
kecil yang ada di dalam nukleus (ditranskripsi oleh RNA polimerase
III). Sebagian besar gen kelas III merupakan suatu cluster dan
berulang.

Gambar 2. Gen eukariotik

Pada sel eukariot, gen terdiri dari


1) Domain regulasi inisiasi transkripsi, yang terdiri antara lain dari deret
GCCACACCC, ATGCAAAT, kotak GC, kotak CCAAT dan kotak
TATA.
2) Intron
3) Ekson, merupakan area kodikasi protein yang dapat ditranskripsi
secara overlapping atau nonoverlapping.[6] Sebagai contoh, pada kode
dengan tiga deret nukleotida (kodon triplet) AUU GCU CAG, dapat
secara dibaca nonoverlapping sebagai AUU GCU CAG atau dibaca
secara overlapping sebagai AUU UUG UGC GCU CUC CAG.
Walaupun pada sekitar tahun 1961, telah diketahui bahwa asam
amino dikodikasi oleh kodon secara nonoverlapping, telah ditemukan
protein berbeda hasil transkripsi dengan
pergeseran overlapping kodon.
4) Domain regulasi akhir transkripsi

3. Sel Prokariotik
Pada prokariot gennya secara umum tersusun atas promotor, bagian
struktural, dan terminator

Gambar 3. Gen prokariotik


1) Promotor
Promotor adalah urutan DNA spesifik yang berperan dalam
mengendalaikan transkripsi gen struktural dan terletak di
daerah upstream (hulu) dari bagian struktural gen. Promotor berfungsi
Sebagai tempat awal pelekatan enzim RNA polimerase yang nantinya
melakukan transkripsi pada bagian struktural. Pada prokariot bagian
penting promotornya disebut sebagai Pribnow box pada urutan
nukleotida -10 dan -35. Biasanya berupa TATA box. Pribnow box
merupakan daerah tempat pembukaan heliks DNA untuk membentuk
kompleks promotor terbuka. Jadi di TATA box itulah DNA dipisahkan
dan kalo di luar TATA box helix DNAnya tetep berikatan.
2) Operator
Operator merupakan urutan nukelotida yang terletak di antara
promotor dan bagian struktural dan merupakan tempat pelekatan
protein represor (penekan atau penghambat ekspresi gen). Jika ada
represor yang melekat di operator maka RNA polimerase g bisa jalan
trus ekspresi gen tidak bisa berlangsung

Gambar 4. Operator

Kalo di gambar di atas operator disimbolkan dengan warna ungu yg


berada di antara promotor (merah) dan structural gene (hijau).Selain
adanya supresor ada juga yg namanya enhancer. kalo supresor untuk
menghambat nah enhancer kebalikannya, dia malah meningkatkan
transkripsi dengan meningkatkan jumlah RNA polimerase. Namun
letaknya tidak pada lokasi yg spesifik spt operator, ada yg jauh
di upstream atau bahkan downstream dari titik awal transkripsi.

3) Coding Region
Gen struktural merupakan bagian yang mengkode urutan nukleotida
RNA. Transkripsi dimulai dari sekuens inisiasi transkripsi (ATG)
sampai kodon stop (TAA / TGA / TAG). Pada prokariot tidak ada
sekuens intron (yg tidak dapat diekspresikan) sehingga semuanya
berupa ekson. Namun kadang pada archaebacteria dan bakteriofag ada
yg memiliki intron.

4) Terminator
Dicirkan dengan struktur jepit rambut / hairpin dan lengkungan yang
kaya yang akan urutan GC yang terbentuk pada molekul RNA hasil
transkripsi.

5) RNA Polimerase
RNA polimerase merupakan enzim yang mengkatalisis proses
transkripsi. Kalo susunannya lengkap α2ββ’σ disebut holoenzim. Kalo
g ada σ cuma α2ββ’ disebut core-enzyme.
Fungsi subuni2 itu:
α = diduga berfungsi dalam penyusunan enzim
β = berfungsi dalam pengikatan nukleotida
β’ = berfungsi dalam penempelan DNA
σ = berfungsi untuk mengarahkan agar RNA polimerase menempel
pada promotor.

B. Prinsip Utama Ekspresi Gen


1. Pengertian
Ekspresi gen adalah suatu istilah yang memiliki perbedaan interpretasi.
Oleh karena itu akan dijelaskan terlebih dahulu pengertian dari gen. Gen
adalah segmen molekul DNA yang mengandung semua informasi yang
diperlukan untuk sintesis produk (rantai polipeptida atau molekul RNA),
yang termasuk rangkaian pengkodean dan non pengkodean (Shils, ME. &
Olson, JA. 1999).

Menurut Dorland (2002), pengertian ekspresi gen adalah sebagai berikut,


pertama adalah aliran informasi genetik dari gen ke protein, kedua
merupakan proses atau pengaturan proses, yang dengannya efek suatu gen
dapat diwujudkan, lalu yang ketiga ekspresi gen merupakan perwujudan
ciri yang dapat diturunkan yang terjadi pada individu pembawa gen yang
menentukan sifat tersebut.

Dari pengertian di atas ekspresi gen merupakan mekanisme dari


transkripsi gen dan translasi mRNA yang berpengaruh terhadap protein
yang diproduksi. Para ilmuwan mengatakan ketika sel mensintesis protein,
gen untuk protein itu telah terekspresi. Sel dapat meregulasi ekspresi gen
untuk membuat tipe protein, dalam jumlah dan angka yang dibutuhkan.
Hampir semua sel tubuh mempunyai gen untuk membuat semua protein
manusia, tetapi tiap jenis sel hanya membuat protein yang mereka
butuhkan. Misalnya, sel pankreas mengekspresikan gen insulin; di sel lain,
gen itu tidak bekerja. Demikian pula dengan sel pankreas tidak membuat
protein hemoglobin, dimana hanya dibutuhkan oleh sel darah merah.
Penelitian baru‐baru ini telah memperkenalkan beberapa hal yang
mengagumkan dari zat nutrisi dapat meregulasi ekspresi gen dan sintesis
protein. Penemuan ini telah memulai untuk menjelaskan beberapa
hubungan antara zat nutrisi, gen, dan perkembangan penyakit. Misalnya
keuntungan dari asam lemak PUFA dalam mencegah penyakit jantung,
telah dapat dijelaskan perannya dalam mempengaruhi ekspresi gen untuk
enzim lipid (Marks, D.B, 2004).

Memang terdapat pengaruh dari interaksi nutrisi dengan gen pada ekspresi
gen, jelasnya zat nutrisi dan komponen makanan lainnya dapat mengubah
suatu individu yang mengalami mutasi yangmempengaruhi proses
metabolik. Banyaknya hubungan yang saling mempengaruhi antara nutrisi
dan genetik melibatkan kemampuan dari zat nutrisi untuk memodulasi
ekspresi gen. Salah satu yang telah diketahui dari interaksi gen dan nutrisi
adalah kemampuan dari zat nutrisi untuk berikatan pada faktor transkripsi.
Ikatan ini dapat meninggi atau mengganggu dengan kemampuan faktor
transkripsi untuk berikatan pada elemen respon dalam bagian promoter
gen, dimana dapat mengambil alih kontrol pengikatan RNA polimerase.
Dalam hal ini, zat nutrisi membantu mengontrol ekspresi gen secara positif
maupun negative (DeBusk, R.M. 2004).

Zat nutrisi dapat mempengaruhi ekspresi gen secara langsung seperti yang
disebutkan di atas atau secara tidak langsung (melalui hormon atau sistem
sinyal), serta kemungkinan lain melalui kontrol translasi mRNA Karena
hal itu, dibutuhkan pemahaman tentang regulasi ekspresi gen (Shils, ME.
& Olson, JA. 1999).

2. Peranan Pengaturan Ekspresi Gen


Ekspresi gen diatur untuk adaptasi, perkembangan, dan diferensiasi.
Walaupun sebagian besar sel dalam suatu organisme memiliki rangkaian
gen yang identik, pada setiap saat, dalam sebuah sel hanya sejumlah kecil
gen yang diekspresikan. Gen lainnya tidak aktif. Organisme memperoleh
sejumlah manfaat dengan mengatur aktivitas gennya. Baik sel prokariotik
maupun eukariotik beradaptasi terhadap perubahan dalam lingkungannya
dengan mengaktifkan atau menghentikan ekspresi gen. Karena proses
transkripsi RNA dan sintesis protein memakan energi cukup banyak, sel
melakukan penghematan bahan bakar dengan cara hanya membuat protein
bila sedang dibutuhkan (Shahib, N. 2002).

Selain beradaptasi terhadap perubahan lingkungan, organisme eukariotik


mengatur ekspresi gennya selama periode perkembangan. Sewaktu sebuah
telur yang telah dibuahi berubah menjadi organisme multisel, terjadi
sintesis bermacam‐macam protein, dalam jumlah yang berbeda. Pada
manusia, sewaktu anak berkembang menjadi remaja lalu dewasa,
perubahan fisik dan fisiologis yang terjadi adalah akibat variasi ekspresi
gen, dengan demikian artinya variasi sintesis protein. Bahkan setelah
organisme mencapai tahap perkembangan dewasa, tetap terjadi pengaturan
ekspresi gen yang memungkinkan sel tertentu menjalani diferensiasi untuk
memperoleh fungsi baru (Shahib, N. 2002).
3. Regulasi Ekspresi Gen Pada Eukariot
Karena adanya perbedaan antara sel eukariotik dan prokariotik,
mekanisme pengaturan kandungan protein antara keduanya juga berbeda
(Shahib, N. 2002).

Dasar molekuler untuk regulasi gen pada sel eukariot, terutama pada sel
manusia, sekarang ini menjadi salah satu yang paling banyak dipelajari
dalam biologi molekuler. Tujuan utamanya adalah untuk menemukan
bagaimana gen berpartisipasi dalam mengontrol program yang terlihat
pada pertumbuhan dan perkembangan sel. Regulasi ekspresi gen pada
eukariot dikontrol oleh mekanisme yang kompleks, dan tidak diorganisasi
di operon (Murray, R.K. 2003).
Sebagai tambahan, menurut Shahib, N (2002) dan Murray, R.K. (2003),
regulasi ekspresi gen dapat terjadi pada tiga tingkat aspek genomik:
a. Pada tingkat DNA. Misalnya, karena modifikasi kimia dari basa, dan
modifikasi histon, dan modifikasi lainnya.
b. Pada tingkat transkripsi. Misalnya, dengan melibatkan faktor
transkripsi, dengan sambungan alternatif, atau tempat alternatif untuk
penambahan ekor poli(A) (tempat poliadenilasi) dapat menghasilkan
mRNA yang berbeda dari hnRNA tunggal. Hal ini menyebabkan
sebuah gen dapat menghasilkan protein yang berlainan.
c. Pada tingkat translasi. Sinyal dari luar tubuh sel dapat mempengaruhi
langkah inisiasi. Stabilitas mRNA juga memainkan peranan. mRNA
dengan waktu‐paruh yang lama menghasilkan lebih banyak protein
daripada mRNA yang memiliki waktu‐paruh yang singkat.

Menurut Murray, R.K. (2003), ada tiga faktor yang sangat penting untuk
memahami ekspresi gen :
a. Sinyal molekuler. Banyak jenis molekul berinteraksi dengan sel, lewat
protein permukaan sel atau reseptor intraseluler merangsang transduksi
sinyal, sehingga sel dapat beradaptasi pada perubahan lingkungan.
b. Tingkat hirarki molekuler. Tingkat dimana dogma central dari biologi
molekuler terlibat dalam ekspresi gen.
c. Mekanisme molekuler.

C. Rekayasa Genetika
1. Pengertian
Rekayasa genetika adalah suatu usaha memanipulasi sifat genetik suatu
mahluk hidup untuk menghasilkan mahluk hidup yang memiliki sifat yang
diinginkan. Rekayasa genetika dapat dilakukan dengan menambah,
mengurangi, atau menggabungkan dua materi genetik (DNA) yang berasal
dari dua organisme berbeda. Rekayasa genetika mengambil gen secara
langsung dari satu organisme dan memasukkan ke organisme lain. Proses
ini jauh lebih cepat, dapat digunakan untuk menyisipkan gen-gen dari
organisme apapun (bahkan organisme dari berbagai domain dan mencegah
agar gen yang tidak diinginkan tidak ikut ditambahkan (Sarwat, A, 2018).

Ilmu yang mendasari berkembangnya rekayasa genetika adalah genetika.


Genetika adalah ilmu tentang keturunan. Dalam ilmu genetika dipelajari
bagaimana sifat keturunan itu diwariskan kepada anak cucu, serta variasi
yang akan timbul di dalamnya. Gen merupakan ruas DNA yang digunakan
sebagai model atau sandi dalam pembentukan RNA atau protein. Gen
inilah yang akan menentukan karakter setiap mahluk hidup dengan cara
membentuk protein atau enzim yang mengkatalis metabolisme. Teori
tentang gen ini dikemukakan oleh Mendel sebagai bapak genetika yang
mengemukakan teori gen dimana sifat mahluk hidup ditentukan oleh satu
gen dengan adanya pewarisan sel (Gusriani, 2018).

2. Isolasi DNA
DNA merupakan pembawa materi genetik bagi hampir semua makhluk
hidup yang ekspresinya dipengaruhi oleh lingkungan internal atau
eksternal seperti perkembangan fisik atau perilaku organisme itu sendiri.
Molekul DNA membawa informasi hereditas dari sel dan komponen
protein (molekul-molekul histon) dari kromosom. DNA merupakan
polinukleotida (polimer nukleotida) yang terdiri atas tiga komponen
diantaranya gula deoksiribosa, gugus fosfat dan basa nitrogen, untai
berbentuk “double helix” dan antar nukleotidanya dihubungkan oleh
ikatan 5’-3’ fosfodiester (Maniatis, T. and Tasic, B. 2002).

Dalam analisa biologi molekuler, tahap awal dan essensial yang harus
dilakukan yaitu isolasi DNA. Menurut Surzycky (2000) isolasi DNA
dengan berat molekul yang tinggi menjadi sangat penting seiring dengan
meningkatnya permintaan di bidang DNA fingerprinting, RFLP,
konstruksi genom atau sequencing libraries dan analisa PCR dalam
laboratorium penelitian maupun industri. Isolasi DNA dapat dilakukan
dari tanaman, hewan maupun bagian tubuh manusia. Isolasi DNA
dilakukan dengan merusak dinding sel dan membran inti, kemudian
dilanjutkan dengan pemisahan DNA dari berbagai komponen sel yang
lain, selanjutnya dipisahkan dari kontaminan lain seperti RNA maupun
protein.

Isolasi DNA yang dilakukan pada praktikum ini yaitu dari sel bakteri
Escherichia coli dan Bacillus subtilis. Penggunaan kedua jenis isolat
tersebut didasarkan atas perbedaan Gram. Escherichia coli merupakan
bakteri Gram (-) sedangkan Bacillus subtilis merupakan Gram (+). Kedua
jenis isolat ini akan dibandingkan kemurnian DNA dan visualisasinya
dengan uji kuantitatif dan kualitatif. Uji kualitatif dilakukan dengan
elektroforesis gel agarosa, sedangkan uji kuantitatif dengan
spektrofotometer UV-Vis. Nilai kemurnian DNA yang tinggi (range antara
1,8-1,9) merupakan salah satu acuan untuk tahap teknik biologi molekuler
berikutnya (Whitney, E. & Rolfes, SR. 2005)

3. DNA Plasmid
DNA plasmid memiliki karakteristik kecil, sirkuler / melingkar, DNA
ekstrakromosom pada beberapa bakteri. Secara alamiah, plasmid
berukuran cukup besar yakni sekitar kurang dari 1.000 bp sampai lebih
dari 200 kbp. Akan tetapi plasmid yang sering digunakan untuk teknik
rekayasa genetika yaitu berkisar antara 4-5 kbp. Apabila dibandingkan
dengan ukuran DNA kromosom Escherichia coli yaitu sebesar 4000 kbp,
ukuran plasmid jauh lebih kecil. Karakteristik lain dari plasmid yaitu
mengandung gen resisten terhadap antibiotik, dimana pada bakteri normal,
gen ini tidak tersedia. DNA plasmid di dalam bakteri memiliki konfigurasi
supercoiled / terpilin seperti pita karet. Ketika diisolasi, konfigurasi DNA
plasmid dapat berbentuk supercoiled atau berubah menjadi relaxed (ketika
mengalami katalisis oleh enzim DNAse pada salah satu bagiannnya) atau
dapat juga berbentuk linier (DeBusk, R.M. 2004).

Melalui proses transfer plasmid, bakteri akan memperoleh karakteristik


baru. Beberapa ahli rekayasa genetika telah mengembangkan penggunaan
enzim restriksi untuk memotong dan menyambung gen ke dalam plasmid.
Plasmid tersebut kemudian dipindahkan ke dalam sel bakteri atau inang.
Selanjutnya bakteri akan menggunakan gen hasil rekombinasi untuk
menghasilkan protein. Ketersediaan jumlah DNA plasmid dalam jumlah
besar memiliki beberpa peranan, diantaranya pembuatan probe DNA,
penentuan urutan DNA, membuat gen termutasi.

4. Prosedur kerja
Prosedur yang sering digunakan dalam isolasi DNA bakteri sangat banyak
dan bervariasi. Salah satu metode yang dapat digunakan untuk mengisolasi
DNA plasmid yaitu metode “Minipreps / Alkaline Lysis”. Proses isolasi
dilakukan untuk jumlah kultur setara dengan 1,5 ml. Metode ini biasanya
dilakukan sebagai penelitian pendahuluan dalam mendeteksi keberadaan
plasmid pada bakteri atau mengetahui fragmen DNA plasmid yang
diinginkan (Modifikasi Ashmaig, Hasan, El Gaali, 2009).
Prosedur Isolasi Genomik DNA Bakteri (Modifikasi Ashmaig, Hasan, El
Gaali, 2009)
1) Sebanyak 1 koloni tunggal dari lempeng agar diinokulasi ke dalam 10
ml medium LB cair steril (Pepton 1%, ekstrak khamir 0,5%, NaCl 1%)
b/v, lalu diinkubasi pada suhu 37 oC selama 16-18 jam untuk E. coli
dan pada 10 ml medium MRSB steril, lalu diinkubasi suhu 30 oC
dengan selama 24 jam untuk L. Plantarum.
2) Kultur bakteri disentrifuse pada kecepatan 6000 rpm suhu 4oC selama
5 menit, lalu supernatan dibuang.
3) Pelet dicuci menggunakan 2 mL TE buffer (10 mM tris-Cl pH 8, 1 mM
EDTA) sebanyak 2 kali.
4) Sebanyak 200 µl lisozim konsentrasi 20 mg/mL dalam TE buffer
ditambahkan pada pelet pada suhu ruang selama 3 jam dan dibolak-
balik.
5) Sebanyak 200 µl Proteinase-K konsentrasi 1 mg/mL dalam larutan
STEP ditambahkan ke dalam suspensi pelet, diinkubasi pada waterbath
suhu 65oC selama 1 jam dibolak balik perlahan setiap 3-5 menit.
6) Sebanyak 300 µl TE buffer ditambahkan dan didiamkam 10 menit agar
suspensi mencapai suhu ruang, kemudian letakkan pada es.
7) Sebanyak 750 µl tris buffer fenol ditambahkan, dicampur selama 5
menit dengan cara dibolak-balik perlahan (jangan divorteks).
8) Kemudian disentrifuse pada suhu 4 oC kecepatan 6000 rpm selama 5
menit (DNA berada pada supernatan fase atas).
9) Fase atas dengan tip steril yang ujungnya telah dipotong (jangan
sampai terambil bagian tengah atau fase intermediet), kemudian di
transfer ke falcon tube baru.
10) Apabila fase tengah terambil, tahap penambahan tris buffer fenol dan
sentrifuse diulang.
11) Tambahkan kloroform : isoamilalkohol 24 : 1 sebanyak 1 kali dari
volume sampel ke dalam tube, dibolak balik perlahan (jangan divortex)
kemudian dilakukan sentrifugasi 6000 rpm selama 5 menit, di ambil
fase atas dan transfer pada falcon tube baru (jangan sampai fase tengah
terambil). Lakukan sebanyak 2 kali.
12) Tambahkan 5 µl RNAse kemudian diinkubasi pada suhu ruang selama
30 menit.
13) Tambahkan Na-asetat 3 M sebanyak 0,1 kali dari volume sampel ke
dalam tube dan ice cold etanol absolut sebanyak 2,5x volume tahap
sebelumnya, lalu bolak-balik tube secara perlahan (DNA dan RNA
akan mengendap membentuk globula).
14) Dilakukan inkubasi pada -20°C selama 1 jam.
15) Disentrifuse 10.000 rpm selama 15 menit untuk mengendapkan DNA,
supernatan dibuang.
16) Dicuci menggunakan 1 ml ice cold etanol 70% kemudian
disentrifugasi menggunakan 10.000 rpm selama 15 menit, supernatan
dibuang. Lakukan sebanyak 2 kali.
17) Pelet DNA dikeringkan pada konsentrator suhu 37-45oC sampai
alkohol menguap dan tidak berbau.
18) Pelet DNA dilarutkan dalam 50 µL ddH2O steril hangat.
19) Larutan DNA disimpan di suhu -20oC.
20) Sebanyak 4 µL DNA dicek dengan elektroforesis gel agarosa,
kemudian dianalisa konsentrasi dan kemurnian DNA secara
spektrofotometrik.

Ekstraksi Plasmid Skala Kecil (Mini Preparation) dengan Metode Alkali


(Sambrook and Russel Modifikasi, 2001)

1) Sebanyak 1 koloni tunggal E.coli rekombinan dari lempeng agar


diambil dan dibiakkan pada medium LB steril + ampisilin (100µg/mL)
pada suhu 37 oC selama 16-18 jam. Perhatian : Larutan ampisilin stok
100 mg/mL.
2) Sebanyak 1,5 mL kultur E.coli rekombinan dimasukkan pada tube
eppendorf 1,5 mL.
3) Disentrifuse 6000 rpm 4oC selama 5 menit. Supernatan dibuang, pelet
bakteri dibiarkan tetap dalam tube eppendorf.
4) Sebanyak 100 µL solution I steril (glukosa 50 mM, EDTA 10 mM,
tris-HCl 25 mM pH 8) ditambahkan ke dalam tube eppendorf,
divorteks sampai seluruh pelet tercampur sempurna, lalu dibiarkan
dalam suhu ruang selama 5 menit.
5) Sebanyak 200 µL solution II steril (NaOH 0,2 M, SDS 1% dibuat saat
eksperimen) ditambahkan ke dalam tube eppendorf dan dikocok
dengan cara dibolak-balik perlahan, lalu diinkubasi di es selama tepat
5 menit (inkubasi terlalu lama akan menyebabkan meningkatnya
kontaminasi genom).
6) Suspensi akan menjadi bening, dan pada tutup tube akan nampak
benang-benang yang lengket.
7) Sebanyak 150 µL solution III steril (potasium asetat 5 M 60 mL, asam
asetat glasial 11,5 mL, air 28,5 mL) ditambahkan ke dalam tube
dikocok dengan cepat dan kuat, kemudian diinkubasi di es selama 5
menit.
8) Disentrifuse 13000 rpm, 4 oC selama 20 menit. Lalu supernatan (kira-
kira 400 µL) diambil hati-hati (jangan sampai endapan terbawa),
dipindahkan ke tube baru.
9) Sebanyak 300 µL isopropanol ditambahkan ke dalam tube tersebut,
kemudian tube ependorf dibolak balik.
10) Didiamkan pada suhu ruang selama 30 menit.
11) Disentrifuse 13000 rpm, suhu 4oC selama 30 menit, supernatan
dibuang.
12) Pelet DNA dicuci dengan menambahkan 0,5 mL ice cold etanol 70%
ke dalam tube eppendorf. Lakukan 2 kali.
13) Disentrifuse 13000 rpm 4 oC selama 5 menit supernatan dibuang.
14) Tube tersebut dikeringkan dengan konsentrator suhu 45oC selama 10-
15 menit.
15) DNA (pelet) hasil miniprep dilarutkan dengan 50 µL (RNAse 1
mg/mL dalam Tris-HCl 10 mM pH 8), diinkubasi pada suhu 37 oC
selama 30 menit. DNA miniprep kemudian disimpan pada -20 oC
hingga digunakan pada tahapan percobaan berikutnya.
Penentuan Konsentrasi dan Kemurnian DNA dengan Spektrofotometer
(Sambrook and Russell, 2001 modifikasi)

1) 500 µL larutan sampel DNA yang telah diencerkan dimasukkan ke


dalam kuvet (5µL DNA ditambah dengan 495µL dd H2O), blanko
yaitu 500 µL dd H2O.
2) Diukur serapan DNA dengan spektrofotometer pada panjang
gelombang 260 nm dan 280 nm.
3) Konsentrasi DNA dihitung dengan rumus : A l260 x FP x 50 mg/mL.
Nilai A260 = 1 menunjukkan konsentrasi DNA untai ganda sebesar
50mg/mL.
4) Kemurnian DNA dihitung dengan rumus : A l260 / A l280
BAB III

PENUTUP

A. Kesimpulan
1. Gen adalah unit pewarisan sifat bagi organisme hidup. Bentuk fisiknya
adalah urutan DNA yang melekat/berada di suatu protein, polipeptida, atau
seuntai RNA yang memiliki fungsi bagi organisme yang memilikinya.
2. Gen merupakan fragment DNA yang dapat ditranskripsikan menjadi
RNA dan diterjemahkan menjadiprotein, yang selanjutnya mampu
mempengaruhiproses fisiologi tanaman maupun fenotipenya. Pada
dasarnya gen tersusun oleh empat komponen yaitu regulator, promotor,
transcribed, dan terminator.
3. Ekspresi gen merupakan mekanisme dari transkripsi gen dan translasi
mRNA yang berpengaruh terhadap protein yang diproduksi. Para ilmuwan
mengatakan ketika sel mensintesis protein, gen untuk protein itu telah
terekspresi. Sel dapat meregulasi ekspresi gen untuk membuat tipe protein,
dalam jumlah dan angka yang dibutuhkan. Penelitian baru‐baru ini telah
memperkenalkan beberapa hal yang mengagumkan dari zat nutrisi dapat
meregulasi ekspresi gen dan sintesis protein.
4. Rekayasa genetika adalah suatu usaha memanipulasi sifat genetik suatu
mahluk hidup untuk menghasilkan mahluk hidup yang memiliki sifat yang
diinginkan. Rekayasa genetika dapat dilakukan dengan menambah,
mengurangi, atau menggabungkan dua materi genetik (DNA) yang berasal
dari dua organisme berbeda. Ilmu yang mendasari berkembangnya
rekayasa genetika adalah genetika. Genetika adalah ilmu tentang
keturunan.
B. Saran
Mengingat bahwa kami sebagai penyusun hanyalah mahasiswa yang sangat
jauh dari kata sempurna, dalam masa yang akan datang kami akan lebih fokus
dan detail lagi dalam menjelaskan materi yang kami sediakan dalam bentuk
makalah seperti di atas dengan sumber yang lebih banyak dan luas lagi. Kami
sebagai penyusun sangat berharap kepada para pembaca agar sekiranya
memberikan kritik maupun saran yang membangun kepada kami demi
sempurnanya makalah ini.
DAFTAR PUSTAKA

DeBusk, R.M. 2004. Introduction to Nutritional Genomics. Dalam Mahan, LK. &
Escott‐Stump, S.Dalam Krause’s Food, Nutrition, & Diet Therapy.
Philadelphia : Elsevier Marieb

Dorland, W.A. Newman. 2002. Kamus Kedokteran Dorland, E/29. Jakarta : Buku
Kedokteran EGC.

Maniatis, T. and Tasic, B. 2002. Alternative pre‐mRNA splicing and proteome


expansion in metazoans Nature, 418, 236–243

Marks, D.B. 2004. Pengaturan Ekspresi Gen. Dalam Biokimia Kedokteran Dasar.
Jakarta : Buku Kedokteran EGC

Murray, R.K. 2003. Regulasi Ekspresi Gen. Dalam Biokimia Harper. Jakarta :
Buku Kedokteran EGC

Shahib, N. 2002. Genetic Information. Bandung : Biokimia Fakultas Kedokteran


Universitas Padjadjaran

Shils, ME. & Olson, JA. 1999. Modern Nutrition in Health and Disease.
Maryland : Lippincott Williams and Wilkins.

Whitney, E. & Rolfes, SR. 2005. Protein: Amino Acids. Dalam Understanding
Nutrition. Belmont : Wadsworth Thomson Learning, Inc.