MIKROBIOLOGI PERTANIAN
1
13. Menggunakan masker pada saat kegiatan praktikum
14. Jas praktikum hanya digunakan di dalam ruangan laboratorium, jika di luar
rlaboratorium dilarang menggunakan jas praktikum
2
1. PENGENALAN TEKNIK ASEPTIS
Tujuan :
Mahasiswa dapat melakukan kegiatan di laboratorium secara aseptis
3
4
5
6
2. STERILISASI ALAT
Berikut ini cara sterilisasi :
1. Pemanasan Pemijaran (dengan api langsung) : Membakar alat pada api secara langsung, contoh :
jarum inokulum, pinset, batang L.
a. Panas kering :
Sterilisasi menggunakan oven (170-180)0C selama 1,5-2 jam. Proses sterilisasi panas
kering terjadi melalui mekanisme konduksi panas. Panas akan diabsorpsi oleh permukaan luar alat
yang disterilkan, lalu merambat ke bagian dalam permukaan sampai akhirnya suhu untuk sterilisasi
tercapai. Pada sterilisasi panas kering, pembunuhan mikroba terjadi melalui mekanisme oksidasi
sampai terjadi koagulasi protein sel. Sterilisasi menggunakan cara ini kurang efektif dalam untuk
membunuh mikroba sehingga memerlukan suhu yang lebih tinggi dan waktu yang lebih panjang.
Sterilisasi panas kering umumnya digunakan untuk alat yang terbuat dari kaca misal : Erlenmeyer,
tabung reaksi, cawan Petri
Sterilisasi menggunakan autoclave (1210C, tekanan 1,5-2 atm, 15-20 menit). Pada saat
melakukan sterilisasi uap bertekanan, sebenarnya dari uap jenuh pada tekanan tertentu selama
waktu dan suhu tertentu pada suatu objek terjadi pelepasan energi uap yang mengakibatkan
denaturasi atau koagulasi protein sel mikroba sehingga melemahkan aktivitas mikroba. Selain
itu, sterilisasi menggunakan autoclave merupakan cara yang paling baik karena uap air panas
dengan tekanan tinggi menyebabkan penetrasi uap air ke dalam selsel mikroba menjadi optimal
sehingga langsung mematikan mikroba. Sterilisasi ini digunakan untuk alat yang terbuat dari kaca
dan bahan/media contoh : Erlenmeyer, tabung reaksi, cawan Petri, PDA, NA.
2. Penyinaran dengan UV Sinar Ultra Violet juga dapat digunakan untuk proses sterilisasi, misalnya
untuk membunuh mikroba yang menempel pada permukaan LAF. disterilkan dengan cara disinari
lampu UV.
3. Sterilisaisi secara kimiawi biasanya menggunakan senyawa desinfektan antara lain alkohol.
7
Cara kerja :
1. Semua alat dari kaca yang akan digunakan dicuci menggunakan sabun dan dibilas air mengalir
sampai bersih selanjutnya dikeringkan.
2. Setelah kering, untuk cawan Petri dibungkus kertas sampul coklat, tabung reaksi dan Erlenmeyer
disumbat kapas / aluminium foil / tutup karet. Tahapan ini dilakukan dengan tujuan mengurangi
kontaminan yang masuk ke cawan Petri, tabung reaksi dan Erlenmeyer.
3. Semua alat yang telah siap disterilkan menggunakan autoclave dan oven.
Selain sterilisasi alat dan media, pada prosedur kerja mikrobiologi dikenal teknik aseptik yang
bertujuan untuk mengurangi keberadaan mikroba kontaminan. Teknik aseptik digunakan setiap akan
melakukan pekerjaan yang berhubungan dengan mikroba seperti menyemprot seluruh bagian dalam
LAF menggunakan alkohol 70%, memijarkan jarum Ose ketika akan digunakan di atas lampu Bunsen,
memutar cawan Petri saat dibuka dan mulut tabung reaksi saat dibuka sebelum atau sesudah
digunakan di dekat lampu Bunsen.
8
3. PEMBUATAN NUTRIEN CAIR
Medium adalah suatu bahan yang terdiri dari campuran bahan makanan atau nutrient
untuk menumbuhkan suatu mikroorganisme. Media berfungsi untuk menumbuhkan mikroba,
isolasi, memperbanyak jumlah, menguji sifat-sifat fisiologi dan perhtungan jumlah mikroba.
Dalam proses pembuatannya harus disertai proses sterilisasi dan menerapkan metode aseptis
untuk menghindari adanya kontaminasi pada media (Dwisaputro, 2005).
Suatu media dapat menumbuhkan mikroorganisme dengan baik maka diperlukan
persyaratan antara lain, media diinkubasikan pada suhu tertentu, kelembababn harus cukup,
pH sesuai, dan kadar oksigen yang cukup baik, media untuk pembenihan harus steril, tidak
ada penghambat dan tersedia kandungan nutrisi di dalam media (Schlegel, 1994).
Penggolongan media berdasarkan sifat wujudnya antara lain, media cair, media padat,
media padat yang dicairkan. Media cair merupakan media yang berbentuk cair dan biasa di
pakai ialah kaldu yang disiapkan sebagai berikut pada 1 liter air murni di tambahkan 3 g kaldu
daging lembu dan 5 g pepton-pepton ialah protein yang terdapat pada daging pada air
susu. Pada kedelai dan pada putih telur pepton mengandung banyak N2. Sedangkan kaldu
berisi garam-garam mineral yang biasanya keadaan yang demikian ini sesuai bagi
kebanyakan bakteri. Kaldu diatas masih harus disaring terlebih dahulu untuk dimasukan
kedalam tabung-tabung reaksi Dalam penentuan berhasilnya kultivasi berbagai tipe bakteri,
dibutuhkan suatu kombinasi nutrien serta lingkungan fisik yang sesuai,
seperti, suhu, atmosfer gas, keasaman atau kebasaan (pH) (Hastuti, 2012).
Nutrisi yang diperlukan untuk pertumbuhan bakteri anatara lain, energi, karbon,
nitrogen, belerang dan fosfat. Sumber energi dapat didapatkan dari karbohidrat dan protein.
Sumber C juga berasal dari protein dan karbohidrat. Protein misalnya diperoleh dari ekstrak
daging atau pepton, sedangkan karbohidrat diperoleh misalnya glukosa, fruktisa dan sakarosa.
Nitrogen dan belerang diperoleh dari protein atau asm-asam amino. Kemudian untuk fosfat
biasanya dipakai dalam bentuk garam (Sutarma, 2000).
Tujuan :
Mempelajari prosedur umum untuk merekontrukstitusi (mengembalikan
kepada keadaan asalnya) medium berbentuk bubuk (terdehidrasi) dan menaruhnya
dalam jumlah yang dikehendaki ke dalam wadah-wadah yang sesuai.
9
Bahan dan alat :
1. Maggi/ekstrak daging
2. Pepton
3. NaOH
4. Aquadest
5. Corong gelas 1 buah
6. Tabung reaksi steril 8 buah
7. Pengaduk 1 buah
8. Gelas piala 1 buah
Cara kerja:
1. Timbang dengan teliti:
a. Maggi / ekstrak daging sebanyak 0,03 gram
b. Pepton sebanyak 0,5 gram
2. Masing-masing bahan tersebut dilarutkan dalam 100 cc aquadest sehingga
menjadi larutan yang homogen.
3. Panaskan dalam pemanas air hingga larutan medium mendidih, tunggu selama
±5 menit.
4. Dinginkan, tambah dengan 1 tetesan indikator PP kemudian netralkan larutan
medium tersebut dengan menggunakan NaOH 1 N sedikit demi seikit sampai
berubah menjadi merah jambu.
5. Air yang hilang selama pemanasan supaya diganti dengan menambahkan
aquadest sampai volumenya sama seperti semula.
6. Saring dengan kapas / kain penyaring yang bersih, bagi kedalaman tabung
reaksi
7. Sterilkan dengan menggunakan autoklaf pada tekanan 1 atm selama 20 menit
(temperatur 121oC).
10
4. PEMBUATAN NUTRIEN AGAR
Media agar merupakan bahan nutrisi yang disiapkan untuk pertumbuhan mikroba. Agar
- agar merupakan kompleks merupakan kompleks polisakarida, dihasilkan oleh alga laut dan
digunakan untuk pemadat pada makanan. Keunggulan agar yaitu mencair pada suhu yang sama
dengan air, namun tetap dalam keadaan cair sampain suhu 40oC (Munir, 2006).
Mikroorganisme dapat ditumbuhkan dan dikembangkan pada suatu substrat yang
disebut medium. Medium yang digunakan untuk menumbuhkan dan mengembangbiakkan
mikroorganisme tersebut harus sesuai susunanya dengan kebutuhan jenis-jenis mikroorganisme
yang bersangkutan. Beberapa mikroorganisme dapat hidup baik pada medium yang sangat
sederhana yang hanya mengandung garam anargonik di tambah sumber karbon organik seperti
gula. Sedangkan mikroorganime lainnya memerlukan suatu medium yang sangat kompleks
yaitu berupa medium ditambahkan darah atau bahan - bahan kompleks lainnya (Munir, 2006).
Peran utama nutrien adalah sebagai sumber energi, bahan pembangun sel, dan sebagai
aseptor elektron dalam reaksi bioenergetik (reaksi yang menghasilkan energi). Oleh karenanya
bahan makanan yang diperlukan terdiri dari air, sumber energi, sumber karbon, sumber aseptor
elektron, sumber mineral, faktor pertumbuhan, dan nitrogen. “Selain itu, secara umum nutrient
dalam media pembenihan harus mengandung seluruh elemen yang penting untuk sintesis
biologik oranisme baru (Waluyo, 2005). Nutrien agar merupakan salah satu media yang umum
digunakan dalam prosedur bakteriologi seperti uji biasa dari air, sewage, produk pangan, untuk
membawa stok kultur, untuk pertumbuhan sampel pada uji bakteri, dan untuk mengisolasi
organisme dalam kultur murni.
Berdasarkan fungsinya, media dapat dibedakan menjadi enam yaitu:
1. Media Basal (media dasar) adalah media yang digunakan sebagai bahan dasar untuk
membuat media lain yang lebih kompleks. Media ini dapat mendukung pertumbuhan
hampir semua jenis mikrobia, contohnya adalah nutrient broth, kaldu pepton, dsb.
2. Media diferensial adalah media yang bila ditumbuhi oleh mikroba yang berbeda, mikroba
tersebut akan tumbuh dengan ciri khusus sehingga dapat dibedakan. Contohnya: Media
Triple Sugar Iron Agar (TSIA), Media Sulfit Indol Motility (SIM), dsb. Dan media
differensial merupakan media yang ditambahkan bahan-bahan kimia atau reagensia tertentu
yang menyebabkan mikroba yang tumbuh memperlihatkan perubahan-perubahan spesifik
sehingga dapat dibedakan dengan jenis lainnya.
11
3. Media selektif adalah media yang memungkinkan suatu jenis mikroba tumbuh dengan
pesat, sementara jenis mikroba yang lain terhambat. Contohnya: Media Salmonella Shigella
Agar (SSA), Thiosulphate Citrate Bile Salt (TCBS), dsb. Dan media selektif, merupakan
media yang ditambahkan bahan-bahan tertentu yang akan menghambat pertumbuhan
mikroba yang tidak diinginkan yang ada dalam suatu spesimen. Inhibitor yang digunakan
berupa antibiotik, garamk dan bahan-bahan kimia lainnya.
4. Media diperkaya (enrichment) adalah media yang dirancang untuk mendukung
pertumbuhan mikroorganisme. Media tersebut memiliki konstituen nutrisi yang mendorong
pertumbuhan mikroba tertentu. Contohnya: kaldu selenit, atau kaldu tetrationat untuk
memisahkan bakteri Salmonella thyposa dari tinja, dan edia diperkaya (enrichment media),
media yang ditambahkan bahan-bahan tertentu untuk menstimulasi pertumbuhan mikroba
yang diinginkan. Hal ini dilakukan untuk menstimulasi pertumbuhan mikroba yang
jumlahnya sedikit dalam suatu campuran berbagai mikroba contoh Chocolate media dan
Yeast-Extract-poptasium Nitrat Agar.
5. Media uji(identifikasi) adalah media yang digunakan untuk identifikasi mikroba,
medium litmus milk.umumnya ditambah dengan substansi tertentu yang menjadi indikator,
misalnya
TUJUAN
Mahasiswa memahami pembuatan medium nutrient agar
CARA KERJA
1. Buatlah nutrient cair seperti pada acara praktikum no. 3
2. Timbang agar-agar sebanyak 2 gram untuk setiap 100 cc medium
3. Masukkan agar-agar ke dalam medium kemudian panaskan dalam penangas air selama
20 30 menit sambil diaduk hingga semua agar-agar mencair dan larut
12
4. Aquadest yang hilang selama pemanasanya supaya diganti dengan aquadest sampai volume
seperti semula
5. Dalam keadaan panas disaring dengan kapas/kain saring yang bersih
6. Masukkan medium tersebut ke tabung reaksi yang steril sisikan menurut keperluan (+-10
cc)
7. Sterilkan dengaan autoklaf pada tekanan 1 atm (atm 121oC) selama 20 menit.
13
5. PEMBUATAN MEDIA PDA (POTATO DEXTROSE AGAR)
Timbang komponen medium dengan menggunakan timbangan analitis untuk volume
yang diinginkan sesuai dengan komposisi berikut:
Kentang 100 gr
Glukosa 10 gr
Agar plain 10 gr
Akuades 500 ml
Cara membuat :
Kentang dikupas lalu dipotong dadu kemudian ditimbang sebanyak 100 gram. Setelah
ditimbang di rebus dalam panci dengan menggunakan air akuades hingga lunak. Setelah
mendidih disaring dan di ambil airnya. Sebagian air lainnya lagi digunakan untuk melarutkan
agar dan glukosa. Kemudian kedua suspensi di campurkan dan volume dikembalikan menjadi
500 ml, ph diatur 6,8-7,2. Selanjutnya di masukkan kedalam tabung reaksi dan ditutup
menggunakan kapas yang dilapisi alumunium foil. Sisanya dimasukkan dalam labu
erlenmeyer dan ditutup menggunakan kapas yang dilapisi alumunium foil. Setelah semua
terisi lalu tabung reaksi dimasukkan dalam plastik dan diikat menggunakan karet, lalu
dimasukkan dalam autoklaf begitu juga dengan sisanya tadi untuk dilakukan sterilisasi selama
30 menit dengan suhu 121oC dan tekanan 15 lbs.
14
6. ISOLASI MIKROBA
- Buka cawan Petri yang telah berisi media dan letakkan di ruangan
selama 5-10 menit.
16
media padat yang masih cair (>45°c).
• Diteteskan suspensi sel kedalam cawan kosong sebanyak 1 ml secara
aseptis.
• Dituangkan media yang masih cair ke cawan kosong, kemudian putar
cawan uuntuk menghomogenkan suspensi bakteri dan media. Tunggu
sampai padat kemudian diinkubasi.
• Sebaiknya kerja dilakukan secara cepat karena bila agar terlalu lama
dibiarkan dalam cawan maka pemadatan akan mempersulit
penghomogenan, dan jangan lupa bahwa suhu media saat dituang jangan
terlalu tinggi.
17
7. TEKNIK INOKULASI
b. Streak plate
1) Goresan sinabung
Cara kerja : sentuhkan inokulum loop pada koloni dan gores secara kontinyu sampai
18
setengah permukaan agar
2) Goresan T
19
8. PENGENALAN MORFOLOGI JAMUR DAN BAKTERI
Pewarnaan bakteri bertujuan untuk memudahkan melihat bakteri dengan mikroskop,
memperjelas ukuran dan bentuk bakteri, untuk melihat struktur luar dan struktur dalam bakteri seperti
dinding sel dan vakuola, menghasilkan sifat-sifat fisik dan kimia yang khas dari pada bakteri dengan
zat warna, serta meningkatkan kontras mikroorganisme dengan sekitarnya.
Pada pewarnaan sederhana hanya digunakan satu macam zat warna untuk meningkatkan
kontras antara mikroorganisme dan sekelilingnya. Lazim, prosedur pewarnaan ini menggunakan zat
warna basa seperti seperti crystal violet, biru metilen, karbol fuchsin basa, safranin atau hijau malakit.
Kadang kala digunakan zat warna negatif untuk pewarnaan sederhana : zat warna asam yang sering
digunakan adalah nigrosin dan merah kongo.
Prosedur Pewarnaan sederhana mudah dan cepat, sehingga pewarnaan ini sering digunakan
untuk melihat bentuk ukuran dan penataan pada mikoorganisme bakteri pada bakteri dikenal bentuk
yang bulat (coccus), batang (basil), dan spiral. Dengan pewarnaan sederhana dapat juga terlihat
penataan bakteri. Pada coccus dapat terlihat pewarnaan seperti rantai (streptococcus), buah anggur
(stafilococcus), pasangan (diplococcus), bentuk kubus yang terdiri dari 4 atau 8 (saranae) (Lay, 1994).
Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarnaan-pewarnaan sederhana karena sitoplasmanya
bersifat basofilik (suka akan basa) sedangkan zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan
sederhana umumnya bersifat alkalin (komponen kromotofiknya bermuatan positif) (Dwidjoeseputro,
1994).
Uji katalase digunakan untuk mendeteksi adanya enzim katalase. Enzim ini teradapat pada
sel-sel yang mempunyai metabolism aerobik. Bakteri anaerob tidak mempunyai enzim katalase. Uji
katalase merupakan salah satu pengujian biokimia untuk mengidentifikasi bakteri, apakah
menghasilkan enzim katalase atau tidak. Enzim katalase dihasilkan oleh beberapa jenis bakteri dalam
rangka mencegah oksidasi radikal bebas yang dapat merusak atau membunuh bakteri.
Uji oksidase dilakukan untuk mengetahui apakah bakteri dapat menguraikan enzim oksidase
atau tidak. Perubaahn warna yang terjadi pada tes trip diamati setelah didiamkan selama 20-60 detik.
Apabila terjadi perubahan warna menjadi biru violet maka uji oksidase dinyatakan positif dan
menandakan bahwa bakteri tersebut dinyatakan bakteri non enterik, sedangkan bila tidak terjadi
perubahan warna maka uji oksidase dinyataakn negatif dan menandakan bakteri tersebut adalah
bakteri enterik (Marlina, 2008).
20
Bahan dan alat :
1. Isolat Bacillus subtilis
2. Isolat Escherichia coli
3. Isolat jamur
4. H2O2 3%
5. Pipet tetes
6. Kertas oksidase
7. Cat sederhana Aiechl Nielson’s Cabol Fuchsin atau Hucheros Crystal Violet
8. Safranin
9. Minyak Immersi
10. alkohol 96%
11. Alkohol 70%
12. Aquades
13. iodine
14. Gelas benda
15. Mikroskop
16. Bunsen
17. Reagen P-Aminodimetilanilina oksalat 1%
Cara Kerja :
a. Morfologi Bakteri
1. Ambil secara aseptis dengan jarum ose biakan bakteri B. Subtilis,
Escherichia coli dari biakan murni dan diratakan diatas gelas benda yang
bersih seluas ± 1 cm2
2. Keringkan di udara
3. Setelah kering, preparat difiksasi dengan cara melakukan di atas api lampu
spirtus (6 – 7 kali)
4. Teteskan cat crystal violet dan diamkan 30-60 detik.
5. Buanglah sisa cat dan cuci sisanya dengan air mengalir.
6. Teteskan larutan iodine dan diamkan selama 1-2 menit.
7. Cuci dengan air mengalir, kemudian di decolorisasi (di beri larutan
peluntur) dengan alkohol (kira-kira 20 detik, hati-hati jangan sampai
berlebihan yang mengakibatkan kesalahan hasil).
2. Cuci dengan air mengalir, tambahkan larutan safranin selama 10-20 detik.
3. Cuci kembali dengan air mengalir, angin-anginkan dan amati di bawah
mikroskop dengan perbesaran kuat (1000x) menggunakan minyak immersi.
4. Gambar bakteri yang terlihat pada mikroskop dengan diberi keterangan
mengenai warna sel bakteri dan bentuk sel.
1. Gelas benda dan gelas penutup dibersihkan dengan alkohol 70% sampai bebas lemak
dan debu.
2. Aquades diteteskan di bagian tengah gelas benda.
3. Biakan jamur diambil (tipis) dengan menggunakan ose dan diletakkan di atas gelas
benda yang telah diberi aquades.
21
4. Ose sebelumnya telah dibersihkan dengan alkohol, dibiarkan sebentar dan dibakar
hingga membara agar ose menjadi steril.
5. Gelas benda yang sudah diberi jamur dan aquades ditutup dengan gelas penutup dan
diusahakan tidak terdapat gelembung udara di dalam preparat.
6. Preparat diamati dengan perbesaran lemah terlebih dahulu.
7. Jamur yang ukuran kecil dilanjutkan dengan perbesaran sedang.
8. Amati bagian jamur yang diinginkan dengan perbesaran kuat dengan ditambah minyak
immersi, khususnya untuk pengamatan bentuk dan struktur spora atau konidia.
9. Hasil pengamatan digambar dan diberi keterangan lengkap.
c. Uji Katalase
1. Mengambil koloni bakteri bakteri B. Subtilis, Escherichia coli dengan
jarum ose secara aseptis
2. Inokulasikan pada gelas benda pada dua titik dengan salah satunya sebagai
control
3. Ambil H2O2 3% menggunakan pipet tetes dan teteskan pada gelas benda
secukupnya di salah satu titik
4. Amati jika ada gelembung setelah beberapa saat penetesan larutan H2O2
3% maka hasil uji positif, sedangkan jika tidak ada gelembung maka
hasilnya negative.
c. Uji Oksidase
1. Siapkan 2 gelas benda.
2. Letakkan kertas oksidase pada masing-masing gelas benda tersebut.
3. Teteskan Reagen P-Aminodimetilanilina oksalat 1% pada dua buah kertas
tersebut.
4. Ambil biakan cair B. Subtilis dan Escherichia coli, teteskan pada masing-
masing kertas.
5. Amati perubahan yang terjadi.
6. Jika warna berubah menjadi biru violet maka hasil uji positif, jika tidak
terjadi perubahan warna maka hasil negative.
22
9. PEWARNAAN BAKTERI SECARA GRAM
Pada dasarnya pewarnaan negatif bukan digunakan untuk mewarnai bakteri, tetapi mewarnai
latar belakangnya menjadi gelap, zat warna tidak akan mewarnai sel melainkan mewarnai lingkungan
sekitarnya, sehingga bakteri tampak transparan dengan latar belakang hitam. Teknik ini berguna untuk
menentukan morfologi dan ukuran sel. Metode ini menggunakan cat nigrosin atau tinta cina.
Pewarnaan negatif atau pewarnaan asam dapat terjadi karena senyawa pewarnaan berwarna
negatif. Dalam kondisi pH mendekati netral, dinding sel bakteri cenderung bermuatan negatif
sehingga pewarna asam yang bermuatan negatif akan ditolak oleh dinding sel bakteri. Oleh karena itu
dinding sel menjadi tidak berwarna. Contoh pewarna yang biasa digunakan yaitu tinta cina, larutan
nigrosin, asam pikrat dan eosin. (Hadiotomo, 1990).
Pada pewarnaan negatif, lingkungan yang berwarna hitam disebabkan oleh pewarna yang
digunakan adalah nigrosin atau tinta cina yang memiliki warna dasar hitam. Hal ini telah sesuai
dengan pustaka yang menyebutkan bahwa zat pewarna asam membawa suatu muatan negatif, maka
pada sel yang permukaannya juga negatif akan ditolak oleh sitoplasma sel sehingga zat warna ini akan
berkaitan dengan lingkungan yang mengelilingi sel dan bagian dalam sel akan tetap berwarna bening
(Alcamo,1996). Selain itu, disebutkan juga pustaka bahwa bakteri merupakan organisme mikroseluler
yang pada dinding selnya mengandung ion negatif, zat warna (nigrosin) yang bermuatan negatif tidak
akan mewarnai sel tetapi yang terwarnai adalah lingkungan luarnya saja (Entjang, 2003). Di lain sisi
Lay (1994) juga menyatakan bahwa beberapa mikroba sulit diwarnai dengan zat warna yang bersifat
basa, tetapi mudah dilihat dengan pewarnaan.
Pewarnaan gram memberikan hasil yang baik, bila digunakan biakan segar yang berumur 24-
48 jam. Bila digunakan biakan tua, terdapat kemungkinan penyimpanan hasil pewarnaan gram. Pada
biakan tua, banyak sel mengalami kerusakan pada dinding-dinding selnya. Kerusakan pada dinding
sel ini menyebabkan zat warna dapat keluar sewaktu dicuci dengan lartan pemucat. Ini berarti bahwa
bakteri gram positif dengan dinding sel yang rusak tidak lagi dapat memertahankan crystal violet
sehingga terlihat sebagai bakteri gram negatif (Lay,1994).
Sebelum dilakukan pewarnaan dibuat ulasan bakteri di atas kaca objek. Ulasan ini kemudian
difiksasi. Jumlah bakteri yang terdapat pada ulasan haruslah cukup banyak sehingga dapat terlihat
bentuk dan penataanya sewaktu diamati. Kesalahan yang sering kali dibuat adalah menggunakan
suspensi bakteri yang terlalu padat terutama bila suspensi tersebut berasal adari bukan media padat.
Sebaliknya pada suatu suspensi bakteri bila terlalu encer, maka akan diperoleh kesulitan sewaktu
mencari bakteri pada preparatnya (Sutedjo.1991).
23
Tujuan : Mahasiswa dapat melakukan pengecatan negatif pada bakterin
Cara Kerja :
1. Teteskan larutan Negrosin di atas gelas benda yang bersih, campurkan dengan sedikit
bakteri dari biakan murni dengan jarum ose.
2. Ratakan tetesan ini dengan gelas benda lain atau dapat digunakan jarum ose, preparat
harus tipis.
3. Keringkan preparat di udara kemudian periksa dengan perbesaran kuat dengann minyak
Imersi.
4. Gambar apa yang terlihat
Gambar :
24
10. PENGIKATAN N OLEH BAKTERI SIMBIOSIS
Bakteri dapat mengubah nitrogen bentuk gas yang tidak dapat dimanfaatkan
oleh tanaman menjadi bentuk nitrogen yang larut. Sedangkan bakterinya juga
mendapatkan zat makanan dari dalam tanaman. Jenis Rhizobium ini hanya dapat
memfiksasi nitrogen dengan bekerja sama dengan tanaman kacang – kacangan.
Tidak semua spesies Rhizobium dapat membentuk nodul dan fiksasi N dengan
semua jenis kacang – kacangan. Kemungkinan ada spesies Rhizobium yang efektif
terhadap satu jenis kacang – kacangan tetapi kurang efektif pada jenis yang lain.
25
7. Cawan petri steril
8. Gelas benda
9. Jarum ose
10. Pinset
Cara Kerja :
1. Ambil bintil akar yang berwarna merah atau hijau dan cuci dengan air
saluran sampai bersih
2. Pindahkan bintil akar terseebut dengan pinset kedalam cawan petri berisi
95% alkohol selama 2 menit.
3. Ambil bintil akar tersebut dan pindahkan kedalam tempat yang berisi
HgCl2 selama 3 menit.
4. Pindahkan bintil akar tersebut kedalam tempat yang berisi air steril dan
cuci dengan air mengalir steril sampai HgCl2 hilang.
5. Cairkan 2 tabung dari nutrien agar dengan penangas air
6. Biarkan agar mendingin sampai ± 900 C, tuangkan kedalam cawan petri
steril dan biarkan mengeras / dingin.
7. Peganglah salah satu sisi gelas benda hati – hati di atas api lampu spirtus
8. Letakkan di atas meja dengan bagian yang telah dipanggang terletak di
bagian atas
9. Hancurkan bintil akar dengan meletakkan dibagian tengah dari gelas benda
yang telah dibakar dan letakkan gelas benda yang lain diatasnya lalu
tekanlah dengan kuat.
10. Pisahkan gelas benda dan tambahkan setetes aquades steril pada bintil akar
yang telah dihancurkan dan campurkanlah.
11. Ambil suspensi bakteri dengan jarum ose dan goreskan diatas permukaan
agar pada cawan petri beberapa kali.
0
12. Inkubasikan cawan petri tersebut pada suhu 25 C selama 5 – 10 hari dalam
keadaan berbalik
13. Buatlah preparat dari suspensi bintil akar dan buatlah pengecatan negatif
setelah tumbuh amati dengan mikroskop.
14. Bandingkan dengan preparat dari koloni yang tampak pada agar dalam
cawan petri
15. Ambil secara aseptik dengan ose steril sedikit koloni bakteri Rhizobium dan
pindahkan kedalam medium agar miring
16. Inkubasikan dalam suhu 250C selama 5 – 10 hari
17. Setelah tumbuh periksalah kembali secara mikroskopis dengan pengecatan
sederhana.
26
11. BAKTERI PENGIKAT NITROGEN SECARA NON SIMBIOSIS
Ada dua golongan mikrobia yang mempunyai peranan dalam proses ini
1. Golongan yang hidup secara bebas dalam tanah yang disebut golongan
non simbiotik
2. Golongan mikrobia yang hidup dan bekerjasama dengan tanaman jenis
kacang-kacangan yang disebut golongan simbiotis
Cara kerja :
1. Timbang 100 gram dari tiap macam tanah pertanian yang telah dihaluskan
2. Campur dengan 3 gram tepung kanji
3. Campuran tersebut diberi aquadest steril hingga merupakan suatu pasta
27
4. Masukan pasta tersebut kedalam cawan petri
5. Dari tiap macam- macam tanah dibuat sebuah kontrol
6. Permukaanya dihaluskan dengan pertolongan gelas benda
7. Inkubasikan selama 3 hari
8. Amati koloni – koloni Azotobakter yang tumbuh pada permukaan dan
periksa morfologi sel Azotobacter dengan pengecatan negative.
28
12. PENGARUH ZAT KIMIA TERHADAP PERTUMBUHAN MIKROBA
29
6. Lakukanlah pengamatan dan catat diameter penghambat dari masing-
masing larutan. Gunakan tabel sebagai berikut :
Zat Kimia Diameter Daerah Penghambat
B. Subtilis (mm) E. Coli (mm) Jamur
PHENOL
ALKOHOL
HgCl2 (dst)
30
Sumber Pustaka :
Hastuti, Sri Utami. 2012. Penuntun Praktikum Mikrobiologi. Penebar Swadaya: Jakarta
Sutarma,2000 Jurnal Teknik Pembuatan Kultur Media Bakteri, Yusuf Hidayat dan Sutarma,Balai
Penelitian Veteriner, JL.R.E Martadinata,30 Bogor 16114
E. Munir. 2006. Bahan Ajar : Mikrobiologi. USU-Press, Medan
Waluyo, Lud. 2005. Mikrobiologi Umum. Universitas Muhammadiyah Malang Press. Malang.
Entjang, I. 2003. Mikrobiologi dan Parasitologi untuk Akademi Keperawatan. Bandung : Citra Aditya
Bakti
Lay. 1994. Menghitung Mikroba pada Bahan Makanan, cakrawala (Suplemen Pikiran Rakyat untuk
Iptek). Bandung : FMIPA ITB
Marlina. 2008. Identifikasi Bakteri Vibrio parahaemolyticus dengan Metode Biologi dan Deteksi Gen
Toxrnya secara PCR. Jurnal Sains dan Teknologi Farmasi. 13 (1).
31
32
33
34