LAPORAN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI

BLOK GASTROINTESTINAL DAN HEPATOBILIER

“PEMERIKSAAN KUALITAS MAKANAN DENGAN METODE TOTAL

PLATE COUNT”

Nama : Annisa Ridha Salsabilla

NPM : 1718011077

Tutorial : 13

PENDIDIKAN DOKTER
FAKULTAS KEDOKTERAN
UNIVERSITAS LAMPUNG
2019
 BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Bahan makanan, selain merupakan sumber gizi bagi manusia, juga merupakan
sumber makanan bagi mikroorganisme. Pertumbuhan mikroorganisme dalam
bahan pangan dapat menyebabkan perubahan yang menguntungkan seperti
perbaikan bahan pangan secara gizi, daya cerna ataupun daya simpannya. Selain
itu pertumbuham mikroorganisme dalam bahan pangan juga dapat mengakibatkan
perubahan fisik atau kimia yang tidak diinginkan, sehingga bahan pangan tersebut
tidak layak dikomsumsi.Kejadian ini biasanya terjadi pada pembusukan bahan
pangan (Alsuhendra, 2013).

Bahan pangan dapat bertindak sebagai perantara atau substrat untuk pertumbuhan
mikroorganisme patogenik dan organisme lain penyebab penyakit. Faktor yang
mempengaruhi adanya mikroba adalah faktor intrinsik dan faktor ekstrinsik.
Faktor intrinsik adalah faktor yang tidak dapat dikendalikan oleh usaha apapun,
artinya faktor yang berasal dari dalam seperti adanya komponen zat makanan
yang diperlukan mikroba. Sedangkan faktor ekstrinsik adalah faktor yang dapat
dikendalikan oleh manusia (Susianawati, 2017).

Penyakit menular yang cukup berbahaya seperti tifus, kolera, disentri, atau tbc,
mudah tersebar melalui bahan makanan. Gangguan-gangguan kesehatan,
khususnya gagguan perut akibat makanan disebabkan, antara lain oleh
kebanyakan makan, alergi, kekurangan zat gizi, keracunan langsung oleh bahan-
bahan kimia, tanaman atau hewan beracun; toksintoksin yang dihasilkan bakteri;
mengkomsumsi pangan yan mengandung parasit-parasit hewan dan
mikroorganisme. Gangguan-gangguan ini sering dikelompokkan menjadi satu
karena memiliki gejala yang hampir sama atau sering tertukar dalam penentuan
penyebabnya (Susianawati, 2017).

Kerusakan bahan pangan dapat berlangsung cepat atau lambat tergantung dari
jenis bahan pangan atau makanan yang bersangkutan dan kondisi lingkungan
dimana bahan pangan tersebut diletakkan. Salah satu indikator kerusakan produk
pangan atau makanan adalah bila jumlah mikroorganisme tumbuh melebihi batas
yang telah ditetapkan.Untuk mengetahui sejauh mana kerusakan bahan pangan
tersebut dan untuk mengetahui aman atau tidaknya makanan tersebut dikonsumsi,
maka harus terlebih dahulu dilakukan pemeriksaan mikrobiologi.Pengujian
mikrobiologi diantaranya meliputi uji kuantitatif untuk menentukan mutu dan
daya tahan suatu makanan, uji kualitatif bakteri patogen untuk menentukan
tingkat keamanannya, dan uji bakteri indikator untuk mengetahui tingkat sanitasi
makanan tersebut (Wijayanti, 2011).

Metode TPC merupakan metode untuk menghitung jumlah mikroba yang terdapat
pada sampel makanan dan produk hasil pertanian. Jumlah mikroba harus dibatasi
pada produk makanan dan hasil pertanian harus mengikuti standar-standar yang
sudah ditetapkan. Metode TPC dibedakan atas dua cara, yakni metode tuang
(pour plate), dan metode permukaan (surface / spread plate). Pada metode tuang,
sejumlah sampel (1ml atau 0,1ml) dari pengenceran yang dikehendaki
dimasukkan kecawan petri, kemudian ditambah agar-agar cair steril yang
didinginkan (47-50oC) sebanyak 15-20 ml dan digoyangkan supaya sampelnya
menyebar. Pada penanaman dengan metode permukaan, terlebih dahulu dibuat
agar cawan kemudian sebanyak 0,1 ml sampel yang telah diencerkan dipipet pada
permukaan agar-agar tersebur. Kemudian diratakan dengan batang gelas
melengkung yang steril (Dwidjoseputro, 2005).

Pengujian mikrobiologi pada sampel makanan akan selalu mengacu kepada

persyaratan makanan yang sudah ditetapkan. Parameter uji mikrobiologi pada air
 dan makanan yang dipersyaratkan sesuai Standar 10 Nasional Indonesia
diantaranya uji TPC (Total Plate Count) atau ALT (Angka Lempeng Total), uji
MPN Coliform dan lain-lain. Uji Total Plate Count (TPC) merupakan metode
kuantitatif yang umumnya digunakan untuk menghitung adanya bakteri secara
langsung.

Pada umumnya penelitian mengenai TPC diikuti dengan daya simpan produk. Uji
daya simpan produk berguna untuk melihat perkembangan jumlah mikroba
didalam produk selama perlakuan penyimpanan. Sampel akan diuji per jam, per
hari atau per minggu, tergantung jenis produk yang dibuat oleh peneliti. Media
Plate Count Agar (PCA) merupakan media padat, yaitu media yang mengandung
agar sehingga setelah dingin media tersebut akan menjadi padat. Media PCA
terdiri dari casein enzymic hydrolisate, yeast extract, dextrose, agar. Media PCA
dilarutkan dengan aqua destilata dengan membentuk suspensi 22,5 g/L kemudian
disterilisasi pada autoklaf 15 menit pada suhu 121°C (Wati, 2018).

1.2 Tujuan
Tujuan percobaan kali ini yaitu:
1. Mengetahui prinsip dan tujuan penentuan jumlah mikroba dengan TPC
2. Mengetahui standar mutu produk berdasarkan jumlah mikroba yang ada
dalam produk tersebut
3. Mengetahui dan melakukan cara penentuan jumlah mikroba dengan metode
TPC dimulai dari preparasi sampel, teknik pengenceran sampel, sampai
dengan aturan perhitungan jumlah koloni dan cara melaporkan data jumlah
bakteri
4. Melakukan pewarnaan gram pada bakteri
5. Melakukan identifikasi pada bakteri dan uji lanjutan.
 BAB II
METODE

2.1 Alat dan Bahan

2.1.1 Alat
1. Handscoen
2. Alu dan Mortar
3. Batang Pengaduk
4. Neraca Analitik
5. Tabung Erlenmeyer
6. Tabung Reaksi
7. Penjepit Tabung Reaksi
8. Pipet Tetes
9. Spuit
10. Lampu Bunsen
11. Korek
12. Cawan Petri
13. Inkubator
14. Ose Bulat
15. Ose Jarum
16. Object Glass
17. Mikroskop
18. Mikropipet

2.1.2 Bahan
1. Sampel Makanan (Bakso Bakar).
2. Larutan Fisiologis NaCl 0.9%
3. Media PCA
4. Nutrient Broth
5. Crystal Violet
 6. Iodin
7. Etanol
8. Safranin
9. Air
10. Media TSIA (Triple Sugar Iron Agar)
11. Media SIM (Sulfida Indole Motility)
12. Bahan untuk test sitrat : Simmons Citrate Agar yang mengandung
indikator Brom Thymol Blue-BTB
13. Media Lactosa
14. Minyak Emersi

2.2 Cara Kerja

2.2.1 Perhitungan Jumlah Koloni

Preparasi Sampel
Setelah dikeluarkan dari wadahnya, bahan ditumbuk sampai halus atau
homogen dengan menggunakan mortar dan stamper. Preparasi sampel
dilakukan secara aseptis yaitu dengan menggunakan alat yang steril.

Pengenceran
Pada metode ini, teknik pengenceran merupakan hal yang harus dikuasai.
Sebelu mikroorganisme ditumbuhkan dalam media, terlebih dahulu
dilakukan pengenceran sampel menggunakan larutan fisiologis. Tujuan
dari pengenceran sampel yaitu mengurangi jumlah kandungan mikroba
dalam sampel sehingga nantinya dapat diamati dan diketahui jumlah
mikroorganisme secara spesifik sehingga didapatkan perhitungan yang
tepat. Pengenceran memudahkan dalam perhitungan koloni.
Tahapan pengenceran:
 Membuat larutan sampel sebanyak 10 ml (campuran 1ml/1gr sampel
dengan 9 ml larutan fisiologis)
 Dari larutan tersebut diambil sebanyak 1 ml dan masukkan ke dalam 9
ml larutan fisiologis (NaCl) sehingga didapatkan pengenceran 10-2.
 Dari pengenceran 10-2 diambil lagi 1 ml dan dimasukkan kedalam
tabung reaksi berisi 9 ml larutan fisiologis sehingga didapatkan
pengenceran 10-3, begitu seterusnya sampai mencapai pengenceran
yang kita harapkan.
 Sampel yang telah diencerkan diambil sebanyak 1 ml dan diteteskan
pada petri dish, kemudian dituangi media NB cair.
 Penghitungan Jumlah Koloni
 Penghitungan dilakukan pada media agar yang jumlah populasi
mikrobanya antara 30 – 300 koloni. Bila jumlah populasi kurang dari
30 koloni akan menghasilkan penghitungan yang kurang teliti secara
statistik, namun bila lebih dari 300 koloni akan menghasilkan hal yang
sama karena terjadi persaingan diantara koloni.
 Penghitungan populasi mikroba dapat dilakukan setelah masa
inkubasi yang umumnya membutuhkan waktu 24 jam atau lebih.

2.2.2 Identifikasi Bakteri dengan Pewarnaan Gram

a. Buatlah pulasan bakteri di atas objek gelas, keringkan dan fiksasi
dengan api.
b. Teteskan cat crystal violet dan diamkan 30-60 detik.
c. Buanglah sisa cat dan cuci sisanya dengan air mengalir.
d. Teteskan larutan iodine dan diamkan selama1-2 menit.
e. Cuci dengan air mengalir, kemudian di decolorisasi (diberi larutan
peluntur) dengan alkohol (kira-kira 20 detik, hati-hati jangan
sampai berlebihan yang mengakibatkan kesalahan hasil).
f. Cuci dengan air mengalir, tambahkan larutan safranin selama 10-
20 detik.
g. Cuci kembali dengan air mengalir, angin-anginkan dan amati di
bawah mikroskop dengan perbesaran kuat (1000x) menggunakan
minyak immersi.
h. Gambar hasil-hasil pengecatan bakteri dengan diberi keterangan
mengenai warna sel bakteri yang menunjukkan sifat gram dan
bentuk sel.
2.2.3 Identifikasi Bakteri dengan Uji Biokimia
Uji Katalase
1. Sebanyak 2 tetes H2O2 3% diletakkan pada object glass steril.
2. Isolat bakteri diambil menggunakan jarum ose steril, kemudian
dipindahkan ke atas kaca objek dan dicampurkan.
3. Uji positif ditandai dengan terbentuknya gelembung-gelembung
oksigen
4. Uji negatif ditandai dengan tidak adanya perubahan atau
gelembung-gelembung oksigen pada isolat bakteri.

Uji Sulfide Indole Motility (SIM)

1. Menginokulasi secara tusuk tegak (stab) biakan bakteri pada

medium SIM secara duplo.
2. Inkubasi selama 24 jam pada suhu 29ºC.
3. Uji positif ditandai dengan pertumbuhan bakteri yang menyebar,
maka bakteri tersebut bergerak (motil).
4. Bila pertumbuhan bakteri tidak menyebar, maka bakteri tersebut
tidak bergerak (non motil).
Uji TSIA

1. Sebanyak satu ose isolat bakteri diinokulasi ke dalam media TSIA

dengan cara menusuk tegak lurus pada bagian butt (tusuk) dan cara
zig-zag pada bagian slant (miring).
2. Inkubasi selama 24 jam pada suhu 29ºC.
3. Perubahan warna kemudian diamati, apabila bagian slant berwarna
merah dan butt berwarna kuning maka bakteri mampu
memfermentasi glukosa.
4. Apabila bagian slant dan butt keduanya berwarna kuning maka
bakteri mampu memfermentasi glukosa, sukrosa dan laktosa.

Uji Gula-Gula

1. Dengan menggunakan ose steril, diambil biakan bakteri, kemudian

ditanam pada media Glukosa, Sukrosa, Laktosa, Maltosa dan
Manitol dengan cara mengaduk dengan ose secara perlahan-lahan
dipermukaan tabung.
2. Lalu dihomogenkan.
3. Inkubasikan pada suhu 37oC selama 24 jam.
4. Jika pada uji gula-gula hanya terjadi perubahan warna pada media
glukosa yang berubah menjadi warna kuning, artinya bakteri ini
membentuk asam dari fermentasi glukosa.
5. Jika pada media glukosa juga terbentuk gelembung pada tabung
durham yang diletakan terbalik didalam tabung media, artinya
hasil fermentasi berbentuk gas.
Uji Simon Sitrat

1. Dengan menggunakan ose steril, tanam pada media Simmon’s

citrat dengan cara digores secara zig-zag pada permukaannya.
2. Inkubasikan pada suhu 37oC selama 24 jam.
3. Jika bakteri mampu menggunakan sitrat sebagai sumber karbonnya
maka akan menaikan pH dan mengubah warna medium biakan dari
hijau menjadi biru.
4. Jika hasilnya ditandai dengan tidak terjadinya perubahan warna
hijau menjadi biru, artinya bakteri ini tidak mempunyai enzim
sitrat permiase yaitu enzim spesifik yang membawa sitrat ke dalam
sel
 BAB III

HASIL DAN PEMBAHASAN

1. HASIL
Berdasarkan percobaan yang telah dilakukan, didapatkan hasil sebagai berikut.

Perhitungan Koloni Bakteri

Pengenceran Jumlah Koloni Karakteristik Keterangan

10-4 37 Bulat,
berwarna
putih

Maka Total Plate Count adalah

CFU=

CFU = = 37 x 104 cfu/ml

Pewarnaan Gram
Uji Morfologi Sel Bakteri Hasil Pengamatan Kesimpulan
Pewarnaan Gram Didapatkan
gambaran bakteri
basil gram negatif
juga positif.

Hasil Pengamatan Uji Biokimiawi

Uji Biokimiawi Bakteri Hasil Pengamatan Kesimpulan
Uji Katalase Tidak terbentuk buih =
Katalase negatif (-)
Uji SIM Terlihat adanya pergerakan =
motil

Tidak terbentuknya cincin

yang berwarna merah muda di
permukaan biakan = indole (-)

Tidak terlihat ada warna hitam,

maka menandakan bakteri ini
tidak menghasilkan Hidrogen
Sulfit (H2S) = H2S (-)

Uji TSIA Slant dan Butt berwarna

kuning = bakteri mampu
memfermentasi glukosa,
sukrosa dan laktosa.

Tidak disertai pembentukan

gas.
Uji Gula-Gula (Laktosa) Terjadi perubahan warna pada
media glukosa yang berubah
menjadi warna kuning =
bakteri ini membentuk asam
dari fermentasi laktosa.

Tidak terbentuk gelembung

pada tabung durham yang
diletakan terbalik didalam
tabung media = hasil
fermentasi tidak berbentuk
gas.

Uji Simon Sitrat Warna medium biakan dari

hijau menjadi biru = Positif (+)
2. Pembahasan
Setiap bahan pangan selalu mengandung mikroba yang jumlah dan jenisnya
berbeda. Pencemaran mikroba pada bahan pangan merupakan hasil kontaminasi
langsung atau tidak langsung dengan sumber-sumber pencemar mikroba, seperti
tanah, air, debu, saluran pencernaan dan pernafasan manusia atau hewan.Dalam
batas-batas tertentu kandungan mikroba pada bahan pangan tidak banyak
berpengaruh terhadap ketahanan bahan pangan tersebut. Akan tetapi, apabila
kondisi lingkungan memungkinkan mikroba untuk tumbuh dan berkembang lebih
cepat, maka bahan pangan akan rusak karenanya (Dwidjoseputro 2005). Menurut
Fardiaz (1992), faktor-faktor yang mempengaruhi pertumbuhan bakteri adalah zat
makanan, pH, air, oksigen, dan senyawa penghambat pertumbuhan. Adapun
menurut Buckle (1987), selain zat makanan, suhu, pH, dan aktifitas air,
pertumbuhan bakteri juga dipengaruhi oleh waktu, potensial reduksi oksidiasi
(redoks), struktur biologi, dan faktor pengolahan.

1. Zat Makanan
Komponen kimiawi dan bahan makanan dapat ikut menentukan jenis
mikroorganisme yang dominan di dalam bahan makanan
tersebut.Komponen kimiawi tersebut sangat menentukan jumlah zat-zat
gizi yang paling penting untuk perkembangan mikroorganisme (Buckle
1987).
2. Suhu Pertumbuhan
Menurut Buckle (1987), suhu dapat mempengaruhi pertumbuhan
mikroorganisme dengan dua cara yang berlawanan yaitu (1) apabila suhu
mengalami kenaikan sekitar suhu optimalnya, kecepatan metabolisme naik
dan pertumbuhan dipercepat sedangkan bila suhu turun sekitar suhu
optimalnya, kecepatan metabolisme akan menurun dan pertumbuhan juga
diperlambat. Selanjutnya, Winarno (2002) menyebutkan bahwa setiap
penurunan suhu 8°C akan membuat kecepatan reaksi berkurang menjadi
 setengahnya. (2) bila suhu naik hingga diatas suhu maksimal atau turun
dibawah suhu minimal, maka pertumbuhan mungkin akan terhenti,
komponen sel menjadi tidak aktif dan sel-sel mengalami kematian.
3. Nilai pH
Setiap organisme memiliki kisaran pH tertentu yang masih
memungkinkan bagi pertumbuhannya dan juga mempunyai pH optimum.
Pada umumnya, mikroorganisme dapat tumbuh pada kisaran suhu 6,6-8,0
dan nilai pH luar pada kisaran 2,0-1,0 sydah bersifat merusak (Buckle
1987). Mikroorganisme juga memerlukan pH tertentu untuk
pertumbuhannya, namun pada umumnya bakteri memiliki kisaran pH
yang sempit, yaitu sekitar pH 6,5-7,5 atau pada pH netral.
4. Aktifitas Air
Jumlah air yang terkandung didalam bahan makanan atau larutan disebut
sebagai aktivitas air (water activity). Jenis mikroorganisme yang berbeda
membutuhnkan jumlah air yang berbeda pula untuk pertumbuhannya.
Bakteri umumnya memerlukan media yang memiliki nilai aw tinggi
(0,91), khamir membutuhkan nilai aw 0,87-0,91 sedangkan kapang
membutuhkan nilai aw yang lebih rendah lagi, yaitu 0,80-0,87 (Buckle
1987).
5. Ketersediaan Oksigen
Masing-masing organisme membutuhkan jumlah oksigen yang berbeda
untuk metabolismenya. Ada organisme yang tidak membutuhkan oksigen
sama sekali untuk pertumbuhannya (anaerob), ada yang membutuhkan
sedikit oksigen (mikroaerofil) dan ada yang dapat tumbuh dan
berkembang biak pada kondisi lingkungan yang cukup oksigen maupun
tidak ada oksigen sama sekali (anaerob fakultatif).
6. Senyawa penghambat
Pertumbuhan bakteri juga dipengaruhi oleh senyawa-senyawa dalam
bahan makanan yang bersifat antimikroba yang secara ilmiah ada didalam
 bahan makanan tersebut maupun yang sengaja ditambahkan seperti asam
benzoat dan asam sorbat.
7. Waktu
Menurut Fardiaz (1992), perbedaan dalam sifat-sifat sel suatu organism
dan mekanisme pertumbuhannya menyebabkan perbedaan dalam
kecepatan pertumbuhan. Umumnya, semakin komplek dalam sifat-sifat sel
suatu organisme, maka waktu yang dibutuhkan oleh sel untuk membelah
semakin lama.Bakteri membelah lebih cepat dari pada khamir, sedangkan
khamir lebih cepat dari pada kapang. Bakteri membelah secara cepat dan
tumbuh maksiimal dalam waktu 45 menit, khamir baru membelah dengan
cepat dalam waktu 90 menit, kemudian kapang membelah dalam waktu
180 menit.
8. Potensial Reduksi Oksidiasi ( Redoks )
Potensial reduksi oksidasi menunjukkan kemampuan substrat untuk
melepaskan elektron (oksidasi) atau menerima elektron (reduksi).Potensial
redoks sangat berpengaruh terhadap kehidupan mikroba.Mikroba
memerlukan potensial redoks positif (teroksidasi), sedangkan pada
mikroba anaerob memerlukan potensial redoks negatif (tereduksi).
9. Struktur Biologi
Struktur biologi seperti kulit pada telur, kulit kacang-kacangan dan kulit
buah berperan mencegah masuknya mikroba ke dalam bahan pangan
tersebut.
10. Faktor Pengolahan
Mikroba spesifik yang terdapat di dalam bahan pangan dapat dikurangi
jumlahnya oleh berbagai jenis metode pengolahan atau pengawetan
pangan. Jenis-jenis pengolahan atau pengawetan pangan yang
berpengaruh terhadap kehidupan mikroba, antara lain suhu tinggi, suhu
rendah, penambahan bahan pengawet dan irradiasi.
Perhitungan Jumlah Koloni.
Pada praktikum kali ini menghitung jumlah bakteri pada bakso bakar. Hasil dari
metode hitungan cawan menggunakan suatu standar yang disebut dengan Total
Plate Counts (TPC). Standar tersebut adalah cawan yang dipilih dan dihitung
adalah yang mengandung jumlah koloni antara 30-300, beberapa koloni yang
bergabung menjadi satu merupakan satu kumpulan koloni yang besar yang jumlah
koloninya diragukan dapat dihitung sebagai satu koloni, dan satu deretan rantai
koloni yang terlihat sebagai suatu garis tebal dihitung sebagai satu koloni. Plate
count agar (PCA) adalah mikrobiologi medium pertumbuhan umum digunakan
untuk menilai atau memonitor "total" atau layak pertumbuhan bakteri dari sampel
(Waluyo, 2008).

Berdasarkan hasil yang diperoleh dalam perhitungan bakteri dengan metode

hitungan cawan, diperoleh hasil bahwa pada pengenceran 104 didapatkan jumlah
koloni rata-rata sebanyak 37 koloni, sehingga berdasarkan perhitungan Colony
Forming Units (CFU) maka jumlah koloni dalam 1 ml adalah 37 x 104 cfu/ml,
dengan karakteristik koloni berbentuk bulat, kecil, berwarna putih.

Pewarnaan Gram

Pewarnaan Gram adalah pewarnaan diferensial yang sangat berguna dan paling
banyak digunakan dalam laboratorium mikrobiologi, karena merupakan tahapan
penting dalam langkah awal identifikasi. Pewarnaan ini didasarkan pada tebal
atau tipisnya lapisan peptidoglikan di dinding sel dan banyak sedikitnya lapisan
lemak pada membran sel bakteri. Pewarnaan gram menggunakan 4 macam zat
pewarna yaitu meliputi Cibol Getian Violet sebagai pewarna primer, Iodium
sebagai pewarna sekunder, Alkohol sebagai larutan pemucat, Safranin sebagai
pewarna pembanding. Jenis bakteri berdasarkan pewarnaan gram dibagi menjadi
dua yaitu gram positif dan gram negatif. Bakteri gram positif memiliki dinding sel
yang tebal dan membran sel selapis. Sedangkan baktri gram negatif mempunyai
dinding sel tipis yang berada di antara dua lapis membran sel (Manurung, 2012)

Bakteri gram negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil
ungu pada metode pewarnaan gram. Bakteri gram positif akan mempertahankan
warna ungu gelap setelah dicuci dengan alcohol, sementara bakteri gram negatif
tidak. Bakteri gram positif adalah bakteri yang mempertahankan zat warna metil
ungu sewaktu proses pewarnaan gram. Bakteri jenis ini akan berwarna biru atau
ungu di bawah mikroskop, sedangkan bakteri gram negatif akan berwarna merah
muda. Perbedaan klasifikasi antara kedua jenis bakteri ini terutama didasarkan
pada perbedaan struktur dinding sel bakteri.

Umumnya bakteri mudah bereaksi dengan pewarna-pewarna sederhana karena

sitoplasmanya bersifat basofilik (suka akan basa). Mikroba sulit dilihat dengan
cahaya karena tidak membiaskan cahaya hal tersebut menyebabkan zat warna
digunakan untuk mewarnai mikroorganisme. Zat warna dapat mengadsorbsi dan
membiaskan cahaya sehingga kontras mikroba dengan sekelilingnya dapat
ditingkatkan. Mengamati bakteri dalam kehidupan sangat sulit sehingga
dikembangkan teknik pewarnaan sel bakteri agar sel dapat terlihat jelas dan
mudah diamati (Karmana, 2007). Faktor-faktor yang mempengaruhi pewarnaan
bakteri yaitu fiksasi, pelunturan warna, substrat, intensifikasi pewarnaan dan
penggunaan zat pewarna penutup.

Pada praktikum kali ini dilakukan teknik pewarnaan yaitu pewarnaan pada
bakteri. Diawali dengan mengoleskan isolat bakteri dengan tujuan agar isolat
bakteri dapat merata dikaca preparat. Lalu dilakukan fiksasi untuk melekatkan
mikroorganisme di kaca preparat. Sedangkan pemberian Iodium bertujuan untuk
memperkuat warna pada bakteri. Alkohol 96% berfungsi sebagai pemucat atau
peluntur warna pada bakteri. Dan tahap terakhir yaitu pemberian safranin yang
berfungsi untuk memberi warna kembali pada bakteri yang telah kehilangan
warna pada proses pemucatan dengan menggunakan alkohol. Pada bakteri di
preparat menunjukkan warna merah dan berbentuk basil. Hal ini membuktikan
bahwa bakteri di preparat merupakan bakteri gram negatif dikarenakan pada
bakteri gram negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil
ungu pada metode pewarnaan gram

Uji Katalase
Uji katalase merupakan salah satu uji biokimia dengan menggunakan prinsip
pemecahan hidrogen peroksida (H2O2) menjadi air (H2O) dan oksigen (O2).
Hidrogen peroksida (H2O2) merupakan hasil respirasi aerobik yang bersifat racun
terhadap sel mikroba sehingga perlu didetoksifikasi (Komala dkk,
2012). Mikroorganisme dikatakan positif katalase, jika pada media kultur
mikrobia tersebut muncul gelembung udara (O2) (Sumarsih dkk., 2009).

Uji katalase dilakukan dengan cara satu jarum ose koloni bakteri di ambil dari
stok kultur, kemudian dioleskan pada media di kaca objek. Uji ini dilakukan
dengan menggunakan jarum ose bulat. Indikator pada uji katalase yaitu dengan
timbulnya gelembung udara disekitar kultur (Pakpahan dkk., 2013). Pada
percobaan tidak didapatkan adanya buih setelah diteteskan hidrogen peroksida,
yang menandakan bahwa uji katalase negatif.

Uji SIM (Sulfide Indol Motility).

Uji menggunakan agar SIM merupakan agar semisolid yang digunakan untuk
menilai adanya hidrogen sulfide, timbulnya indol akibat enzim tryptophanase
yang ditandai dengan berubahnya larutan kovac menjadi merah, serta motilitas
atau pergerakan bakteri (Steven et al, 2004).

Pada percobaan SIM yang telah dilakukan terlihat adanya pergerakan dari bakteri,
yang menandakan bakteri tersebut motil. Tidak terbentuknya cincin yang
berwarna merah muda di permukaan biakan, hal ini berarti bakteri ini tidak
membentuk indol dari triptophan sebagai sumber karbon. Tidak terlihat ada warna
hitam, maka menandakan bakteri ini tidak menghasilkan Hidrogen Sulfit (H2S).

Pada bakteri dengan uji indol positif, maka dalam media biakan, Indol menumpuk
sebagai produk buangan, sedangkan bagian lainnya dari molekul tryptofan ( asam
piruvat dan NH4+) dapat digunakan untuk memenuhi kebutuhan zat hara
mikroorganisme. Reagens bereaksi dengan indol dan menghasilkan senyawa yang
tidak larut dalam air dan berwarna mera pada permukaan medium (Widyawati,
2012).

Reaksi uji indol ini dapat digambarkan seperti dibawah ini.

Uji TSIA
Uji Triple Sugar Iron agar (TSIA) merupakan metode yang digunakan untuk
melihat kemampuan mikroorganisme dalam memfermentasikan gula. Media yang
diguanakan dalam uji TSIA ini adalah TSIA agar yang mengandung 3 macam
gula, yaitu glukosa 0,1%, laktosa 0,1%, dan sukrosa 0,1%. Selain itu, juga
terdapat indicator fenol merah yang menyebabkan perubahan warna dari merah
orange menjadi kuning dalam suasana asam. TSIA juga mengandung natrium
trisulfat, yaitu suatu substrat untuk penghasil H2S, ferro sulfat menghasilkan FeS
(precipitat), bewarna hitam untuk membedakan bakteri H2S dengan bakteribakteri
lainnya. Konsentrasi glukosa adalah 1/10 dari konsentrasi laktosa atau sukrosa
agar fermentasi glukosa saja yang terlihat (Yusuf, 2009).

Pada uji TSIA warna media berubah menjadi merah karena bakteri bersifat basa
Perubahan warna media ini menandakan bahwa bakteri ini tidak memfermentasi
laktosa dan sukrosa. Pada media daerah butt media berubah berwarna kuning ini
menandakan bakteri memfermentasi glukosa. Pembentukan gas positif ini hasil
dari fermentasi H2 dan CO2 dapat dilihat dari pecahnya dan terangkatnya agar.
Pembentukan H2S positif ditandai dengan adanya endapan berwarna hitam
(Yusuf, 2009)

Pada percobaan kali ini, pada uji TSIA Slant dan Butt berwarna kuning yang
berarti bakteri mampu memfermentasi glukosa, sukrosa dan laktosa. Serta tidak
disertai pembentukan gas.

Uji Laktosa
Tujuan dari pemeriksaan uji gula-gula adalah untuk mengetahui kemampuan
organism memfermentasi karbohidrat. Prinsip dari pemeriksaan ini adalah bakteri
akan memecah karbohidrat tertentu yang tergabung dalam medium dasar dengan
membentuk asam atau asam dengan gas (Burrows, 2004). Larutan gula yang
dipakai adalah glukosa, laktosa, maltosa, manitol, dan sukrosa. Uji ini didasarkan
atas kemampuan bakteri untuk memfermentasi gula-gula tersebut yang ditandai
dengan perubahan warna dari biru menjadi kuning (Soemarno, 2003).

Pada percobaan terjadi perubahan warna pada media glukosa yang berubah
menjadi warna kuning yang menandakan bakteri ini membentuk asam dari
fermentasi laktosa. Tidak terbentuk gelembung pada tabung durham yang
diletakan terbalik didalam tabung media yang berarti hasil fermentasi tidak
berbentuk gas.

Uji Simon Sitrat

Pada praktikum, didapatkan warna pada medium biakan berubah dari hijau
menjadi biru, menandakan bakteri mempunyai enzim sitrat permease yaitu enzim
spesifik yang membawa sitrat ke dalam sel. Sehingga kuman tidak menggunakan
sitrat sebagai salah satu / satu-satunya sumber karbon. Media yang dipakai adalah
sitrat. Tujuan dari uji ini adalah untuk mengetahui apakah kuman menggunakan
sitrat sebagai sumber karbon. Pada media sitrat berisi indikator BTB (Brom Tymol
Blue) yang berwarna hijau. Apabila bakteri menggunakan sitrat sebagai sumber
karbon maka media berubah menjadi basa dan berubah warna menjadi biru(Ratna,
2012).

Berdasarkan uji yang telah dilakukan, sehingga kemungkinan sample tercemar

oleh bakteri basil gram positif serta bakteri basil gram negatif, kemungkinan
bakteri berasal dari family Enterobacteriaceae, seperti En.aerogenes, En.
gergoviae, En. cloacae, Klebsiella oxytoca, Klebsiella pneumonia. Berdasarkan
ambang batas cemaran bakteri, maka pada sampel dinyatakan masih layak
konsumsi.
 BAB IV
KESIMPULAN

Berdasarkan percobaan dan hasil yang didapatkan, maka dapat disimpulkan

sebagai berikut.
1. Hasil perhitungan koloni bakteri pada sampel bakso bakar seberat 1 gram
dari pengenceran ke-3 sejumlah 370.000 bakteri/ml atau 37 x 104 cfu/ml.
2. Hasil pewarnaan gram dapat diidentifikasi bahwa bakteri merupakan
golongan bakteri basil gram positif, dan basil gram negatif.
3. Uji biokimia yang dilakukan yaitu uji SIM, Gula-gula, TSIA, sitrat, dan
katalase.
 Uji katalase negatif (-)
 Uji SIM, sulfat H2S negatif (-), Indol negatif (-), Motil
 Uji TSIA, butt dan slunt berwarna kuning
 Uji Laktosa, terjadi perubahan warna menjadi kuning dan tidak
terbentuk gas
 Uji Simmon Sitrat positif (-)
4. Berdasarkan nilai ambang batas yang telah ditentukan, sampel dinyatakan
masih layak konsumsi
 DAFTAR PUSTAKA

Alsuhendra R. 2013. Bahan toksik dalam makanan. Bandung: PT. Remaja

Rosdakarya.

BSN. 2009. Standar Nasional Indonesia (SNI) No: 7388-2009 tentang batas
maksimum cemaran mikroba dan batas maksimum residu dalam bahan
makanan asal hewan. Jakarta: BSN

Buckle et al. 1987. Ilmu pangan terjemahan purnomo h, adiono. Jakarta: UI Press.

Buckle KA, RA Edwards, GH Fleet, M Wootton. 1987. Ilmu pangan. Penerjemah:

Hari Purnomo dan Adiono. Jakarta: Universitas Indonesia Press.

Burrows W, JM. Moulder, and RM Lewert. 2004. Textbook of microbiology.

Philadelphia: W.B. Saunders Company.

Fardiaz S. 2002. Mikrobiologi pangan. Bogor: Pusat Antar Universitas Pangan dan
Gizi IPB.

Dwidjoseputro D. 2005. Dasar-dasar mikrobiologi. Jakarta: Djambatan.

Komala PS, Helard D, Delimas D. 2012. Identifikasi mikroba anaerob dominan pada
pengolahan limbah cair pabrik karet dengan sistem multi soil layering
(MSL). Jurnal Teknik Lingkungan UNAND. 9(1): 74-88

Pakpahan M, Ekowati CN, Handayani K. 2013. Karakterisasi Fisiologi dan

pertumbuhan isolat bakteri bacillus thuringiensis dari tanah naungan di
lingkungan universitas lampung, seminar nasional sains dan teknologi v.
Lampung: Universitas Lampung.

Ratna S. 2012. Mikrobiologi dasar dalam praktek: Teknik dan Prosedur dasar
Laboratorium. Jakarta: PT Gramedia.
Soemarno. 2003. Isolasi dan identifikasi bakteri klinik. Akademi Analisis Kesehatan
Yogyakarta. Yogyakarta: Departemen Kesehatan Republik Indonesia.

Steven et.al. 2004. Laboratory exercise in organismal and molecular microbiology.

USA: McGraw Hill.

Sumarsih, S. 2009. Mikrobiologi dasar. Yogyakarta : UPN Veteran

Susianawati R. 2017. Kajian penerapan gmp dan ssop pada produk ikan asin kering
dalam upaya peningkatan keamanan pangan di kabupaten kendal.
semarang. Semarang : Tesis Program Studi Magister Manajemen
Sumberdaya Pantai-UNPAD.

Waluyo L. 2008. Tehnik dasar mikrobiologi. Jakarta: UN Press.

Wati RY. 2018. Pengaruh pemanasan media plate count agar (pca) berulang terhadap
uji total plate count (tpc) di laboratorium mikrobiologi teknologi hasil
pertanian unand. Jurnal Unand. 1(2):44-7

Widyawati, A., 2012. Bacillus sp asal kedeai yang berfungsi sebagai pemacu
tumbuhan tanaman dan biokontrol fungi patogen akar. Tesis. Institut
Pertanian Bogor.

Winarno, 2002. Kimia pangan dan gizi. Jakarta: PT. Gramedia Pustaka Utama.

Yusuf, A. 2009. Analisis risiko agen hayati untuk pengendalian patogen pada
tanaman. Skripsi. Universitas Riau.
 LAMPIRAN

Alat dan Bahan Alat dan Bahan

Pembakar Bunsen Mikroskop

 Neraca Analitik Mikropipet

Sampel yang telah dihaluskan Sampel sebanyak 1 gram

Proses menghomogenkan sampel Proses Pengenceran Sampel

Proses pembiakan bakteri Bakteri yang sudah dibiakkan

Proses pewarnaan gram Hasil pewarnaan gram

Hasil Uji SIM Hasil Uji TSIA

Hasil Uji Laktosa Hasil Uji Simons Sitrat