BAB III

METODE KERJA
III.1 Alat dan Bahan
III.1.1 Alat
Adapun alat yang digunakan yaitualuminium foil, batang pengaduk,
cember, capor, corong, gelas ukur, kertas saring, kapas, lempeng, mikro
pipet, pipet tetes, pipa kapiler, paper disk vial
III.1.2 Bahan
Adapun bahan yang digunakan yaitu ekstrak pegagan, etil, etanol PA,
n-heksan, NaCl, dan Nutrien agar
III.2 Cara kerja
A. Penentuan eluen
1. Disiapkan alat dan bahan
2. Dibuat bubuk silica dengan n-Heksan
3. Kemudian di pasang kapas, lalu bubuk silica dimasukan kedalam
kolom ditambahkan n-Heksan
4. Ketuk-ketuk kolom sampai tidak ada gumpalan sambil disenter
kolom sampai tidak ada gumpalan
5. Ditimbang ekstrak lalu di encerkan degan silica
6. Dimasukkan kedalam kolom kemudian diratakan ekstrak
7. Dibuat kertas saring dengan bentuk kolom, lalu dimasukkan kertas
saring lalu di tekan
8. Dimasukan n-heksan sedikit demi sedikit sampai batas lalu
ditampung
9. Dimasukan eluen satu sampai batas yang ditentukan, lalu di
tampung pada vial yang sudah di tarer
10. Ditambahkan eluen dua
11. Ditambhka 50 ml etanol
12. Kemudian fraksi diurutkan dari awal sampai akhir
13. Kemudian dari vial 50 digabung jadi 15 berdasarkan warna
B. Uji KLT
1. Disiapkan alat dan bahan
2. Disiapkan eluen dengan menggunakan fraksi n-heksan, etil dengan
perbandingan 7:3 kemudiaan dimasukan dalam cember
3. Kemudian dijenuhkan campuran fraksi n-Heksan dan etil, lalu silica
yang sudah di aktifkan kemudian ditotolkan dengan menggunakan
campuran fraksi n-Heksan dan etil
4. Dimasukkan lempeng kedalam cember yang sudah ditotolkan
5. Kemudian ditunggu beberapa menit sampai mencapai batas atas
eluen, lalu dikeluarkan dari dalam cember
6. Kemudian diamati pada lampu uv 254 nm dan 366 nm.
C. Uji Antibakteri
a. Peremajaan bakteri (E.coli dan S. aureus)
 Pembuatan Agar miring
1. Disiapkan alat dan bahan
2. Diambil 5 mL medium agar lalu di masukan kedalam tabung reaksi
yang steril dan ditutupi kapas
3. Dibiarkan pada suhu kamar selama 30 menit sampai memadat
4. Kemudian dikeringkan pada suhu 30O
5. Kemudian bakteri diinkubasi secara aseptis
 Pembuatan suspense bakteri
1. Disiapkan alat dan bahan
2. Hasil pengamatan bakteri
3. Diambil menggunakan ose lalu disuspensikan
4. Kemudian larutan NaCl fisiologinya diinkubasi
 Larutan ekstrak
1. Disiapkan alat dan bahan
2. Dibuat seri 3 konsentrasi dengan kontrol negatif degan sampel
tetrasiklin dan kontrol negatif menggunakan sampel aquadest
3. Dipipet 2 µl ke paper disk
 4. Kemudian dikeringkan dan ditempel di capet
D. Pengerjaan Aktivitas Antioksidan
1. Medium NA disterilkan dan diencerkan (45o-70oC)
2. Dipipet 10 mL secara aseptis ke dalam capet
3. Dimasukan bakteri lalu di gores
4. Dimasukkan peper disk yang berisi ekstrak kontrol positif dan
kontrol negatif
5. Kemudian diinkubasi pada suhu 32oC selama 1x24 jam
E. Uji KLTP
1. Disiapkan alat dan bahan
2. Ditotol secara horisontal fraksi yang digunakan
3. Dielusi dengan eluen yang sudah ditentukan
4. Kemudian diamati pada lampu UV 254 nm dan lampu UV 366 nm
5. Kemudian di keruk pitanya lalu di sentrifugasi
6. Kemudian dipisahkan dari supernatannya
F. Uji KLT 2 Dimensi (Multi Eluen )
1. Disiapkan alat dan bahan
2. Kemudian fraksi ditotolkan pada lempeng dengan menggunakan
eluen n-heksan 7:3 dan etil asetat 3:7 masing-masing 10 mL
3. Kemudian dimasukan lempeng yang telah dielusi kedalam
chamber
4. Setelah itu diamati pada lampu UV 254 nm dan 366 nm, apabila
terdapat noda maka dilanjutkan ke eluen kedua
5. Kemudian lempeng di diputar 900 sebelum dimasukan kedalam
chamber
6. Kemudian diamati pada lampu UV 254 nm dan 366 nm