Nama : Aidia Latifatul Fajeria

Nim : 135130101111016

Kelas : A/2013

1. Pengikatan biomolekul terhadap substrat padat pada berbagai deteksi dapat melalui
berbagai jalur diantaranya:
1. Pengikatan covalent antara polysterene microplate pada ELISA/poly-l-lysin glass
slide pada imunohistokimia dengan antibodi/antigen yang diuji.
2. Direct ionic binding
3. Perantaraan avidin biotin complex

Jelaskan perbedaan ketiga jalur diatas dengan menitikberatkan pada skema interaksi yang terjadi,
kelebihan, dan kelemahan masing-masing!

Jawaban :
Deteksi antibody dapat dilihat dari antibody primer yang berikatan kovalen dengan enzim
atau antibody sekunder yang berikatan biokonjugasi dengan enzim.

1. a. Elisa

Antibodi atau antigen pada ELISA agar tidak bergerak atau berpindah maka diletakkan pada
bahan padat. Bahan padat yang dipakai dalam ELISA terbuat dari selulosa, dextran cross linked,
poliacrilamide, polistiren dan polipropilen. Bahan padat tersebut dapat berupa butiran,
lempeng(microplate) atau tabung. Microplate yang sering digunakan yaitu yang terbuat dari
polysterene atau poliolefin. Microplate dari bahan tersebut mampu mengikat biomolekul seperti
antigen atau antibody. Interaksi antara antigen atau antibodi membentuk ikatan kovalen mengikat
dengan bahan padat. Apabila ditambahkan substrat antibody berlabel yang sudah terikat pada
bahan padat akan bereaksi sehingga terjadi perubahan warna. Perubahan warna hasil reaksi
enzim dengan substrat.

Kelebihan : dapat digunakan untuk banyak sampel

Kekurangan : waktu yang dibutuhkan lama

 1. b. Direct ionic binding

Ikatan ion sederhanakan terjadi ketika inti atom yang bermuatan positif secara dominan
melebihi muatan positif inti atom lainnya, sehingga secara efektif menyebabkan satu atom
mentransfer elektronnya ke atom yang lain. Hal ini menyebabkan satu atom bermuatan positif
dan yang lainnya bermuatan negatif secara keseluruhan. Ikatan ini dihasilkan dari atraksi
elektrostatik di antara atom-atom dan atom-atom tersebut menjadi ion-ion yang bermuatan.

Kelebihan : bagus untuk senyawa yang cenderung berikatan ion

Kekurangan : hasil dipengaruhi konsentrasi ion larutan substrat dan pH

1. c. Avidin-biotin kompleks

Antibody primer atau sekunder pada suatu deteksi telah diberlabel biotin. Kemudian ketika
ditambahkan avidin, avidin akan berikatan dengan biotin. Perubahan warna akan terjadi apa bila
ditambahkan streptavidin sebagai substrat.

 Kelebihan : Sangat sensitive karena tempat ikatan substrat lebih banyak dan afininitas
kompleks avidin-biotin tinggi maka lebih stabil. Ikatan yang terbentuk sangat kuat tidak
terpengaruh oleh pH ekstrem, temperatur, pelarut organik dan agen denaturing yang lain.
 Kekurangan : Membutuhkan waktu yang cukup lama, avidin dapat menempel pada
bahan padat sehingga apabila ditambahkan substart akan terjadi perubahan warna.

2. Bagaimana pelabelan antibodi dan enzim dapat dilakukan? Jelaskan jawaban saudara
serta berikan contoh teknik pelabelan antibodi dan enzim yang saudara ketahui!

Jawaban.

Struktur molekul antibodi pada daerah konstan akan memungkinkan untuk berikatan
secara kovalen dengan berbagai jenis label. Ikatan ini tidak akan mempengaruhi ikatan antigen-
antibodi yang terjadi pada daerah variabel. Pelabelan antibodi pada umumnya
menggunakan enzim( enzim imunoasay). Enzyme immunoassay(EIA) adalah tes untuk
mendeteksi antigen atau antibodidengan penambahan enzim yang dapat mengkatalisa substrat
sehingga terjadi perubahan warna. Metode enzim imunoassy menggunakan sifat katisa dari
enzim untuk mendeteksi dan menghitung jumlah reaksi imunologi. Enzim dan substratnya
berfungsi mendeteksi jumlah antigen atau antibodi yang terdapat pada sampel. Enzim yang
berlabel yang sering digunakan ialah alkaline phosphatase, Glocose-6-phosphatase
dehydrogenase dan β-galactosidase.

Pelabelan antigen dengan enzim menggunakan prinsip konjugasi untuk menghasilkan

ikatan kovalen. Pelabelan antibody menghasilkan deteksi direct dan indirect dari antigen. Pada
deteksi direct, label berikatan kovalen dengan antibodi primer. Sedangkan pada deteksi indirect
label berikatan kovalen dengan antibodi sekunder. Bahan kimia yang dipakai untuk label
antibody ada empat yaitu NHS ester (berupa tinta fluorosense), reagen heterobifunctional
(berupa molekul protein seperti HRP, fosfatase alkali, atau phycoerythrin) , carbodiimides dan
sodium periodate

Langkah dari enzim imunoassay ialah sebuah plat plastik dilapisi dengan antigen .
Antigen bereaksi dengan antibodi pada serum sampel. plat kemudian diinkubasi dengan sebuah
gabungan enzim-antibodi berlabel. Jika terdapat antibodi,gabungan tersebut bereaksi dengan
kompleks antigen-antibodi pada plate.Aktivitas enzim diukur dengan spektrofotometer setelah
penambahan substratkromogenik spesifik. Misalnya, peroksidase mengkatalisa substratnya,o-
dianisidine,menyebabkan perubahan warna. Pada beberapa kit , tes EIA dapat dibaca secara
langsung(visual).

Enzim imunoasay terbagi menjadi dua jenis yaitu heterogen dan homogen. Enzim
imunoasay yang heterogen aktifitas label enzim tidak dipengaruhi oleh reaksi antigen dan
antibodi dan diperlukan pemisahan fraksi terikat dan tidak terikat hal ini dikarenakan Pada
sistim heterogen, sifat label sebelum dan sesudah reaksi tetap sama, jadi perlu pemisahan
komponen reaktan yang berlebih dengan kompleks Ag-Ab yang terbentuk, sebab kuantitas
kompleks ini yang akan dihitung.Sedangkan pada enzim imunoasay homogen aktivitas enzim
sebagai label bergantung pada reaksi antigen-antibodi sehingga tidak diperlukan pemisahan
karena sifat label sebelum dan sesudah reaksi sangat berbeda, jadi tidak perlu lagi pemisahan
komponen reaktan secara fisis.
Contoh dari pelabelan antibodi menggunakan enzim:

 ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay)

Elisa adalah tehnik imunoassay yang menggunakan enzim sebagai label untuk amplifikasi
dan visualisasi reaksi primer ikatan antigen-antibodi. Pelabelan dapat dilakukan baik pada
antigen atau antibodi. Antibodi yang digunakan dalam ELISA dapat berupa antibodi poliklonal
atau antibodimonoklonal. ELISA pada umumnya menggunakan solid phase dan untuk reaksi
kompetitif.

 IEMA (immunoenzymetric assay)

Berdasarkan teknik sandwich untuk reaksi non-kompetitif.

Tujuan dari tehnik ini mendeteksi antibodi dalam serum (berbeda dengan model
sebelumnya). Antigen yang digunakan biasanya berlebih dan terikat pada matrix tertentu, serum
yang akan dideteksi jenis antibodinya (antibodi primer) biasanya merupakan antibodi poliklonal
direaksikan dengan antigen tersebut. Reaksi ini memerlukan suatu anti-antibodi (antibodi
sekunder) terhadap antibodi yang akan dideteksi tadi. Antibodi sekunder inilah yang biasanya
dilabel dan dapat bereaksi dengan bagian Fc dari molekul antibodi primer, sehingga kandungan
antibodi dalam serum dapat ditentukan..

 EMIT (enzyme-multiplied immunoassay technique)

Metode tanpa pemisahan dengan menggunakan label enzim terkonjugasi pada hapten disertai
reaksi deteksi menggunakan perubahan substrat membentuk produk reaksi enzimatik.