Apaaan
Apaaan
GADJAH MADA
BERDASARKAN GEN PENYANDI Cytochrome Oxidase Sub-unit 2 (COX-2)
PUTRI DWI PURWANTI
Universitas Gadjah Mada, 2015 | Diunduh dari http://etd.repository.ugm.ac.id/
BAB I
PENDAHULUAN
A. Latar Belakang
Blainville, 1822), rusa Sambar (Cervus unicolor), dan rusa totol (Axis axis). Rusa
nilai estetika yang dapat dijadikan satwa peliharaan untuk kesenangan dan sebagai
satwa pajangan dalam taman, terutama rusa totol dan rusa Timor (Garsetiasih dan
Takandjadji, 2007).
Rusa Timor merupakan salah satu jenis rusa asli Indonesia. Populasi rusa
Timor di alam (in-situ) mulai berkurang karena perburuan dan perusakan habitat.
langsung dari habitat alam untuk dijadikan satwa peliharaan maupun diambil
Nature Redlist yaitu Vulnerable (rentan). Jumlah populasi rusa Timor di habitat
asli diperkirakan berjumlah kurang dari 10.000 individu dewasa. Dalam waktu
10% dalam waktu. Penurunan populasi ini sebagai akibat dari hilangnya habitat,
Jenis Tumbuhan dan Satwa Liar menyatakan bahwa seluruh jenis rusa diIndonesia
dilindungi, namun perburuan masih saja terjadi. Selain itu, kerusakan habitat, baik
1
KAJIAN KERAGAMAN GENETIK RUSA TIMOR (Rusa timorensis) TAMAN RUSA, UNIVERSITAS
2
GADJAH MADA
BERDASARKAN GEN PENYANDI Cytochrome Oxidase Sub-unit 2 (COX-2)
PUTRI DWI PURWANTI
Universitas Gadjah Mada, 2015 | Diunduh dari http://etd.repository.ugm.ac.id/
alam, turut pula menyebabkan penurunan terhadap eksistensi jenis dan populasi
rusa. Upaya konservasi jenis dan populasi rusa perlu dilakukan baik secara in-situ
dkk., 2011).
terutama generasi kedua (F2) yang termuat dalam PP Nomor 8 Tahun 1999
tentang Pemanfaatan Jenis Tumbuhan dan Satwa Liar. Manfaat rusa sebagai
sumber protein hewani serta hasil ikutan lainnya diperoleh melalui turunan kedua
(F2) dan seterusnya. Hasil penangkaran rusa tersebut memiliki prospek untuk
penting bagi manajemen spesies. Populasi yang terisolasi sering dikaitkan dengan
reproduksi yang kurang baik. Populasi bottlenecks dapat memiliki efek keragaman
dekat menunjukkan bahwa genom ini mempunyai laju evolusi yang lebih tinggi
dari pada DNA inti (Wirdateti dkk., 2004). Di samping itu, mtDNA telah lama
KAJIAN KERAGAMAN GENETIK RUSA TIMOR (Rusa timorensis) TAMAN RUSA, UNIVERSITAS
3
GADJAH MADA
BERDASARKAN GEN PENYANDI Cytochrome Oxidase Sub-unit 2 (COX-2)
PUTRI DWI PURWANTI
Universitas Gadjah Mada, 2015 | Diunduh dari http://etd.repository.ugm.ac.id/
silsilah gen dan sejarah populasi (Gissi dkk., 2000; Wirdateti dkk., 2004; Fonseca
dkk., 2008).
dilakukan karena introduce spesies ke suatu daerah yang tidak terkendali baik
oleh alam maupun manusia akan mempengaruhi karakter spesifik dari hewan
tersebut, terlebih apabila proses hibridisasi antar jenis dimungkinkan terjadi secara
Dalam penelitian ini, penulis memilih gen penyandi Cytochrome Oxidase Sub-
unit 2 (COX-2).
B. Tujuan Penelitian
Timor terhadap spesies-spesies rusa di Indonesia dan di dunia serta famili lain
C. Manfaat Penelitian
identifikasi dan klasifikasi rusa tersebut dalam upaya untuk pelestarian plasma
nutfah, membantu tujuan konservasi serta biodiversitas rusa asli asal Indonesia.
KAJIAN KERAGAMAN GENETIK RUSA TIMOR (Rusa timorensis) TAMAN RUSA, UNIVERSITAS
GADJAH MADA
BERDASARKAN GEN PENYANDI Cytochrome Oxidase Sub-unit 2 (COX-2)
PUTRI DWI PURWANTI
Universitas Gadjah Mada, 2015 | Diunduh dari http://etd.repository.ugm.ac.id/
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
1. Klasifikasi
dan Spesies Rusa timorensis (de Blainville, 1822). Rusa Timor juga mempunyai
nama spesies lain selain Rusa timorensis, yaitu: Cervus celebensis (Rorig, 1896);
1846); Cervus moluccensis (Quoy dan Gaimard, 1830); Cervus peronii (Cuvier,
1825); Cervus russa (Muller dan Schlegel, 1845); Cervus tavistocki (Lydekker,
1900); dan Cervus tunjuc (Horsfield, 1830 [nomen nudum]) (Hedges dkk., 2008).
2. Habitat
Habitat alami rusa adalah vegetasi dan hutan savana dimanfaatkan sebagai
sumber pakan. Vegetasi hutan yang tidak terlalu rapat untuk tempat bernaung
(istirahat), kawin, dan menghindarkan diri dari predator. Habitat yang paling
disukai oleh rusa Timor adalah hutan sampai ketinggian 2.600 meter di atas
permukaan laut dengan padang rumput (Santoso, 2011). Habitat alami rusa Timor
menurut Bismark dkk. (2011) adalah hutan tropis dan dataran rendah yang
4
KAJIAN KERAGAMAN GENETIK RUSA TIMOR (Rusa timorensis) TAMAN RUSA, UNIVERSITAS
5
GADJAH MADA
BERDASARKAN GEN PENYANDI Cytochrome Oxidase Sub-unit 2 (COX-2)
PUTRI DWI PURWANTI
Universitas Gadjah Mada, 2015 | Diunduh dari http://etd.repository.ugm.ac.id/
3. Morfologi
tubuh yang kecil, tungkai pendek, ekor panjang, dahi cekung, gigi seri relatif
besar, dan rambut berwarna coklat kekuning-kuningan. Secara umum rusa terlihat
Tinggi dan Berat Badan. Rusa Timor memiliki tinggi badan 91-102 cm.
Berat badannya berkisar antara 103-155 kg. Rusa jantan relatif lebih besar
2004), sedangkan menurut Santoso (2011) warna rambutnya coklat tetapi pada
bagian bawah perut dan ekor berwarna putih. Warna rambutnya pada musim
kemarau adalah merah kecoklatan, agak gelap pada bagian belakang dan lebih
terang pada bagian dada, sedangkan pada musim hujan bagian atasnya berwarna
Ranggah. Rusa jantan memiliki ranggah yang akan tumbuh pertama kali
pada umur delapan bulan. Bila dewasa, ranggah rusa telah menjadi sempurna
yang ditandai dengan terdapatnya tiga ujung runcing (Santoso, 2011). Cabang
yang pertama mengarah ke depan, cabang belakang kedua terletak pada satu garis
dengan cabang belakang pertama, cabang belakang kedua lebih panjang cabang
depan kedua, cabang belakang kedua sisi kiri dan kanan terlihat sejajar (Bismark
dkk., 2011). Rusa jantan menjadi lebih agresif ketika ranggah keras menjadi
KAJIAN KERAGAMAN GENETIK RUSA TIMOR (Rusa timorensis) TAMAN RUSA, UNIVERSITAS
6
GADJAH MADA
BERDASARKAN GEN PENYANDI Cytochrome Oxidase Sub-unit 2 (COX-2)
PUTRI DWI PURWANTI
Universitas Gadjah Mada, 2015 | Diunduh dari http://etd.repository.ugm.ac.id/
4. Sebaran
mudah menyesuaikan diri dan hidup di daerah basah, kering, berpasir maupun
Tenggara, sedangkan rusa Sambar (R. unicolor) tersebar di Pulau Sumatera dan
pada Gambar 2.
KAJIAN KERAGAMAN GENETIK RUSA TIMOR (Rusa timorensis) TAMAN RUSA, UNIVERSITAS
7
GADJAH MADA
BERDASARKAN GEN PENYANDI Cytochrome Oxidase Sub-unit 2 (COX-2)
PUTRI DWI PURWANTI
Universitas Gadjah Mada, 2015 | Diunduh dari http://etd.repository.ugm.ac.id/
5. Tingkah Laku
merumput terbanyak dilakukan di pagi hari dan menjelang malam hari, sedangkan
memamah, istirahat dan kegiatan lainnya banyak dilakukan pada siang hari. Pakan
sedangkan pakan yang tidak disukai adalah daun tebal, pakan berasa pahit dan
rusa Sambar, namun rusa ini cenderung tenang pembawaannya (Semiadi dan
Nugraha, 2004).
KAJIAN KERAGAMAN GENETIK RUSA TIMOR (Rusa timorensis) TAMAN RUSA, UNIVERSITAS
8
GADJAH MADA
BERDASARKAN GEN PENYANDI Cytochrome Oxidase Sub-unit 2 (COX-2)
PUTRI DWI PURWANTI
Universitas Gadjah Mada, 2015 | Diunduh dari http://etd.repository.ugm.ac.id/
membentuk rantai polinukleotida yang panjang. Basa purin yang terdapat pada
DNA ialah adenine dan guanine. Cytosine dan thymine adalah basa pirimidin yang
berbeda. Pada salah satu ujung DNA (ujung 5’), atom karbon yang terdekat
dengan ujung polimer adalah karbon 5’ unit deoksiribosa yang terakhir. Pada
ujung lain DNA (3’), atom karbon yang terdekat dengan ujung polimer adalah
Kedua untai DNA bersifat antiparalel, yaitu satu untai DNA berjalan dari
arah 5’ ke 3’, sementara untai yang lain dari arah 3’ ke 5’. Ini analog dengan dua
KAJIAN KERAGAMAN GENETIK RUSA TIMOR (Rusa timorensis) TAMAN RUSA, UNIVERSITAS
9
GADJAH MADA
BERDASARKAN GEN PENYANDI Cytochrome Oxidase Sub-unit 2 (COX-2)
PUTRI DWI PURWANTI
Universitas Gadjah Mada, 2015 | Diunduh dari http://etd.repository.ugm.ac.id/
jalan sejajar yang masing-masing berjalan menuju satu tempat, tetapi membawa
Molekul DNA bentuk heliks ganda sangat stabil karena adanya tiga ikatan
benang. Ikatan van der Waals terbentuk antara pasangan basa yang satu dengan
pasangan basa di atas dan di bawahnya sepanjang sumbu utama heliks. Ikatan
fosfodiester pada bagian luar dari kerangka DNA, menyebabkan molekul tersebut
Molekul DNA mitokondria (mtDNA) jauh lebih kecil daripada kromosom inti.
Pada sel hewan, mtDNA mengandung kurang dari 20.000 bp (16,569 bp mtDNA
memiliki 2-10 salinan molekul mtDNA ini, dan jumlahnya dapat meningkat
sampai ratusan dalam sel tertentu ketika embrio mengalami diferensiasi sel
Kode DNA mitokondria untuk tRNA mitokondria dan rRNA dan untuk
beberapa protein mitokondria. Lebih dari 95% protein mitokondria dikode oleh
DNA nuklear. Mitokondria dan kloroplas membagi ketika sel membelah. Molekul
DNA direplikasi sebelum dan selama pembelahan, dan molekul DNA baru masuk
1. Sintesis DNA
Sintesis DNA pada sel binatang, termasuk sel manusia terjadi pada fase S
atau fase sintesis. Selama fase S, DNA polimerase sel mamalia berada dalam
KAJIAN KERAGAMAN GENETIK RUSA TIMOR (Rusa timorensis) TAMAN RUSA, UNIVERSITAS
10
GADJAH MADA
BERDASARKAN GEN PENYANDI Cytochrome Oxidase Sub-unit 2 (COX-2)
PUTRI DWI PURWANTI
Universitas Gadjah Mada, 2015 | Diunduh dari http://etd.repository.ugm.ac.id/
aktivitas, dan aktivitas ini akan menurun sesudah fase sintesis sampai sinyal bagi
2. Inti Sel
Di dalam inti sel terdapat kromatin atau kromosom yang terdiri atas serat-
serat DNA yang bergabung dengan histon. Inti sel juga mengandung beberapa
enzim antara lain DNA polymerase, RNA polymerase dan enzim yang digunakan
dalam proses glikolisis maupun dalam siklus asam sitrat. Di dalam anak inti
3. Mitokondria
eukariota. Struktur organela ini berupa kantung yang diselaputi oleh dua membran
yaitu membran luar dan membran dalam. Mitokondria memiliki dua kompartemen
yaitu matriks mitokondria yang diselimuti langsung oleh membran dalam dan
Gambar 4.
KAJIAN KERAGAMAN GENETIK RUSA TIMOR (Rusa timorensis) TAMAN RUSA, UNIVERSITAS
11
GADJAH MADA
BERDASARKAN GEN PENYANDI Cytochrome Oxidase Sub-unit 2 (COX-2)
PUTRI DWI PURWANTI
Universitas Gadjah Mada, 2015 | Diunduh dari http://etd.repository.ugm.ac.id/
matriks mitokondria. Molekul mtDNA berbentuk untai ganda sirkuler yang pada
terbagi atas dua untai, yaitu untai berat atau heavy strand (H) dan untai ringan
atau light strand (L) (Fritzsch,, 2009). Molekul mtDNA sebagian besar merupakan
daerah penyandi protein dan sebagian kecil bukan daerah penyandi. Daerah
Gen-gen tersebut umumnya lebih banyak tersebar di untai berat. Daerah bukan
2/tRNALys, dan daerah kontrol atau disebut juga daerah D-loop pada vertebrata
pada Gambar 5.
KAJIAN KERAGAMAN GENETIK RUSA TIMOR (Rusa timorensis) TAMAN RUSA, UNIVERSITAS
12
GADJAH MADA
BERDASARKAN GEN PENYANDI Cytochrome Oxidase Sub-unit 2 (COX-2)
PUTRI DWI PURWANTI
Universitas Gadjah Mada, 2015 | Diunduh dari http://etd.repository.ugm.ac.id/
DNA inti. Molekul mtDNA memiliki banyak salinan sehingga mtDNA lebih
mudah diisolasi dengan jumlah sampel yang sedikit (Castro dkk., 1998; Morin
dkk., 2001; Hoong dan Lex, 2005; Pakendorf dan Stoneking, 2005).
spesies seperti remis, lalat buah, tikus, dan burung hibrida (hasil hibridasi dari dua
sel sperma tidak ikut menembus sel telur pada saat fertilisasi (Ankel-simons dan
dkk., 2009).
KAJIAN KERAGAMAN GENETIK RUSA TIMOR (Rusa timorensis) TAMAN RUSA, UNIVERSITAS
13
GADJAH MADA
BERDASARKAN GEN PENYANDI Cytochrome Oxidase Sub-unit 2 (COX-2)
PUTRI DWI PURWANTI
Universitas Gadjah Mada, 2015 | Diunduh dari http://etd.repository.ugm.ac.id/
daerah D-loop (Pakendorf dan Stoneking, 2005). Mutasi yang terjadi umumnya
berupa mutasi titik, namun dapat pula berupa delesi atau insersi. Laju mutasi yang
tersebut (Rose dkk., 2007). Molekul mtDNA tidak memiliki protein histon serta
enzim perbaikan untuk kesalahan replikasi atau kerusakan DNA, sehingga mutasi
cepat dari DNA inti, sehingga dapat menunjukkan variasi yang tinggi pada
berbagai level, baik antar individu maupun populasi (Castro dkk., 1998).
memiliki tiga sub-unit, yaitu COX-1, COX-2, dan COX-3. Ketiga sub-unit ini
disandi dalam genom mitokondria dan paling sedikit ada empat sub-unit yang
Gen COX-1 dan COX-2 merupakan enzim pengaturan utama yang terlibat
kekebalan tubuh dan biologi reproduksi. Gen COX-1 konstitutif dinyatakan dalam
sebagian besar jaringan (Harper dan Tyson-Capper, 2008). Gen COX-3 berperan
KAJIAN KERAGAMAN GENETIK RUSA TIMOR (Rusa timorensis) TAMAN RUSA, UNIVERSITAS
14
GADJAH MADA
BERDASARKAN GEN PENYANDI Cytochrome Oxidase Sub-unit 2 (COX-2)
PUTRI DWI PURWANTI
Universitas Gadjah Mada, 2015 | Diunduh dari http://etd.repository.ugm.ac.id/
dalam perakitan dan stabilisasi seluruh kompleks enzim dan terlibat dalam
translokasi proton atau dalam konversi energi oleh cytochrome oxidase (You dkk.,
2002).
pada 5’ untranslated region (UTR) dari gen COX-2 melibatkan cross-talk antara
beberapa jalur sinyal yang bergantung pada jenis sel dan stimulus. Peristiwa
stabilitas messenger RNA (mRNA) dan / atau represi translasi target binding
mempengaruhi stabilitas mRNA dan / atau represi translasi target mRNA), dengan
Tingkat pergantian asam amino pada gen COX-2 dapat dilihat di sepanjang
garis keturunan primata, sedangkan pada artiodactyl dan rodensia tidak ada
1. Isolasi DNA
Pada organisme tingkat tinggi seperti pada manusia, hewan, dan tumbuhan
DNA terdapat di dalam inti sel, dan beberapa organ lain di dalam sel seperti
mitokondria dan kloroplast. Prinsip dasar isolasi DNA adalah serangkaian proses
untuk memisahkan DNA dari komponen-komponen sel lainnya. Isolasi DNA dari
penghancuran dinding sel (lysis of cell walls), penghilangan protein dan RNA (cell
merupakan suatu teknik perbanyakan molekul DNA dengan ukuran tertentu secara
bahkan jutaan kali dari jumlah semula, sekitar106 - 107 kali. Setiap urutan basa
nukleotida yang diamplifikasi akan menjadi dua kali jumlahnya. Pada setiap n
siklus PCR akan diperoleh akan diperoleh 2n kali banyaknya DNA target.
biologi, mutasi gen secara langsung dan mengukur kuantifikasi ekspresi mRNA di
a. Cetakan DNA
Ukuran target amplifikasi biasanya kurang dari 1000 pasangan basa (bp)
atau 1kB. Hasil amplifikasi yang efisien adalah antara 100-400 bp. Hasil
amplifikasi lebih dari 1 kb memiliki proses yang kurang efisien karena produk
yang panjang akan rentan terhadap inhibitor yang mempengaruhi kerja enzim
DNA polymerase dan waktu yang diperlukan lebih lama (Fatchiyah dkk., 2011).
b. Primer
ujung-5’ pita DNA cetakan maupun komplemennya (Fatchiyah dkk., 2011). Suhu
Aktivitas polimerasi DNA dari ujung 5’ ke 3’, dan aktivitas enzimatik ini
mempunyai waktu paruh sekitar 40 menit pada suhu 95ºC. Penggunaan enzim ini
harus memperhatikan proses penyimpanan (selalu di freezer pada suhu -20ºC) dan
pada saat pengambilan tidak boleh terlalu lama di suhu ruang, diusahakan selalu
dalam kotak berisi water-ice (potongan es diberi air sedikit agar suhu tetap 4 ºC).
Hal ini dilakukan untuk meminimalkan kerusakan enzim yang mungkin terjadi
8,3), dan 1,5 mM MgCl2. Buffer ini akan bekerja dengan baik untuk cetakan DNA
dan primer dengan kondisi tertentu, tetapi mungkin tidak optimal dengan
kombinasi yang lain. Konsentrasi ion magnesium dalam buffer PCR merupakan
annealing primer, suhu disosiasi untai cetakan DNA, dan produk PCR (Sulandari
e. Nukleotida (dNTP)
ketepatan dan spesifitas yang tinggi tanpa mereduksi hasil akhir (Sulandari dan
f. Thermo cycler
Alat ini secara tepat meregulasi suhu dan siklus waktu yang dibutuhkan
untuk reprodusibilitas dan keakuratan reaksi amplifikasi. Siklus PCR terbagi atas
tiga langkah utama yaitu denaturasi DNA (92-95ºC, selama 30-60 detik), primer
annealing (50-62ºC, selama 30-60 detik), dan ekstensi atau elongasi (70-72ºC,
selama 30-120 detik). Siklus ini berulang 30-35 kali. Siklus utama ini diawali
terlebih dahulu dengan denaturasi awal, misalnya 94ºC selama 5 menit. Langkah
siklus utama berakhir, maka ditambah program ekstensi final dengan suhu 70-
3. Elektroforesis DNA
suatu medan listrik (Fatchiyah dkk., 2011). Elektroforesis adalah proses migrasi
dari fragmen DNA di dalam gel yang direndam dalam larutan penyangga.
Fragmen DNA yang lebih kecil berat molekulnya akan berjalan lebih cepat dari
molekul DNA yang lebih besar (Sulandari dan Zein, 2003). Perjalanan molekul
DNA di dalam gel mengikuti arus listrik dari kutub negatif menuju kutub positif
(Sulandari dan Zein, 2003; Fatchiyah dkk., 2011). Semakin besar tegangan arus
listrik, perjalanan molekul DNA akan semakin cepat, demikian pula sebaliknya
mencegah terjadinya difusi karena timbulnya panas dari arus listrik yang
banyak dipakai untuk pemisahan protein dan asam nukleat (Fatchiyah dkk., 2011).
DNA melalui gel agarosa dipengaruhi oleh faktor ukuran dan konformasi molekul
DNA, konsentrasi agarosa, arus listrik, dan suhu. Pewarna etidium bromide (EtBr)
digunakan untuk alat idenifikasi dan mengukur semikualitatif fragmen DNA yang
terpisah dalam gel. Pewarna ini akan terikat di antara dua untai ganda DNA,
sehingga pita DNA dalam gel agarosa akan berpendar karena pewarna ini
KAJIAN KERAGAMAN GENETIK RUSA TIMOR (Rusa timorensis) TAMAN RUSA, UNIVERSITAS
19
GADJAH MADA
BERDASARKAN GEN PENYANDI Cytochrome Oxidase Sub-unit 2 (COX-2)
PUTRI DWI PURWANTI
Universitas Gadjah Mada, 2015 | Diunduh dari http://etd.repository.ugm.ac.id/
mengandung zat fluoresen. Ikatan DNA-EtBr ini akan terekspos sinar ultraviolet
(UV) level medium, sekitar panjang gelombang λ 300 nm. Etidium bromide dapat
diberikan pada setiap sampel yang akan dimasukkan ke sumur gel atau
dicampurkan ke gel agarosa sebelum gel dicetak dalam cetakan gel (Fatchiyah
dkk., 2011).
Beberapa faktor yang mempengaruhi proses migrasi DNA atau RNA yaitu
konsentrasi agarosa, ukura molekul, voltase dan suhu. Molekul besar seperti
hasil amplifikasi DNA dielektroforesis dengan konsentrasi yang lebih tinggi yaitu
sirkuler lebih cepat dibanding linear, fragmen DNA lebih cepat dibanding genom
utuh. Molekul DNA/RNA bermuatan negatif. Voltase 100 Volt biasa digunakan
untuk analisis rutin, sedangkan bila diperlukan pemisahan yang sempurna, maka
digunakan arus listrik 50 Volt. Pada voltase ini, arus lebih lambat, tetapi hasil
pemisahannya lebih maksimal. Molekul DNA akan cepat terurai pada suhu tinggi
dan akan kembali menyatu bila suhu mendingin (Fatchiyah dkk., 2011).
4. Sekuensing DNA
Frederick Sanger pada tahun 1977. Prinsip kerjanya yaitu terminasi sintesis DNA
(Susanto, 2008).
5. Analisis Data
dan menganalisis urutan DNA dan protein dari perspektif evolusi. Program
MEGA 6.06 memungkinkan untuk mengalokasikan dua kali lebih banyak memori
pada sistem 64-bit seperti pada MEGA 5. Metode waktunya yang ditambahkan
dalam MEGA 5 telah digantikan oleh sistem RealTime berbasis yang akurat (atau
KAJIAN KERAGAMAN GENETIK RUSA TIMOR (Rusa timorensis) TAMAN RUSA, UNIVERSITAS
21
GADJAH MADA
BERDASARKAN GEN PENYANDI Cytochrome Oxidase Sub-unit 2 (COX-2)
PUTRI DWI PURWANTI
Universitas Gadjah Mada, 2015 | Diunduh dari http://etd.repository.ugm.ac.id/
lebih baik dari) metodologi kontemporer, tetapi dengan kecepatan lebih dari 1.000
BAB III
MATERI DAN METODE
B. Materi Penelitian
1. Alat Penelitian
Alat yang digunakan dalam penelitian ini antara lain mikropipet (Gilson)
dengan ukuran 1-10 µl, 20-100 µl, dan 200-1000 µl, waterbath shaker (Eyla, Uni
Thermo Shaker NTS 3000), mini sentrifuge 12 (Hanil 5804R), sentrifuge (Model
seperangkat pencetak agar (plat dan sisir pencetak sumuran), timbangan digital
(Mettler Toledo PB303-S), magnetic stirer, vortex mixer (Maxi Mix II), gelas
ukur, tabung erlenmeyer, eppendorf, rak tabung, spin down, dan ultraviolet
2. Bahan Penelitian
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah darah rusa Timor yang
22
KAJIAN KERAGAMAN GENETIK RUSA TIMOR (Rusa timorensis) TAMAN RUSA, UNIVERSITAS
23
GADJAH MADA
BERDASARKAN GEN PENYANDI Cytochrome Oxidase Sub-unit 2 (COX-2)
PUTRI DWI PURWANTI
Universitas Gadjah Mada, 2015 | Diunduh dari http://etd.repository.ugm.ac.id/
yang berisi RBC lysis buffer, GB buffer, ethanol absolut, wash buffer, elution
buffer, GD column, dan collection tube. Bahan yang digunakan dalam PCR yaitu
readymix Taq DNA Polymerase (Kappa Taq DNA Polymerase), primer, sampel
DNA, dan ddH2O. Primer yang digunakan adalah primer forward berkode
APRA8C2F (10 pmol), primer reverse berkode APRA8C2R (10 pmol). Bahan
EDTA (TBE)1X yang diencerkan dari TBE 5X (1,625 gram Tris base, 13,75
gram asam borat, 1,875 gram EDTA (pH 8,0) dalam 500 ml H2O), dan loading
C. Metode Penelitian
1. Bagan Penelitian
Sekuensing DNA
Bahan utama penelitian yaitu lima sampel darah rusa Timor yang diambil
dari vena jugularis. Darah rusa tersebut dimasukkan ke dalam tabung berisi EDTA
menjendal dan rusak, kemudian darah disimpan dalam refrigerator suhu 4ºC.
Isolasi DNA total menggunakan kit Genomic DNA Mini Kit (Geneaid).
selama lima menit dengan kecepatan 8000 rpm. Buffy coat dipisahkan dari
komponen darah yang lain dan dimasukkan ke dalam eppendorf yang berbeda.
Setiap eppendorf tersebut diberi label sesuai dengan kode sampel dan disimpan
ditambahkan 600 µl RBC lysis buffer dan diinkubasi selama 10 menit pada suhu
rpm selama tiga menit. Setelah terlihat batas supernatan (bagian atas) dan pelet
(bagian bawah), maka supernatan dibuang. Pelet ditambahkan 500 µl RBC lysis
buffer dan diresuspensi. Campuran tersebut ditambahkan 250 µl GB buffer dan di-
pada suhu 60ºC. Dalam waktu dan suhu yang sama, 400 µl elution buffer
diinkubasikan juga.
KAJIAN KERAGAMAN GENETIK RUSA TIMOR (Rusa timorensis) TAMAN RUSA, UNIVERSITAS
25
GADJAH MADA
BERDASARKAN GEN PENYANDI Cytochrome Oxidase Sub-unit 2 (COX-2)
PUTRI DWI PURWANTI
Universitas Gadjah Mada, 2015 | Diunduh dari http://etd.repository.ugm.ac.id/
segera di-vortex selama 10 detik. Bila ada endapan, maka larutan diresuspensi.
disentrifugasi dengan kecepatan 13500 rpm selama lima menit dan GD column
dipasang pada collection tube yang baru. Wash buffer 400 µl ditambahkan melalui
GD column dan disentrifugasi dengan kecepatan 13.500 rpm selama satu menit,
kemudian cairan yang ada dalam collection tube dibuang, GD column dipasang
GD column dan disentrifugasi dengan kecepatan 13.500 rpm selama satu menit.
Cairan yang ada dalam collection tube dibuang, kemudian GD column dipasang
kembali di atas collection tube tersebut. Dengan kecepatan yang sama dengan
sebelumnya yaitu 13.500 rpm collection tube disentrifugasi kembali selama tiga
yang telah diisi air panas dari waterbath disiapkan dan ditambahkan air kran
sampai suhu menjadi 37oC (diukur memakai termometer). Setelah itu, GD column
beserta eppendorf diinkubasikan ke dalam beker glass tersebut dengan suhu 37oC
selama 10 menit. Setelah diangkat dari beker glass, dilakukan sentrifugasi dengan
kecepatan 13.500 rpm selama satu menit. Elution buffer 100µl ditambahkan
kembali dan diinkubasikan selama 10 menit pada suhu 37ºC dalam beker glass,
Kualitas DNA hasil isolasi dilihat dengan dielektroforesis pada gel agarose
selama 30 menit.
Hasil isolasi DNA digunakan sebagai cetakan atau template DNA dalam
primer APRA8C2F dan APRA8C2R, 16 µl DNA total dari Rusa timorensis dan
pre-denaturasi pada suhu 94ºC selama 5 menit, denaturasi pada 94ºC selama satu
menit, annealing atau proses penempelan pada 52ºC selama 45 detik, elongation
atau proses pemanjangan pada suhu 72ºC selama satu menit, dan post-elongation
pada suhu 72ºC selama lima menit. Reaksi dilakukan sebanyak 35 siklus.
isolasi DNA dan PCR. Proses yang dilakukan pertama kali adalah pembuatan gel.
Konsentrasi gel yang digunakan adalah 1% yaitu 0,25 gram agarose dilarutkan
KAJIAN KERAGAMAN GENETIK RUSA TIMOR (Rusa timorensis) TAMAN RUSA, UNIVERSITAS
27
GADJAH MADA
BERDASARKAN GEN PENYANDI Cytochrome Oxidase Sub-unit 2 (COX-2)
PUTRI DWI PURWANTI
Universitas Gadjah Mada, 2015 | Diunduh dari http://etd.repository.ugm.ac.id/
dengan 25 ml TBE 1X atau 0,5 gram agarose dalam 50 ml TBE 1X. Volume 25
oven selama 45 detik. Setelah itu, dalam gel cair ditambahkan Florosafe DNA
sebagai pewarna sebanyak 1-2 µl untuk volume gel 25 ml dan 3 µl untuk volume
gel 50 ml. Cetakan yang terbuka ditutup dengan isolasi dan diletakkan di dudukan
gel. Jika gel cair sudah tidak terlalu panas (suhu sekitar 55ºC), gel cair dituangkan
Setelah gel mengeras, plat yang berisi gel agarose diletakkan dalam bak
elektroforesis yang berisi larutan buffer sesuai dengan buffer yang digunakan
untuk membuat gel agarose yaitu TBE 1X. Sampel hasil PCR sebanyak 3 µl
dilakukan dengan arus listrik 90 Volt dan ditunggu hingga proses selesai sekitar ±
(λ=260 nm).
6. Sekuensing DNA
terminasi rantai). Sekuensing DNA dilakukan sebanyak dua kali reaksi untuk
cetakan dalam reaksi sekuensing. Komponen lain yang digunakan selain hasil
PCR dan primer adalah enzim Taq Polymerase, dNTP dan ddNTP.
7. Analisis Data
analisis gen dilakukan berdasarkan urutan nukleotida dan asam amino. Urutan
sampai 2.000 bp diperlukan MEGA versi 6.06 yang sangat efisien baik dari segi
Sekuen gen penyandi COX-2 dari spesies rusa lain dan dari famili lain
yang digunakan sebagai pembanding diambil dari Genbank, antara lain Rusa
(NC_004563.1); dan spesies dalam famili lain (Bovidae) yaitu Bos javanicus
(NC_012706.1).