LAPORAN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI

MATERI ACARA :

Morfologi Bakteri (Pewarnaan Sederhana dan Pewarnaan Diferensial)

NAMA KELOMPOK / NIM :

1. Jessica Margareta 16.0552

2. Tita Setya Utami 16.0553
3. Rina Ayu K 16.0570
4. Agastia Cicilia 16.0575
5. Cindy Wahyu K 16.0603

AKADEMI FARMASI THERESIANA

JL. GAJAHMADA NO 91 SEMARANG
2017
 LAPORAN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI
Morfologi Bakteri (Pewarnaan Sederhana dan Pewarnaan Diferensial)

II. TUJUAN

1. Mahasiswa mampu melakukan pewarnaan sederhana dengan pewarnaan

negatif dan positif
2. Mahasiswa mampu mengetahui dan memahami prosedur pewarnaan gram
dan mengelompokkan bakteri ke dalam kelompok bakteri gram positif
atau bakteri gram negatif serta menentukan morfologinya.
3. Mahasiswa mampu mengetahui perbedaan antara bakteri gram negarif
dan bakteri gram positif

III. DASAR TEORI

Melihat dan mengamati bakteri dalam keadaan hidup sangat sulit, karena
selain bakteri itu tidak bewarna juga transparan dan sangat kecil. Untuk mengatasi
hal tersebut maka dikembangkan suatu teknik pewarnaan sel bakteri ini
merupakan salah satu cara yang paling utama dalam penelitian-penelitian
mikrobiologi (Dwidjoseputro,1998)

Zat warna yang mengabsorbsi dan membiaskan cahaya sehingga kontras

mikroorganisme dengan sekelilingnya ditingkatkan. Pewarnaan yang digunakan
untuk melihat salah satu struktur sel disebut pewarnaan khusus, sedangkan
pewarnaan yang digunakan untuk memilah organisme dosebut pewarnaan
diferensial. Pewarnaan gram merupakan contoh pewarnaan diferensial yang
memilah bakteri menjadi dua yaitu kelompok gram positif dan gram negatif (Lay
W, Bibiana 1994)

Pewarnaan bakteri yang menggunakan lebih dari satu zat warna seperti
pewarnaan gam dan pewarnaan tahan asam. Pewarnaan gram adalah salah satu
teknik pewarnaan diferensial yang paling penting dan paling luas digunakan untuk
bakteri (Pelczar dan Chan, 1986)
 Perbedaan warna antara bakteri gram negatif dan bakteri gram positif
disebabkan oleh adanya perbedaan struktur dinding selnya. Dinding gram positif
mengandung banyak peptidoglikan, sedangkan dinding bakteri gram negatif
banyak mengandung lipopolisakarida (Suriawira,1999)

Bakteri tahan asam merupakan bakteri yang kandungan lemaknya sangat

tebal sehingga tidak bisa diwarnai dengan reaksi pewarnaan biasa, tetapi harus
dengan pewarnaan tahan asam. Kelompok bakteri ini disebut bakteri tahan asam
(BTA) karena dapat mempertahankan zat warna pertama sewaktu dicuci dengan
larutan pemucat. Golongan bakteri ini biasanya bersifat patogen pada manusia
contohnya Mycobacterium tuberculosis (Pelczar dan Chan,1986)

IV. ALAT DAN BAHAN

Alat Bahan
1. Ose bulat 1. Biakan bakteri S.aureus,
2. Lampu spiritus E.coli, B.subtilis
3. Object glass 2. Minyak imersi
4. Mikroskop 3. Tinta nigrosin
5. Tissue 4. Cat krystal violet
6. Korek api 5. Cat gram A (krystal violet)
7. Pipet tetes 6. Cat gram B ( Iodine)
7. Cat gram C (Alkohol aseton)
8. Cat gram D (safranin)
9. Alkohol 70%
V. CARA KERJA

Pewarnaan Negatif

Gelas Benda dibersihkan dengan alkohol sampai bebas lemak, panaskan sebentar
di lampu spiritus

Tetesi gelas benda dengan 1 tetes tinta nigrosin

Diambil 1 ose suspensi biakan murni B.Subtilis dengan ose bulat dengan ose bulat
secara aseptis

Diletakkan suspensi biakan B. Subtilis di dalam tetesan tinta nigrosin

Diratakan tetesan di nigrosin di permukaan gelas benda menggunakan gelas benda

yang bersih

Dikeringkan preparat dan diamati di bawah mikroskop perbesaran

100xmenggunakan minyak imersi

Catat hasil pengamatan

Pewarnaan positif

Gelas benda dibersihkan dengan alkohol sampai bebas lemak

Diambil secara aseptis 1 ose suspensi biakan B.Subtilis diratakan pada permukaan
gelas benda

Difiksasi diatas lampu spiritus

 Diteteskan larutan kristal violet diatas preparat, biarkan 1-2 menit

Cuci dengan air menalir sampai sisa cat hilang, kering anginkan

Amati dengan mikroskop perbesran kuat (obyektif 100x) dengan minyak imersi,
bakteri akan berwarna ungu

Gambar morfologi bakteri

Pewarnaan gram

Gelas benda dibersihkan dengan alkohol hingga bebas lemak

Diambil suspensi biakan B.Subtillis, E.Coli, S.Aereus secara aseptis

Diletakkan dan diratakan pada permukaan gelas benda kira-kira 1 cm

Dikeringkan dan difiksasi diatas lampu spiritus

Setelah dingin, ditetesi cat gram A 2-3 tetes diamkan selama 1 menit

Dicuci dengan air mengalir kemudian dikeringkan

Ditetesi cat gram B 2-3 tetes diamkan selama 1 menit

Dicuci dengan air mengalir kemudian dikeringkan

 Ditetesi cat gram C diamkan 30 detik

Dicuci dengan air mengalir kemudian dikeringkan

Ditetesi cat gram D diamkan selama 2 menit

Dicuci dengan air mengalir kemudian dikeringkan

Diamati dibawah mikroskop perbesaran kuat 100x

VI. HASIL PENGAMATAN

GAMBAR KETERANGAN

Gambar berikut menggunakan bakteri B.

subtilis pada pewarnaan sederhana
negatif. Pada mikroskop menggunakan
perbesaran 400 x, terbentuk batang
berwarna transparan.

Gambar berikut menggunakan bakteri B.

subtilis perwarnaan sederhana postif.
Pada pewarnaan gram A bewarna ungu.
Pada pewarnaan gram B berwarna ungu
pekat.
Pada pewarnaan gram C warna ungu
pudar
Pada pewarnaan gram D berwarna ungu.
Sehingga bakteri B. subtilis termasuk
bakteri gram positif.

Gambar berikut menggunakan bakteri E.

coli pewarnaan diferensial dengan bentuk
oval berwarna ungu. Pada pewarnaan
gram A berwarna ungu.
Pada pewarnaan gram B berwarna ungu
yang lebih pekat.
Pada pewarnaan gram C warna ungu
yang dihasilkan pudar.
Pada pewarnaan gram D warna menjadi
merah sehingga bakteri E.coli termasuk
bakteri gram negatif.

Gambar berikut menggunakan bakteri S.

aureus pewarnaan diferensial dengan
bentuk garis bergerombol berwarna ungu.
Pada pewarnaan gram A warna menjadi
ungu.
Pada pewarnaan gram B warna ungu
menjadi lebih pekat.
Pada pewarnaan gram C warna yang
dihasilkan menjadi pudar. Pada pewarnaan
gram D warna menjadi ungu sehingga
bakteri S. aureus termasuk bakteri gram
positif.
VII. PEMBAHASAN

Pada praktikum kali ini, dilakukan pengamatan Morfologi Bakteri dengan

Pewarnaan Sederhana (gram negatif dan gram positif) dan Pewarnaan Diferensial
(pewarnaan gram) pada bakteri.

Cik tambahi pewarnaan sederhana gimana gimana wkkw trs sama hasil nya
gimana tulis sekalian wkwk

Ini yang pewarnaan diferensial udah

Pewarnaan gram dilakukan bertujuan sama dengan uji gram yaitu untuk
membedakan bakteri apakah gram positif atau gram negatif. Pewarnaan gram
menggunakan lebih dari satu pewarna dan memiliki reaksi yang berbeda untuk
setiap bakteri sehingga dapat digunakan untuk membedakan bakteri. Pewarnaan
gram ini mampu membedakan dua kelompok besar bakteri, yaitu gram positif dan
gram negatif.

Langkah – langkah yang dilakukan selama pewarnaan gram adalah proses

sterilisasi sangat penting dibutuhkan sebelum memulai maupun mengakhiri dalam
praktek. Alkohol yang disemprotkan pada tangan, kaca preparat dan meja, bahkan
tanganpun sebelumnya harus dicuci dengan sabun terlebih dahulu. Hal tersebut
berfungsi untuk menyeterilkan atau membunuh mikroorganisme yang tak
diinginkan agar mendapatkan hasil yang akurat.

Sample biakan bakteri Bacillus subtilis, Escherichia coli dan

Staphyloecoccus aureus diambil sekitar 1 – 2 ose, diletakkan di atas obyek glass
serta dirataka dengan jarum ose. Kemudian difiksasi untuk menguapkan air
sehingga hanya akan didapatkan bakteri saja. Proses fiksasi juga bertujuan supaya
bakteri benar-benar melekat pada obyek glass sehingga olesan bakteri berupa
tetesan sampel tidak akan terhapus apabila dilakukan pencucian. Proses fiksasi
dengan pemanasan biasanya di atas bunsen pada pewarnaan gram dapat
menyebabkan bakteri tersuspensi mati atau tidak produktif apabila suhu terlalu
tinggi, walaupun dapat melekatkan bakteri pada kaca preparat. Setelah itu biakan
bakteri dituangi pewarna crystal violet yang berfungsi memberikan pewarnaan
pada bakteri tersebut. Bakteri akan berwarna ungu. Penuangan crystal violet harus
merata pada seluruh area biakan bakteri pada kaca preparat agar bakteri dapat
terwarnai dengan sempurna. Bakteri yang telah diwarnai dibiarkan selama 1 menit
agar pengikatan warna oleh bakteri menjadi semakin kuat. Kemudian sisa crystal
violet dan dicuci dengan air mengalir dan dikering preparat dengan tissue.

Langkah selanjutnya, penuangan lugol’s iodium kemudian didiamkan

selama 2 menit. Lugol’s Iodium merupakan pewarna Mordan, yaitu pewarna yang
berfungsi mengfiksasi pewarna primer yang diserap mikroorganisme target atau
mengintensifkan warna utama. Pemberian iodium bertujuan untuk memperkuat
pengikatan warna oleh bakteri. Kompleks zat iodin terperangkap antara dinding
sel dan membran sitoplasma organisme gram positif, sedangkan penyingkiran zat
lipida dari dinding sel organisme gram negatif dengan pencucian alkohol
memungkinkan hilang dari sel. Iodium yang diteteskan didiamkan selama 2 menit
bertujuan agar pengikatan warna oleh bakteri menjadi semakin lebih kuat. Setelah
itu, kaca preparat dibilas dengan aquades hingga warnanya hilang dan dikeringkan
dengan menggunakan hair drier.

Langkah selanjutnya adalah meneteskan larutan Alkohol Aseton dengan

perlahan sampai warna ungu hilang. Penetesan larutan Alkohol Aseton pada
biakan bakteri untuk melakukan penetrasi ke dalam dinding sel dan melunturkan
pewarnaan ungu dari komplek Kristal ungu dan iodium. Pada gram positif akan
tetap mempertahankan warna ungu karena mengandung peptidoglikan. Bakteri
gram positif akan mengalami dehidrasi pada dinding selnya dan pori-porinya
menciut karena daya rembes dinding sel dan membrane menurun sehingga
komplek Kristal ungu dan Lugol’s iodium tidak dapat keluar dari sel dan tetap
berwarna ungu. Setelah itu dibilas dengan air mengalir bertujuan agar warna dapat
luntur secara sempurna dan tidak ada yang tersisa di obyek glass. Kemudian
ditambahkan safranin dengan menuangkannya dan dibiarkan selama 30 detik.
Pewarna safranin merupakan pewarna sekunder atau kontras berfungsi untuk
mewarnai kembali sel – sel yang telah kehilangan pewarna utama setelah
perlakuan alkohol. Pewarnaan safranin masuk ke dalam sel dan menyebabkan sel
menjadi berwarna merah pada bakteri gram negatif sedangkan pada bakteri gram
positif dinding selnya terdehidrasi dengan perlakuan alkohol, pori – pori
mengkerut, daya rembes dinding sel dan membran menurun sehingga pewarna
safranin tidak dapat masuk sehingga sel berwarna ungu.Kemudian dibuang
kelebihan safranin, dicuci dengan air mengalir, dan dikeringkan dengan hair drier.

Pemberian reagen atau pewarna yang berganti dari satu pewarna ke

pewarna lain dengan waktu yang telah ditentukan disebabkan karena zat-zat
warna tersebut dapat berikatan dengan komponen dinding sel bakteri dalam waktu
singkat. Karena itulah rentang waktu pemberian zat warna yang satu ke yang
lainnya tidak lama sehingga proses identifikasi bakteri berlangsung cepat
(efisiensi waktu).

Setiap akhir pemberian reagen atau pewarna, selalu dilakukan pembilasan

terhadap preparat dengan menggunakan air mengalir. Pembilasan ini bertujuan
untuk mengurangi kelebihan setiap zat warna yang sedang diberikan. Setiap akhir
pembilasan pada masing-masing reagen, perlu dilakukan penyerapan air bilasan
dengan menggunakan tissue, agar air tidak tercampur dengan reagen atau pewarna
baru yang akan diberikan. Setelah pembilasan terakhir, preparat dikeringkan dan
ditambahkan minyak imersi pada preparat dan diamati di bawah mikroskop
dengan pembesaran lemah baru kemudian dibesarkan dengan pembesaran kuat (
100X ). Jika terbentuk warna ungu maka termasuk golongan bakteri gram positif
dan jika terbentuk warna merah atau merah muda maka termasuk golongan
bakteri gram negatif.

Pada pewarnaan Gram, bakteri yang digunakan yaitu Bacillus subtilis,

Escherichia coli dan Staphyloecoccus aureus. Dari hasil pewarnaan Gram dan
setelah diamati dengan bantuan mikroskop bahwa Staphylococcus aureus dan
Bacillus subtilis merupakan bakteri gram positif. Sedangkan Escherichia coli
merupakan bakteri gram negatif.
 Pada pengamatan Staphylococcus aureus berwarna merah muda dan ada
yang sedikit biru tua sampai ungu. Morfologinya stafilokokus, dan berbentuk
bulat. Bakteri ini umumnya tumbuh bergorombol sehingga tampak seperti anggur.
Sedangkan Bacillus subtilis bewarna ....................... morfologinya............

Gambar1. Staphylococcus aureus Gambar2. Bacillus subtilis

Bakteri garam positif ialah bakteri yang mengikat warna utama (crystal
violet) dengan kuat sehingga tidak dapat di lunturkan oleh peluntur dan tidak
diwarnai lagi oleh zat warna lawan (safranin) pada mikroskop sel-sel bakteri
tampak berwarna ungu. Bakteri Gram positif terlihat berwarna ungu karena
dinding selnya mengikat Kristal violet lebih kuat. Namun selama praktek, hasil
warna bakteri yang kami amati berwarna merah muda dan ada yang sedikit biru
tua. Perbedaan warna ini disebabkan oleh kesalahan pada proses pewarnaan dalam
tahap pengeringan preparat yang terlalu panas sehingga menghasilkan warna
merah muda dan bakteri yang seharusnya gram positif berubah menjadi bakteri
gram negatif.

Staphylococcus aureus dan Bacillus subtilis termasuk ke dalam bakteri

gram positif. Karena menggunakan teknik pewarnaan gram, bakteri ini memiliki
peptidoglikan yang tebal, sehingga dapat mengikat cat gram dengan kuat,
sehingga disebut gram positif. Karena termasuk dalam kelompok bakteri gram
positif, maka warna dari Staphylococcus aureus dan Bacillus subtilis adalah ungu
dengan warna dasar merah. Hal tersebut dikarenakan kandungan lipid dari bakteri
gram positif lebih rendah dan banyak mengandung peptidoglikan. Karena
kandungan lipidnya yang lebih rendah, dinding sel bakteri gram positif menjadi
terdehidrasi selama perlakuan dengan etanol sehingga bakteri gram positif
mempertahankan zat pewarna ungu kristalnya.
Sama yang e.coli kok isa masuk ke gram negatif tu gimana gimana sama hasilnya
tu gimana gimana llalaililili wkwkkw

MAKASYIII CIXXXX AYAFLUUUUUU

VIII. KESIMPULAN

1. Pewarnaan sederhana
 Pewarnaan negatif merupakan pewarnaan tidak langsung,
karena yang diwarnai adalah latar belakang preparatnya.
Sehingga dapat digunakan untuk melihat bentuk sel yang
sesungguhnya
 Pewarnaan positif, bakteri akan terlihat berwarna sesuai dengan
warna cat yang digunakan. Pewarnaan dilakukan hanya dengan
satu macam larutan pewarna.
2. Dari hasil pewarnaan Gram dan setelah diamati dengan bantuan
mikroskop bahwa Staphylococcus aureus dan Bacillus subtilis
merupakan bakteri gram positif. Sedangkan Escherichia coli
merupakan bakteri gram negatif.
 Staphylococcus aureus berwarna merah muda dan ada yang
sedikit biru tua sampai ungu. Morfologinya stafilokokus, dan
berbentuk bulat. Bakteri ini umumnya tumbuh bergorombol
sehingga tampak seperti anggur.
 Bacillus subtillis berwarna ungu. Morfologinya batang dan
 Escherhia coli berwarna merah. Morfologinya...........
3. Perbedaan warna antara bakteri gram negatif dan bakteri gram positif
disebabkan oleh adanya perbedaan struktur dinding selnya. Bakteri
gram negatif akan menghasilkan warna merah dan gram positif akan
menghasilkan warna ungu. Dinding gram positif mengandung banyak
peptidoglikan, sedangkan dinding bakteri gram negatif banyak
mengandung lipopolisakarida.
 IX. DAFTAR PUSTAKA

Dwidjoseputro. 1998. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Malang : Djambatan.

Lay, Bibana., W. 1994. Analisis Mikroba di Laboratorium. Jakarta : PT Rajawali

Suriawira, U. 2005. Mikrobiologi Dasar. Jakarta : Papas Sinar Sinanti.

Pelczar., Michael J. Dan E.C.S. Chan., 2008. Dasar-Dasar Mikrooragnisme.

Jakarta : Universitas Indonesia Press.

X. LAMPIRAN

Bakteri Pewarnaan Pewarnaan Gram Keteran

sederhana gan
Positif Negatif Gram A Gram B Gram C Gram D
B. subtilis Batang Ungu Ungu Ungu Ungu Gram
transpara lebih pudar Positif
n pekat
E. coli Ungu, Ungu Ungu Ungu Merah Gram
oval lebih pudar Negatif
pekat
S. aureus Garis, Ungu Ungu Ungu Ungu Gram
merah lebih pudar Positif
pekat
 Semarang, 29 Maret 2017

Praktikan Dosen Pembimbing

( Jessica Margareta ) ( Septiana Laksmi R, M.Sc., Apt )

( Tita Setya U )

( Rina Ayu K )

( Agastia Cicillia )

( Cindy Wahyu )