I.

Tujuan
a. Mampu menlakukan dan menjelaskan mekanisme/ proses yang
terjadi pada kromatografi lapis tipis.
b. Mampu menjelaskan penggunaan penampak bercak spesifik dan
umum dalam pemantauan ekstrak rimpang kunyit.
II. Prinsip percobaan
Pemantuan ekstarak dengan KLT dimana terjadi proses adsorpsi
antara fase dari fase gerak yang menarik senyawa dan sampel
bedasarkan sifat kepolaran senyawa terebut.

III Dasar Teori

3.1. Tinjauan Tentang Krimatografi
Dari segi teknik pelaksanaannya, kromatografi berkembang dari
kromatografi kolom, kromatografi kertas, kromatografi lapisan tipis (KLT),
kromatografi gas (GC), dan kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT). Pada
dasarnya semuakromatografi menggunakan dua fase, yaitu fase diam
(stasioner) dan fase gerak (mobile). Ditinjau dari mekanismenya,
kromatografi merupakan teknik pemisahan campuran zat yang
berdasarkan atas perbedaan kecepatan migrasi dari masing-masing
komponennya pada fase diam dibawah pengaruh suatu pelarut (eluen)
yang bergerak atau yang disebut fase gerak.
Berdasarkan mekanisme terjadinya pemisahan, macam fase diam
serta teknik operasionalnya, kromatografi digolongkan sebagai berikut:
a) Berdasarkan mekanisme terjadinya pemisahan:
 Kromatografi adsorbsi
 Kromatografi partisi
 Kromatografi penukar ion
 Kromatografi filtrasi/permeasi
 Kromatografi elektroforesis
b) Berdasarkan macam fase gerak dan fase diam
 Kromatografi cair-padat
 Kromatografi cair-cair
  Kromatografi gas-padat
 Kromatografi gas-cair
c) Berdasarkan teknik operasionalnya
 Kromatografi kolom
 Kromatografi kertas
 Kromatografi lapisan tipis
 Kromatografi gas
 Kromatografi cair kinerja tinggi

Mekanisme Fase Gerak – Fase Teknik Operasional

Pemisahan Diam
Cair – Padat Kolom, Kertas, Lapis
Adsorbsi
Tipis
Gas – Padat Kromatografi Gas
Cair – Cair Kolom, Lapis Tipis,
Partisi
HPLC
Gas – Cair Kromatografi Gas
Pertukaran Ion Cair – Padat Kolom, Lapis Tipis,
HPLC
Filtrasi/permeasi Cair – Padat Kolom, Lapis Tipis,
HPLC
Elektroforesis Cair – Cair Kolom, Kertas, Lapis
Tipis
Dari segi operasionalnya, kromatografi lapisan tipis lebih disukai
daripada kromatografi yang lain. Dibandingkan dengan kromatografi
kolom, kromatografi lapisan tipis mempunyai keunggulan antara lain:
a) Lebih fleksibel
b) Memungkinkan untuk pengembangan metode yang lebih cepat
c) Dapat digunakan untuk analisis sampel secara simultan
d) Biaya analisis lebih rendah
e) Memungkinkan untuk pengamatan terjadinya pemisahan
f) Waktu analisis lebih efisien
 3.2. Tinjauan Tentang Krimatografi Lapis Tipis (KLT)
Kromatografi lapisan tipis (KLT) merupakan metode pemisahan
komponen-komponen atas dasar perbedaan adsorbsi atau partisi oleh
fase diam di bawah pengaruh gerakan pelarut pengembang atau pelarut
pengembang campur. Pemilihan pelarutpengembang sangat dipengaruhi
oleh macam dan polaritas zat-zat kimia yang dipisahkan. KLT
merupakan salah satu bentuk/model dari kromatografi cair dimana
sampel diaplikasikan sebagai noda atau goresan pada lapisan penjerap
tipis yang dilaburkan diatas lempeng plastik, gelas, atau logam.
Beberapa alasan digunakannya KLT diantaranya adalah
penggunaan yang mudah, dapat digunakan secara luas pada sampel
yang berbeda, sensitivitasnya tinggi, kecepatan pemisahan dan biaya
yang relatif lebih murah. KLT dapat digunakan untuk:
a) Mengetahui kemurnian suatu senyawa
b) Memisahkan dan mengidentifikasi komponen dalam suatu
campuran
c) Analisis kuantitatif dari satu atau lebih komponen yang terdapat
dalam sampel.
Keuntungan daripada pemakaian KLT antara lain:
a) Solven yang digunakan sedikit
b) Polaritas dari solven dapat dirubah dan diatur dalam beberapa
menit,
c) Jumlah sampel yang diukur dalam satu kali pengukuran
/pengembangan lebih banyak, dalam satu pelat KLT berukuran
20x20 cm dapat ditotolkan lebih kurang 20 titik awal

3.3. Pelaksanaan Kromatografi Lapis Tipis

a) Lapisan tipis / pelat
Sebagai adsorben dapat digunakan silika gel, alumina, tanah
diatomae, selulosa, poliamida, resin, penukar ion, sephadeks dan
sebagainya. Dari berbagai adsorben tersebut yang banyak
digunakan adalah silika gel, karena dapat dipakai untuk KLT
 adsorbsi maupun partisi. Tebal lapisan berkisar antara 0,15 – 2,0
mm, tergantung pada kebutuhan. Untuk analisis umumnya 0,2
mm. Untuk maksud preparatif tebal lapisan ± 2,0 mm.
b) Fase gerak (eluen)
Fase gerak ialah medium angkut dan terdiri atas satu atau
beberapa pelarut. Gerakan ini disebabkan oeh adanya gaya
kapiler. Untuk fase gerak ini digunakan pelarut yang berderajat
kemurnian untuk kromatografi atau pro analisis. Jika diperlukan
sistem pelarut multi komponen harus berupa suatu campuran
yang sesederhana mungkin dan maksimum terdiri atas tiga
komponen.
c) Bejana pemisah
Bejana harus tertutup rapat, untuk mencegah penguapan eluen
dari permukaan pelat, bejana harus dijenuhkan dengan uap eluen
dengan cara meletakkan kertas saring di seluruh dinding sebelah
dalam bejana dan membiarkannya sampai seluruh kertas saring
dibasahi dengan uap eluen. Tingkat kejenuhan bejana dengan
eluen mempunyaipengaruh yang nyata pada pemisahan dan letak
noda pada kromatogram.
d) Awal dan jumlah cuplikan
Penotolan dilakukan dengan menggunakan kapiler yang
berukuran 1μl, 2μl, 5μl atau 10μl tergantung dari kebutuhan. Jarak
antara satu bercak awal dangan bercak aawal yang lain sekurang-
kurangnya 10mm.
e) Pengembangan / eluasi
Pengembangan atau eluasi ialah proses pemisahan campuran
akibat fase gerak atau pelarut pengembang merambat naik
melalui pelat/lapisan tipis. Jarak pengembangan normal yaitu jarak
antara garis awal penotolan dan garis akhir pengembangan
adalah 100mm.
Berdasarkan arah pengembangan, ada beberapa macam cara
pengembangan, yaitu :
  Pengembangan naik (ascending)
Cara ini paling umum digunakan, arah pengembangan keatas.
Gerak eluen lambat karena dipengaruhi gaya gravitasi.Hal
tersebut justru menguntungkan karena dapat dicapai
kesetimbangan partisi yang lebih sempurna sehingga akan
didapat noda yang kompak dan terpisah dengan baik.
 Pengembangan turun (descending)
Cara ini sering digunakan untuk kromatografi kertas, tetapi
jarang digunakan untuk kromatografi lapisan tipis.
 Pengembangan Dua Dimensi atau Pengembangan Ganda
Cara ini merupakan salah satu keuntungan KLT bila
dibandingkan dengan kromatografi kolom.Disini dilakukan dua
kali pengembangan dengan eluen yang sama atau berbeda.
Arah gerakan eluen naik dimana pengembangan pertama
arahnya tegak lurus dengan pengembangan kedua. Cara ini
digunakan untuk memisahkan zat yang mempunyaiharga Rf
yang sangat berdekatan atau menumpuk.
f) Deteksi noda
Jika zat yang dipisahkan sudah berwarna, maka noda hasil
pemisahan akan nampak dengan sendirinya. Tetapi jika zat yang
dipisahkan tidak berwarna maka harus dilakukan deteksi noda.
Yang paling sederhana adalah deteksi dengan menggunakan
sinar UV gelombang pendek 256 nm atau gelombang panjang 365
nm. Apabila dengan sinar UV, noda tidak dapat terdeteksi maka
harus dicoba dengan reaksi kimia yaitu menyemprot pelat dengan
pereaksi tertentu sehingga terjadi noda yang berwarna.
g) Angka Rf
Angka Rf berkisar antara 0,00 sampai 1,00 sedangkan harga hRf
ialah angka Rf dikalikan 100 (faktor h), menghasilkan nilai dengan
interval 0 sampai 100. Harga Rf dipengaruhi oleh beberapa faktor,
namun jikasemua variabel dikendalikan, Rf cukup konstan pada
kondisi yang disamakan. Tiap komponen mempunyai harga Rf
 yang khas. Komponen terpisah baik jika harga Rf berbeda minimal
0,1.
3.4. Parameter Hasil Pengukuran Dengan KLT
Untuk hasil kromatogram KLT dapat disimpulkan spesifikasi
sebagai berikut:Jumlah bercak, Warna bercak, Letak bercak. Dengan
tiga spesifkasi kromatogram tersebut, dapat digunakan untuk: identifikasi
dan analisis adanya suatu kandungan kimia yang lain dalam bahan yang
dianalisis.
Dari kromatogram yang diperoleh dihitung harga Rf (faktor
retardasi) untuk tiap-tiap noda kromatogram dari zat yang diperiksa
sebagai berikut :
ℎ ℎ
Rf=
ℎ ℎ

Perkiraan identifikasi diperoleh dengan pengamatan dua bercak

noda yang tampak dengan pengamatan harga Rf dan ukuran yang
kurang lebih sama. Jika zat yang diperiksa mempunyai warna, ukuran,
dan harga Rf yang hampir sama, maka kedua zat tersebut kemungkinan
adalah sama.

IV. Alat dan Bahan

 Alat:
1. Sinarlampu UV λ 254 nm danλ 366 nm
2. Bejana KLT
3. KertasWhatman (untukKKt)
4. Kertassaring
5. Pipakapiler
6. Botolpenampakbercak
7. Penggarisbesi
 Bahan:
1. Ekstrak
2. Pembanding
3. Penampakbercak
V. Prosedur Kerja
PemantauandenganKromatografi Lapis Tipis (KLT)

Siapkanbejana KLT (chamber)

Lapisibejanadengankertassaring

Siapkaneluen/ fasegerak/ pengembang (pelaruttunggal/ campuran)

Masukkaneleundalambejanadantutuprapat (biarkanbejanajenuhdenganuapeluen)

Larutkanekstrakkentaldalampelarut

Totolkanekstrakpada plat denganpipakapiler

Biarkantotolanekstrakmengering

Masukkan plat yang sudahditotolkankedalambejana

Biarkaneluen/ fasegeraknaiksampai 2 cm sebelumpinggirpelarut

Angkatpelan, biarkan plat mengering

Lihatwarnabercaksecara visual dibawahlampu ultra violet,

semprotdenganpenampakbercak universal atauspesifik
VI. Laporan data pemantauan (EkstrakRimpangKunyit)

1. SenyawaIdentitas : Kurkumin
2. Struktur
Kimia :

3. PolaKromatografi :
- Fasegerak
- Fasediam
- Larutanuji
- Larutan pembanding
- Volume penotolan
larutan uji dan
- Deteksi
- Rfpembandingkurkumin
- Rujukan pustaka
: Kloroform P-metanol P (95:5)
: Silika gel 60 F254
: 5% dalametanol P
: Kurkumin 0,1% dalam etanol P
: Totolkan masing-masing 2 µL
Larutan pembanding
: UV366
: 0,62
Rf 1 = 0,09
Rf 2 = 0,24
Rf3 = 0,62
: Farmakope Herbal Indonesia

VII. Hasil Pengamatan

Titikke- Jarak
JarakEluen Rf
Spot
1,3
1. 5,5 cm 1,3 cm = = 0,23
5,5
1,9
2. 5,5 cm 1,9 cm = = 0,34
5,5
 2,8
3. 5,5 cm 2,8 cm = = 0,5
5,5
3,8
4. 5,5 cm 3,8 cm = = 0,69
5,5

VIII. Pembahasan

Kromatografi Lapis Tipis (KLT) adalah suatu teknik yang sederhana

yang banyak digunakan, metode ini menggunakan lempeng kaca atau
lembaran plastik yang ditutupi penyerap atau lapisan tipis atau kering.
Untuk menotolkan karutan cuplikan pada lempeng silika, pada dasarnya
menggunakan mikro pipet atau pipa kapiler. Seteelah itu, bagian bawah
dari lempeng dicelupkan alam larutan penegemulsi di dalam wadah yang
tertutup. Jarak batas bagian bawah dengan titik penotolan dilihat
bedarsarka atau perkiraan tinggi elluen yang digunakan didalam chamber.

Identifikasi ekstrak rimpang kunyit dilakukan dengan organoleptis

dan pemeriksaan senyawa identitas kurkuminoid secara KLT.
Pemeriksaan organoleptis ekstak rimpang kunyit bertujuan untuk
mengetahui adanya kekhususan bau khas kunyit, rasa pahit, bentuk
kental, dan warnacoklat kekuninganhampir sesuai dengan ektarak
rimpang kunyit yang tercantum dalam monografi ekstrak tumbuahan obat
indonesia.

Pemeriksaan kandungan kimia secara kromatografi lapis tipis (KLT)

dilakukan untuk memperoleh gambaran mengenai kandungan senyawa
kimia yang terdapat dalam ekstrak rimpang kunyit. Peneriksaan identitas
kurkumin secara KLT bertujuan untuk mengetahui apakah ekstrak rimpang
kunyit mengandung kurkuminoid dengan cara membandingkan nilai RF
dan warna bercak ekstrak tesebut dengan standar kurkumin. Pada
pemeriksaan kandungan kurkumin secara KLT digunkan fase diam
berupa silika gel GF 254dan fase gerak berupa klorofrom : Etanol dengan
perbandingan 9.5: 0,5. Hal ini bertujuan untuk mengetahui fase gerak
mana yang dapat memiahkan kandungan dalam ekstrak rimpang kunyit
dengan baik. Jarak pengembangnya sejauh 5,5 cm. Kandungan kurkumin
yang akan diidentifikasi bersifat polar sehingga fase diam yang digunakan
bersifat lebih polar dibandingkan dengan fase geraknya.

Pada proses KLT perlu dilakukn penjenuhan chamber dengan

tujuan agar chamber dapat stabil ketimbangan didalam chamber.
Penjenuhan ini dilakukan dengan kertas saring yang diberikan eluen yang
akan diguanakan pada KLT lalu ditunggu sehingga eluen naik pada kertas
atau nampak seperti kertas saring sudah terbasahai penuh oleh eluen.

Hasil pemeriksaan kurkumin pada sampel dan standar pada KLT

yang dielusi dengan fase gerak menunjukkan pemisahan yang baik. Pada
percobaan ini dilakukan peneotolan sampel pada dua titik dengan tujuan
untuk melihat kesamaan jarak spot yang diberikan oleh ekstrak kunyit dan
sebagai pengganti pada pembanding. Bercak diamati secara visible, pada
sampel ini tidak nampak adanya bercak kuning. Pada pengamatan
dibawah sinar UV 365 yang nampak pada plat klt adalah banyaknya spot
yang berbeda beda. Lalu diberikan/ penyemprotan H2SO4 pekat yang
berfungsi sebangai penmapak bercak universal maka dpat langsung
dilihat adanya perbedaan bercak bercak. Pada banyaknya bercak
tersebuat dipilih 3 bercak yang dianggap akan mendekati nilai RF pada
pembanding. Sehinggga di dapatka bercak yang ke 4 dimana nilai RF
yang di dapatkan sebesar 0,69 dan jarak rf pembanding pada kurkumin
0,62 bedasarakan farmakope Herbal Indonesia.

Bedasarkan bercak yang didapat pada percobaan 0,69 dengan

pebanding0,62 dari Farmakope Herbal Indonesia adanya perbedaan, Hal
ini bisa saja terjadi adanya kekeliruan yang terjadi baik dengan
penjenuhan camper yang belum sesuai, atau pada posisi penotolan
ekstarak yang terlalu samping pada plat KLT sehingga ektrak lebih cepat
terbawa oleh eluen.

Pada percobaan ini dilakukan digunakan fase diam yang bersifat

polar dan fase gerak yang bersifat non polar. Senyawa yang bersifat lebih
polar memiliki afinitas yang lebih besar terhadap fase diam sehingga
senyawa tersebut diperkirakan memilki nilai Rf yang lebih besar.
Bedasarkan penyomprotan dengan H2So4 didapatkan ada perumabahan
warna pada setiap bercak, sehinggga dapat disimpulkan adanya senyawa
lain yang yang terdpat dalam ekstrak.

IX. Kesimpulan
Bedasarkan penelitian yang dilakuakan, bercak yang di dapat 0.96
diatas pembanding kukurmin 0.62 sehingga dianggap terdapat kukurmin
didalam sampel esktrak rimpang kunyit yang digunakan.

X. Daftar pustaka
Gandjar, Ibnu Ghalib Dan Abdul Rahman. 2008. Kimia Farmasi
Analisis. Pustaka Pelajar: Yokyakarta.
Roy J, Gritter, James M. Bobbit, Arthur E.S .1991. Pengantar
Kromatografi. Penerbit ITB: Bandung
Sari, J, V. 2011. Penerapan Metode Kromatografi Lapisan Tipis (KLT)
untuk membedakan Curcuma domestica Val., Curcuma
xanthorrhiza Roxb., Curcuma zedoaria Rosc., Curcuma
mangga Val . & van Zijp., Curcuma aeroginosa Roxb. dalam
campuran.Fakultas Farmasi Universitas Airlangga Departemen
Farmakognosi Fitokimia. Surabaya.

XI. Dikusi
1. Jelaskan mekanisme atau proses yang terjadi pada metode:
a. KLT
b. Kromatografi Kertas
2. Apa yang dimaksud dengan :
a. Rf
b. RR
3. Suatu system KLT menggunakan fase diam silica gel G. Apa yang
dimaksud silica gel G? Apa bedanya dengan silika gel GF254dan
silica gel H? Jelaskan!
4. Jelaskan cara menghilangkan kepolaran campuran fase gerak
kloroform-metanol (9:1)!
5. Jika pada suatu system KLT, fase diam silica gel GF254, fase gerak
etil asetat-metanol (9:1), diperoleh harga Rf 0,8. Ganti posisi fase
gerak tersebut agar diperoleh Rf lebih kecil dari 0,8.
6. Apa yang dimaksud dengan BAW? Jelasakan proses pembuatan
BAW!
7.
a. Penampak bercak yang manakah yang akan saudara gunakan
pada pemantauan ekstrak? Penampak bercak spesifik atau
universal?
b. Mengapa pada kromatografi kertas tidak boleh menggunakan
penampak bercak asam sulfat 10% dalam methanol?
8. Jelaskan peran dan fungsi pemantauan ekstrak (disimpulkan dari
tugas isolasi senyawa kelompok masing-masing) !

Jawab:
1. Mekanisme atau proses yang terjadi pada metode:
a. KLT :memisahkan perbedaan kepolaran antara sampel dengan
pelarut yang digunakan. Teknik ini biasanya menggunakan fase
diam dan bentuk plat silica dan fase geraknya disesuaikan
dengan jenis sampel yang ingin dipisahkan larutannya atau
campuran larutan yang digunakan dinamakan eluen, semakin
dekat kepolaran antara sampel dengan eluen maka sampel
akan semakin terbawa oleh fase gerak tersebut.
b. Kromatografi Kertas : pelarut bergerak lambat pada kertas,
komponen bergerak pada laju berbeda dan campuran
dipisahkan berdasarkan pada perbedaan bercak warna
2. Yang dimaksud dengan :
a. Rf : perbandingan antara jarak senyawa dari titik awal dan jarak
tepi pelarut dari titik awal
 b. RR: kromatografi dan campuran yang menghasilkan bercak
tunggal.
3. Silaka gel G yaitu silica gel dengan pengikat pada umumnya
digunakan pengikat gypsum (CuSO4)
 Perbedaannya dengan silica gel GF254yaitu silica gel dengan
pengikat dan indicator adalah flouresensi jenis silica gel ini
biasanya berfluresensi kehijauan jika dilihat pada sinar UV,
panjang gelombang pendek
 Sedangkan silica gel H yanitu silica gel tanpa pengikat
(kromatografi kolom), lapisan ini dibandingkan dengan yang
mengandung CuSO4 yang lebih stabil

4. Fase gerak = Kloroform : methanol = 9:1

= 4,1 + 5,1

= 3,69 + 0,51
= 4,20 (semi polar)

5. 4,1 + 5,1 etilasetat 4,4 = 3,96 + 0,51

= 4,47→URf = 0,8

Rf lebih kecil dari 0,8

(missal Rf : 0,5)

,
Maka = ,
4,47 = 2,79
6. BAW adalah eluen yang terdiri dari n-butanol, asam asetat, dan air
dengan perbandingan (60:15:25).
Cara pembuatan :
Ukur semua volume sesuai dengan yang dibutuhkan

campurkan kedalam corong pisah

kemudian gas dikeluarkan

diamkan minimal 1x24 jam ( terjadi pemisahan 2 fase)

Gunakan bagian yang atas

7. .
a. Penampak bercak Universal, karena akan muncul banyak
senyawa berbeda dengan penampakan bercak spesifik
b. Karena H2SO41% akan menghidrolisis kertas dan air akan
dihilangkan oleh H2SO4 dengan karton akan terikat reaksi
8. Untuk memastikan keberadaan senyawa aktif simplisia yang
terekstraksi dengan metodeter tentu. Dalam hal ini ingin
mengetahui keberadaan senyawa pada simplisia herba pangan
yang belum terekstraksi.
XII. Lampiran