Anda di halaman 1dari 8

TEKNIK DALAM IMMUNOLOGY

Disusun untuk Memenuhi Tugas Mata Kuliah Immunology


yang dibimbing oleh Hendra Susanto, S.Pd, M.Kes., Ph. D. dan Wira Eka Putra, S.Si.,
M.Med.Sc.

Disusun Oleh:
Offering Kesehatan/ Biologi 2017
Delia Wahyu Pangesti 170342615579

UNIVERSITAS NEGERI MALANG


FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
JURUSAN BIOLOGI
Nopember 2019
1. Prinsip ELISA
ELISA (Enzyme Linked Imunnosorbent Assay) ELISA digunakan untuk
mengidentifikasi dan mengukur antibodi atau antigen. Prinsip ELISA adalah mengukur interaksi
antara antigen dengan antibodi menggunakan enzim sebagai indikatornya (Burgess, 1995).
Keberadaan antibodi menunjukkan adanya paparan antigen dalam tubuh inang yang diperiksa
(Tizard, 2004). prinsip dasar ELISA adalah reaksi antaraantigen (Ag) dengan antibody (Ab)
menjadi molekul Ag-Ab yang lebihbesar dan mudah mengendap. pada ELISA berdasarkan
perubahan warna yang terjadipada substrat pereaksi sesuai dengan label atau imunoprob
(immuno probe) konjugat Ab-enzim. Perubahan warna terjadi akibat hidrolisaenzimatik pada
reaksi antara konjugat Ab enzim dengan substratnya, Sehingga hasil ELISA lebih peka dan dapat
dikuantifikasi (Suryadi et al,2009).

berdasarkan ikatan antigen dengan ikatan antibody ELISA dibagi menjadi 4 tipe yaitu direct,
indirect, sandwich atau competitive.

1. Direct ELISA : antigen yang dilapisi ke plat multi-well dideteksi oleh antibodi yang secara
langsung terkonjugasi dengan enzim. Metode deteksi ini adalah pilihan yang baik jika tidak
ada kit ELISA yang tersedia secara komersial untuk protein target.
2. Indirect ELISA : antigen yang dilapisi pelat multi-well terdeteksi dalam dua tahap atau
lapisan. Pertama antibodi primer tanpa label, yang khusus untuk antigen, diterapkan.
Selanjutnya, antibodi sekunder berlabel enzim terikat pada antibodi pertama. Antibodi
sekunder biasanya merupakan antibodi anti-spesies dan seringkali poliklonal.
3. Sandwich ELISA : biasanya membutuhkan penggunaan pasangan antibodi yang cocok, di
mana masing-masing antibodi spesifik untuk bagian epitop antigen yang berbeda dan tidak
tumpang tindih. Antibodi pertama (dikenal sebagai antibodi tangkap) dilapisi ke well.
Solusi sampel kemudian ditambahkan ke well. Antibodi kedua (dikenal sebagai antibodi
pendeteksi) mengikuti langkah ini untuk mengukur konsentrasi sampel.
4. Competitive ELISA : dikenal JUGA sebagai ELISA inhibisi adalah proses reaksi
kompetitif antara antigen sampel dan antigen yang terikat pada well pelat mikrotiter dengan
antibodi primer. Pertama, antibodi primer diinkubasi dengan sampel antigen dan kompleks
antibodi-antigen yang dihasilkan ditambahkan ke sumur yang telah dilapisi dengan antigen
yang sama. Setelah masa inkubasi, setiap antibodi yang tidak terikat dibersihkan. Semakin
banyak antigen dalam sampel, semakin banyak antibodi primer akan terikat pada antigen
sampel. Oleh karena itu, akan ada sejumlah kecil antibodi primer yang tersedia untuk
mengikat antigen yang dilapisi pada sumur, menghasilkan pengurangan sinyal.

Kelebihan metode ELISA antara lain mampu menguji sampel dalam jumlah banyak dalam satu
variasi sampel, dan pengujian dilakukan secara bersamaan. Model ELISA adalah konfigurasi
sederhana untuk mengukur titer antibodi, dan merupakan uji serologik yang cepat, sederhana dan
relatif murah (Shetty et al., 2012).

2. Prinsip Immunohistochemistry

Imunohistokimia merupakan metode tambahan yang menggunakan reaksi antigen-antibodi


spesifik (Kim, Roh, & Park, 2016). Imunohistokimia adalah suatu metode untuk mendeteksi
keberadaan molekul atau berbagai macam komponen yang terdapat di dalam sel atau jaringan
dengan menggunakan prinsip reaksi antara antigen dengan antibodi. Metode imunohistokimia
berdasarkan pada penggunaan suatu antibodi yang spesifik yang dilabel dengan ikatan kimia pada
suatu zat yang dapat dilihat, tanpa label itu mempengaruhi kemampuan antibodi untuk membentuk
suatu kompleks dengan antigen yang bersangkutan.Pada tehnik ini dapat digolongkan menjadi dua
teknik yaitu tehnik imunofluoresensi dan imunoenzim. Prinsip tehnik imunoflouresensi adalah
pengenalan antigen dengan antibodi spesifik dan visualisasinya dengan label, contohnya
fluorescin, rhodamin atau enzim yang direaksikan dengan substrat kromogenik. Sedangkan tehnik
imunoenzim adalah suatu tehnik imunologi berdasarkan pada penggunaan : 1) ikatan enzim
dengan antobodi spesifik, 2) kompleks enzim-antienzim, 3) kompleks antibody-antigen dengan
pelabelan enzim (peroksidase), yang akan menghasilkan perubahan warna dengan substrat dan
kromogen spesifik. Keseluruhan tehnik ini digunakan secara histologi untuk visualisasi/pelebelan
specimen jaringan dan untuk mengetahui letak antigen.
3. Prinsip Western Blotting

Western blotting adalah metode dalam biologi molekuler / biokimia / imunogenetik untuk
mendeteksi protein dalam sampel tertentu dari jaringan homogenat atau ekstrak. Metode Ini
menggunakan elektroforesis gel untuk memisahkan protein terdenaturasi dengan massa. Protein
kemudian ditransfer keluar dari gel dan ke membran (biasanya nitroselulosa atau membran PVDF)
dan bergabung dengan antibodi khusus untuk protein. Antibodi sekunder dapat diwarnai dan
digambarkan dengan film. Film dengan ikatan protein dapat disimpan untuk waktu yang lama dan
dipindai setiap saat diperlukan untuk mengukur kadar protein. Sebagai hasilnya, peneliti dapat
memeriksa jumlah protein dalam sampel yang diberikan dan membandingkan kadar antara
beberapa kelompok. Teknik lain yang juga menggunakan antibodi memungkinkan deteksi protein
dalam jaringan dan sel (imunositokimia). (Yang, 2009)

Dengan menggunakan western blot, para peneliti dapat mengidentifikasi protein spesifik
dari campuran kompleks protein yang diekstraksi dari sel. Teknik ini menggunakan tiga elemen:
(1) pemisahan berdasarkan ukuran, (2) transfer ke pendukung yang solid, dan (3) menandai protein
target menggunakan antibodi primer dan sekunder yang tepat untuk memvisualisasikan.
(Mahmood, 2012)

Prosedur untuk Western blotting secara sederhana adalah sebagai berikut:


1. Transfer protein : Pada tahap pertama, protein yang diinginkan dipisahkan dari sampel
secara elektroforesis. Protein yang telah bermuatan negatif akan bergerak dari kutub
negatif menuju kutub positif. Laju pergerakan protein dalam membran poliakrilamid
tersebut berbeda-beda tergantung pada daya hambat antara protein dan membran.
Protein yang berukuran lebih besar akan memiliki daya hambat lebih besar sehingga
pergerakannya menjadi lebih lambat dibandingkan dengan pergerakan protein yang
berukuran lebih kecil. Setelah dialiri arus listrik selama beberapa waktu, masing-
masing protein akan terpisah berdasarkan ukuran molekulnya. (Koolman dan Roehm,
2005).
2. Pemblokiran membrane Tahap kedua dalam WB yaitu pemindahan protein dari gel
poliakrilamid menuju gel transfer. Tahap pemindahan tersebut menggunakan arus
listrik sebagai faktor pendorong transfer protein. Oleh karena itu, proses pemindahan
tersebut disebut juga elektrotransfer. (Bollag et al., 1996)
3. Deteksi : menggunakan antibodi yang dapat mengenali protein yang diinginkan
sekaligus memiliki label yang mudah dideteksi
4. Prinsip Fluorescence In Situ Hybridization (FISH)

Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) merupakan teknik sitogenik yang digunakan


untuk mendeteksi dan melokalisasi sekuens RNA dalam jaringan atau sel untuk mendefinisikan
pola spasial-temporal dari ekspresi gen (Volpi & Bridger, 2008). Dalam kasus FISH, targetnya
adalah DNA nuclear dari sel interphase atau kromosom metafase. FISH melibatkan pemeriksaan
DNA atau RNA yang dilampirkan pada molekul reporter fluoresen dengan urutan target spesifik
sampel DNA, yang dapat diamati di bawah mikroskop fluoresensi (Pierce, 2010).
Elemen dasar dalam FISH yaitu DNA probe dan sekuen target. Langkah pertama adalah
menyiapkan urutan pendek untai tunggal DNA yang cocok dengan sebagian gen yang kita cari
(probe). Dua strategi pelabelan digunakan: pelabelan indirect dan pelabelan direct. Dalam kasus
direct., probe diberi label dengan nukleotida yang mengandung fluorofor. Dalam pelabelan
indirect, adalah nukleotida yang dimodifikasi yang mengandung hapten di mana probe diberi label.
Kemudian, probe berlabel dan DNA target didenaturasi.
Analisis FISH perlu memperhatikan pilihan probe yang akan digunakan. Berbagai macam
probe dapat digunakan, dari whole genome sampai small cloned probe (1-10 kb). Ada tiga jenis
probe berbeda sesuai dengan aplikasi penggunannya yaitu, whole-chromosome painting probes;
repetitive sequence probes dan locus-specific probes (Bishop, 2010). whole-chromosome painting
probes adalah probe DNA yang kompleks berasal dari satu jenis kromosom yang microdissected
dan diberi label dengan degenerasi reaksi berantai oligonukleotida polimerase yang menghasilkan
'cat' yang menyoroti seluruh kromosom homogen (Bishop, 2010).

5. Prinsip Fluorescence-activated cell sorting (FACS)

Fluorescence-activated cell sorting merupakan teknik untuk memurnikan populasi sel


spesifik berdasarkan fenotip yang terdeteksi oleh flow cytometry. FACS biasanya mampu
memisahkan beberapa populasi sel secara bersamaan, yang meningkatkan efisiensi dan keragaman
percobaan. flowsitometer terdiri dari beberapa komponen utama: (1) aliran sel; (2) sistem
pengukuran, (3) detektor, (4) sistem amplifikasi, dan (5) komputer untuk analisis sinyal
(Bleichrodt & Read, 2019).
6. Prinsip Chromatin immunoprecipitation (ChIP)

Chromatin imunopresipitasi merupakan alat untuk karakterisasi modifikasi histone kovalen


dan interaksi DNA-histone in vivo. Prosedur ini termasuk ikatan silang DNA-histone dalam
kromatin, memotong DNA menjadi fragmen yang lebih kecil, imunopresipitasi dengan antibodi
terhadap modifikasi histone yang diminati, diikuti oleh identifikasi PCR dari DNA terkait urutan
(Saleh, 2008). Isolasi kromatin dan DNA bersama protein terikat oleh sonication.
Immunoprecipitate kompleks DNA-protein menggunakan antibodi spesifik. Membalikkan ikatan
silang kompleks DNA-protein untuk melepaskan DNA dan mencerna protein.
DAFTAR PUSTAKA
Bollag, D. M., S. J. Edelstein, and M. D. Rozycki. 1996. Protein Methods. John Willey and Sons,
Inc. New York.

Burgess, G.W. (1995). Teknologi ELISA dalam diagnosis dan penelitian. Edisi Indonesia.
Artama WT penerjemah. Yogyakarta: Gadjah Mada University Press.

Bishop, R. (2010). Applications of fluorescence in situ hybridization (FISH) in detecting genetic


aberrations of medical significance. Bioscience Horizons, 3(1), 85–95.
https://doi.org/10.1093/biohorizons/hzq009
Bleichrodt, R. J., & Read, N. D. (2019). Flow cytometry and FACS applied to filamentous fungi.
Fungal Biology Reviews, 33(1), 1–15. https://doi.org/10.1016/j.fbr.2018.06.001
Kim, S. W., Roh, J., & Park, C. S. (2016). Immunohistochemistry for pathologists: Protocols,
pitfalls, and tips. Journal of Pathology and Translational Medicine, 50(6), 411–418.
https://doi.org/10.4132/jptm.2016.08.08
Koolman J, Roehm KH. 2005. Color Atlas of Biochemistry: 2 nd edition, revised, enlarged. Ed
ke-2. Stuttgart: Thieme

Pierce. (2010). ELISA technical guide and protocols. Thermo Scientific, 65(815), 1–14.
https://doi.org/10.4028/www.scientific.net/AMM.597.421

Saleh, A., Alvarez-Venegas, R., & Avramova, Z. (2008). An efficient chromatin


immunoprecipitation (ChIP) protocol for studying histone modifications in Arabidopsis
plants. Nature Protocols, 3(6), 1018–1025. https://doi.org/10.1038/nprot.2008.66
Suryadi, Y., Manzila, Y dan Machmud, M.,2009, Jurnal PotensiPemanfaatan Perangkat
Diagnostik ELISA serta Variannyauntuk Deteksi Patogen Tanaman Vol. 5(1)

Tahrin Mahmood and Ping-Chang Yang 2012 Western Blot: Technique, Theory, and Trouble
ShootingNorth American Journal of Medical Sciences are provided here courtesy of Wolters
Kluwer -- Medknow Publications

Tizzard. An Introduction to Veterinary Immunology 7th Ed. Elsevier : Philadelphia. 2004.

Volpi, E. V., & Bridger, J. M. (2008). FISH glossary: An overview of the fluorescence in situ
hybridization technique. BioTechniques, 45(4), 385–409.
https://doi.org/10.2144/000112811

Yan Yang & Hongbao Ma 2009 Western Blotting and ELISA Techniques Brookdale University
Hospital and Medical Center, Brooklyn, New York 11212, USA,