KROMATOGRAFI

Iswandi S.Si., M. Farm. Apt.

Fakultas Farmasi USB
 KROMATOGRAFI

Termasuk salah satu teknik

pemisahan komponen
campuran zat
Untuk analisis kualitatif,
kuantitatif dan preparatif
Analit terdistribusi dalam fase
gerak (mobile phase) dan fase
diam (stationary phase)
 Fase gerak

Jika fase gerak berupa cairan 

disebut kromatografi cair
Contoh:
Kromatografi cair kinerja tinggi
(KCKT=HPLC)

Jika fase gerak berupa gas  disebut

kromatografi gas (GC)
 Fase diam

Berupa padatan atau cairan

Fase diam
 dapat berupa kertas  disebut Kromatografi Kertas
(Paper Chromatography)
 dapat ditebarkan pada lempeng (plate)disebut
kromatografi lapis tipis (Thin Layer Chromatography
=TLC)
 dapat diisikan/dilapiskan pada kolom  Contoh:
HPLC, GC, Kromatografi kolom)
Mobile stationary phase Chromatography

Liquid Liquid (Partition)  LC

Liquid Solid (Adsorption)  LC

Gas Liquid (Partition)  GLC

Gas Solid (Adsorption)  GSC
 Berdasarkan Mekanisme

 Kromatografi adsorpsi (adsorption

chromatography)
 Kromatografi Partisi (partition
chromatography)
 Kromatografi Pertukaran ion (ion exchange
Chromatography)
 Size Exclusion Chromatography (SEC)
 Kromatografi Permeasi Gel
 Kromatografi Filtrasi Gel
 CHROMATOGRAPHY

GAS SFC LIQ UID

GSC GLC Column Pla na r

NP RP IEC SEC TLC Pa p er

GPC GFC

GSC: Gas Solid Chromatography; GLC: Gas Liquid Chromatography

SFC: Supercritical Fluid Chromatography; NP: Normal Phase; RP: Reversed Phase;
IEC: Ion-Exchange; SEC: Size Exclusion Chromatography, GPC: Gel Permeation
Chromatography, GFC: Gel Filtration Chromatography
SEC
 Penemu Kromatografi

Pemisahan pigmen tumbuh-

tumbuhan

Chromatos: warna; graphos: menulis

Mikhail Semenovich Tswett
(1872 – 1919) “COLOR WRITING”
 100 Tahun Kromatografi

- 1906: M.S. Tswett 

kromatografi kolom adsorpsi
-1938: Izmailov & Shraiber 
Kromatografi Lapis Tipis
- Martin & Synge (1941) 
Kromatografi partisi
- James & Martin (1952) 
Kromatografi gas
- 1964: J.F.K Huber  HPLC
 Kromatograf

Sampel Preparasi sampel

Kromatogram
B
E
C
A
detektor
Respon

0 5 10 15 20
waktu (menit)
 Kromatogram
Respon Detektor 

Peak A Peak B

height

0 1 2 3 4 5 6 7
Waktu (menit) width

Area =
width x height
2
 Kromatogram

 Kromatogram Data :
 tR: waktu retensi
(parameter kualitatif)
tR-1  Luas peak = Peak area
Respon Detektor

 parameter kuantitatif
tR-2  Peak height (tinggi
peak)
parameter kuantitatif
 Width = lebar peak
waktu
 Waktu retensi netto (tR’)
(Corrected/Adjusted retention time)

tR’ = tR – tm
(tm = to adalah waktu retensi zat
yang tak tertahan oleh fase diam
 Pada Kromatografi Lapis Tipis

- - - - - - - - - - - -1- - - - - - - - - - - - - - - - - - -

Rf  informasi kualitatif - - - - - - - - - - - - - 2- - - - - - - - - - - - - -
Y
X1
Rf  X 3
Y X2
- - - -4- - - - - - - - - - - - - - - - - - -
X3
 Kromatografi

Bagaimana proses pemisahan

komponen sampel pada Kromatografi?

Tempat terjadinya pemisahan:

Kolom atau plate  The heart of the
chromatography
 ILUSTRASI

Jl. Slamet Riyadi Solo

SGM

Adem Ayam FINISH

START
 Wall open coated tubular column (Capillary GC)

injection
Panjang Kolom detector
Liquid Chromatography separation
 Pemisahan pada Kromatografi

Analit terdistribusi pada fase diam

dan fase gerak

K o n s e n tra s i d id a la m fa s e d ia m C
K   s
d K o n s e n tra s i d i d a la m fa s e g e ra k C
m
 Pemisahan pada Kromatografi

 Masing-masing komponen
sampel memiliki Kd tertentu
pada kondisi tertentu
 Jika Kd masing-masing
komponen berbeda 
komponen dapat dipisahkan
 Makin besar perbedaan harga
Kd, makin mudah terjadinya
pemisahan
 Jika Kd sama  tidak terjadi
pemisahan  kondisi perlu
dioptimasi
 Interpretasi Kromatogram

Faktor retensi atau faktor kapasitas

(capacity factor)
Faktor selektivitas= Selectivity Factor
(a)
Resolusi (RS)
Tinggi pelat dan pelat teoretis
Angka Simetri (Tailing factor)
 Faktor retensi atau faktor kapasitas (k’A)

menggambarkan kecepatan migrasi

solut (analit) pada kolom

K AVS
Keterangan:
k 'A 
VM
KA = konstante distribusi untuk spesi A
VS = Volume fase diam
VM = volume fase gerak
 Faktor retensi atau faktor kapasitas (k’A)

t t
k' 
A
R M

t M

Jika k’A < 1 elusi terlalu cepat.

Jika k’A > 10  elusi terlalu lambat
k’A sebaiknya antara 1.5 dan 4
 Faktor Selektivitas

Faktor selektivitas= Selectivity Factor

(a) = k’B /k’A
Merupakan ukuran pemisahan dua
komponen
Harga a > 1.
Dipengaruhi komposisi fase gerak,
jenis fase diam, temperatur, pH fase
gerak
k 'B (t R ) B  t M
a 
k 'A (t R ) A  t M
 Resolusi (RS)

menunjukkan
kemampuan
sebuah kolom
untuk
memisahkan dua
analit
2[( tR ) B  (tR ) A ]
RS 
WA  WB
 Angka Simetri

Angka Simetri = b/a

a b
 Tinggi pelat dan Pelat teoretis

Pelat teoretis = Theoretical Plates (N)

Tinggi pelat = Plate Height (H) = HETP
(High equivalent to a Theoretical
Plate)
 Untuk menunjukkan efisiensi kolom

N = L/H
L = panjang kolom
 Efisiensi Pemisahan

Pemisahan (kolom) semakin efisien, jika:

1. N semakin tinggi atau H semakin minimum
2. Ukuran partikel packing semakin kecil  N
semakin tinggi
3. Temperatur semakin tinggi  k’ semakin tinggi
Pengaruh ukuran partikel
Menghitung N dari kromatogram

2
 tR 
N  16 
W 
2
 tR 
N  5.54 

 W0.5 
 Hukum Van Deemter

 H = A + B/m + C. m

 A= suku difusi Eddy; B=suku

difusi longitudinal; C= suku
perpindahan massa;
m=kecepatan fase gerak
Kromatografi cair
 Perlu diatur Kecepatan alir fase
gerak yang menghasilkan HETP
minimum dan waktu analisis
relatif cepat

Kromatografi gas
Kurva Van Deemter (GC)
 Hubungan Resolusi dengan N

1. Dipengaruhi ukuran partikel, Panjang kolom, kondisi

kolom
2. Faktor selektivitas  tergantung analit dan fase diam
3. Faktor kapasitas  kondisi pemisahan
 Memperbaiki Resolusi

Optimasi kondisi pemisahan

Pemilihan kolom (ukuran partikel,
diameter internal, jenis fase diam)
komposisi fase gerak
temperatur
 Analisis Kualitatif

Diperlukan zat pembanding autentik

Atas dasar waktu retensi atau harga
Rf (TLC)
Waktu retensi atau Rf bersifat
karakteristik, bukan spesifik
 Analisis Kualitatif

 Waktu retensi sampel = zat standar 

bukan berarti sampel 100% identik dengan
pembanding
 Jika tR atau Rf tidak sama  Sampel 100%
tidak identik.
 Untuk konfirmasi  lakukan teknik “spiking”
, penggunaan fase gerak yang berbeda;
pengukuran spektrum
 Analisis Kuantitatif

Metode Normalisasi
Metode Standar Eksternal
Metode Standar Internal
Metode Adisi Standar
 Kuantitasi secara Standar
Eksternal
Paling sering digunakan untuk analisis
kuantitatif
Melibatkan kurva kalibrasi (peak area vs
konsentrasi)
Kadar analit dalam sampel tidak boleh
diperoleh secara ekstrapolasi
 Kurva kalibrasi: Standar Eksternal
Peak area

Y = bx + a

Konsentrasi
Kuantitasi dengan Standar
Internal

 Sampel ditambah standar

Untuk mengeliminasi kesalahan
injeksi (khususnya pada GC sistem
injeksi manual)
 Kelemahan: relatif sulit mendapatkan
standar internal
Peak area
Kurva kalibrasi: Standar Eksternal
St/IS

Y = bx + a

Konsentrasi